專(zhuān)利名稱：一種通過(guò)檢測(cè)血清中骨鈣素含量來(lái)預(yù)測(cè)優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員身高的分子生物學(xué)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種預(yù)測(cè)優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員身高的分子生物學(xué)方法。適合于優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員在蛋白水平上的早期選材，屬于體育科學(xué)與生命科學(xué)交叉的學(xué)科領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
運(yùn)動(dòng)員的成長(zhǎng)過(guò)程中伴隨著身體形態(tài)的變化，對(duì)運(yùn)動(dòng)員身體形態(tài)尤其是身高的研究是體育科學(xué)研究中基礎(chǔ)而又重要的一個(gè)環(huán)節(jié)。我國(guó)優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員身高特征的研究結(jié)果，將有助于完善、系統(tǒng)的科學(xué)研究體系的建立，同時(shí)對(duì)構(gòu)建科學(xué)、系統(tǒng)的我國(guó)優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員的高模型起到積極作用，并為今后的身體機(jī)能、技戰(zhàn)術(shù)、心理以及形成系統(tǒng)的研究體系奠定一定的理論基礎(chǔ)。

自1998年長(zhǎng)野冬季奧運(yùn)會(huì)短道速滑由表演項(xiàng)目正式獲準(zhǔn)成為比賽項(xiàng)目以來(lái)，該項(xiàng)目的6枚金牌倍受冰雪強(qiáng)國(guó)矚目。短道運(yùn)動(dòng)員的選材和育材也理所當(dāng)然的受到關(guān)注。身高作為身體形態(tài)的一個(gè)主要方面，有哪些特點(diǎn)，頂尖選手和非頂尖選手之間的身高是否有差別，根據(jù)項(xiàng)目的特點(diǎn)，究竟哪種身高更為適宜，此前曾有過(guò)專(zhuān)門(mén)研究，但隨著時(shí)間的推移，該項(xiàng)目水平的提高，運(yùn)動(dòng)員的身高又有哪些新的特點(diǎn)，需要我們進(jìn)一步做出更科學(xué)的研究和推斷，探討當(dāng)今世界優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員的身高特征會(huì)對(duì)我國(guó)的該項(xiàng)目的選材和育材方面有一定的參考價(jià)值。由于我國(guó)對(duì)優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員最適身高的研究起步比較晚，而且冰雪運(yùn)動(dòng)員的育材和選材大部分都是靠經(jīng)驗(yàn)，沒(méi)有建立在生命科學(xué)的基礎(chǔ)上。近些年來(lái)，隨著體育科學(xué)和生命科學(xué)的飛速發(fā)展及兩者在理論、方法、技術(shù)和手段上的相互交叉和滲透，強(qiáng)有力地推動(dòng)者冰雪運(yùn)動(dòng)員早期選材向著科學(xué)化和系統(tǒng)化的方向轉(zhuǎn)型和發(fā)展。因此，有必要建立一套完善的、科學(xué)的、系統(tǒng)的分子生物學(xué)方法，從分子水平上有效地預(yù)測(cè)優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員的最適身高。骨 丐素(Osteocalcin)又名骨谷氛酸蛋白(Bonegla protein, BGP), BGP 主要由骨和牙齒中的成骨細(xì)胞合成并分泌，是體內(nèi)最豐富的非膠原骨基質(zhì)蛋白，經(jīng)肝臟和腎水解，最后由腎排除。1975年，科學(xué)家們分別從雞和牛骨骼中首先提取到BGP后，人們?cè)谄渌棺祫?dòng)物上如猴、犬、馬、硬骨魚(yú)等骨骼中也發(fā)現(xiàn)了 BGP。各種屬BGP具有很高的保守性，由49 51個(gè)氨基酸組成,在21、24和27位有3個(gè)Y -羧基谷氨酸(Y -carboxyglutami cacid, Gla)，分子量小，約6ku，具有3個(gè)Gla。BGP具有特殊的翻譯后修飾，其基因首先翻譯合成骨鈣素原蛋白，去除信號(hào)肽后，骨鈣素原蛋白在維生素K羧基化酶作用下，3個(gè)Y-谷氨酸(glutamic acid, Glu)羧基化為Y _羧基谷氨酸，羧基化后的BGP與輕基磷灰(hydroxyapatite,HA)具有很強(qiáng)的吸附作用，既可沉積于骨骼，又可分泌入血液。在骨吸收發(fā)生時(shí)，分泌的酸性物質(zhì)又使羧基化的骨鈣素脫羧釋放入血液。因此，血液中含有多種骨鈣素，包括完全羧基化骨韓素(total carboxylated BGP),未羧基化骨韓素或脫羧后骨I丐素(uncarboxylated BGP),降解的骨 I丐素片段(small fragment osteocalcin)。BGP 表達(dá)具有組織特異性，最初研究表明，BGP的mRNA僅見(jiàn)于骨組織，由成熟的骨細(xì)胞合成并分泌，后來(lái)研究表明在骨髓巨核細(xì)胞和外周血小板也可表達(dá)BGP。BGP的表達(dá)還具有發(fā)育階段特異性，成骨細(xì)胞的成熟過(guò)程分為三個(gè)階段，即成骨細(xì)胞增殖期、細(xì)胞外基質(zhì)成熟期及基質(zhì)礦化期。只有在基質(zhì)礦化期開(kāi)始后，BGP基因才被誘導(dǎo)表達(dá)。研究認(rèn)為，BGP的主要功能是維持骨的正常礦化速率，抑制異常羥基磷灰石的形成，抑制生長(zhǎng)軟骨礦化的速度，BGP與骨礦化同時(shí)出現(xiàn)，并隨骨骼生長(zhǎng)、羥磷灰石沉積而增加。體外研究顯示:BGP為成熟成骨細(xì)胞的標(biāo)志物，BGP的產(chǎn)生隨著礦化和成骨細(xì)胞分化而增加。近期研究還提示:BGP能趨化、激活破骨細(xì)胞，BGP的羧化末端對(duì)破骨細(xì)胞的前體有化學(xué)誘導(dǎo)作用，可調(diào)節(jié)骨吸收。BGP基因敲除的小鼠表現(xiàn)為骨形成和骨量增加，而骨吸收和骨礦化并未受到影響，提示BGP可能抑制成骨細(xì)胞活性，成骨細(xì)胞上可能表達(dá)有BGP受體，現(xiàn)已證實(shí)人成骨細(xì)胞上確實(shí)可表達(dá)BGP受體，并發(fā)現(xiàn)它屬于G-蛋白偶聯(lián)受體超家族成員，與抑制性G-蛋白偶聯(lián)，BGP通過(guò)與成骨性譜系細(xì)胞的BGP素受體結(jié)合而抑制成骨細(xì)胞的活性。BGP由成骨細(xì)胞合成和分泌，其大部分沉積在骨基質(zhì)中，約20%進(jìn)入血液循環(huán)，成骨細(xì)胞活性以及成骨細(xì)胞合成和分泌BGP的能力，直接影響血清BGP水平。血清骨鈣素(S-BGP)是評(píng)估骨轉(zhuǎn)換率及骨形成的特異性指標(biāo)，其表達(dá)水平間接影響著冰雪運(yùn)動(dòng)員的身高。因此，可以通過(guò)檢測(cè)優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員血清中BGP的含量來(lái)預(yù)測(cè)優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員的最適身高，為冰雪運(yùn)動(dòng)員選材提供一個(gè)最適的分子生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。目前已建立的BGP測(cè)定方法主要有:放射免疫法、化學(xué)發(fā)光免疫分析法、酶聯(lián)免疫吸附分析法(Enzyme linked immunosorbent analysis,ELISA)、親和素-生物素酶免疫分析法和酶免疫熒光法等。其中以放射免疫法應(yīng)用最普遍，該方法靈敏度與特異性均較理想，批內(nèi)、批間變異小，回收率高，檢測(cè)線性范圍寬?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析法、酶聯(lián)免疫吸附分析法、親和素-生物素酶免疫分析法等方法操作簡(jiǎn)單、快速、微量、無(wú)放射性同位素污染與標(biāo)記物蛻變等優(yōu)點(diǎn)，缺點(diǎn)是特異性較差，溶血或脂血對(duì)測(cè)定有干擾，定量不夠準(zhǔn)確。酶免疫熒光法(Pharmacia CAP系統(tǒng))測(cè)定靈敏度為0.5μ g/L，特異性100%，適合臨床推廣。采用Elecsys2010測(cè)定血清BGP、N-MID片段，是目前最先進(jìn)的免疫分析法，它是由電化學(xué)和免疫學(xué)(雙抗體夾心法)測(cè)定相結(jié)合的產(chǎn)物。其產(chǎn)生的光子通過(guò)檢測(cè)儀器測(cè)定光信號(hào)強(qiáng)度，光強(qiáng)度與待測(cè)物質(zhì)濃度呈線性關(guān)系，據(jù)此可測(cè)出BGP的含量。其優(yōu)點(diǎn)為特異性強(qiáng)，靈敏度高，檢測(cè)線性可達(dá)7個(gè)數(shù)量級(jí)；重復(fù)性好`；無(wú)放射性核素的污染；操作簡(jiǎn)單、快速。骨是骨干和骨骺的積聚物，骺軟骨區(qū)形成成骨細(xì)胞，然后由軟骨變成骨頭，身體因此變高。骨鈣素(osteocalcin)是成骨細(xì)胞的特異性表面標(biāo)記物，通過(guò)ELISA技術(shù)對(duì)血液中骨鈣素進(jìn)行檢測(cè)，從而推斷出軟骨組織分泌骨鈣素水平的差異情況，從分子生物學(xué)水平上預(yù)測(cè)基因表達(dá)與身高的聯(lián)系。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種在分子生物學(xué)水平上預(yù)測(cè)優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員身高的方法。本發(fā)明從分子生物學(xué)水平上預(yù)測(cè)了優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員的最適身高，通過(guò)ELISA技術(shù)檢測(cè)血清中骨鈣素含量比較和預(yù)測(cè)與身高的聯(lián)系。方法簡(jiǎn)單，易操作。
具體實(shí)施例方式
下面以優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員血清中的分子標(biāo)記骨鈣素為例，通過(guò)檢測(cè)其相對(duì)水平來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的具體實(shí)施。實(shí)施例:檢測(cè)優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員血清中的分子標(biāo)記骨鈣素的水平。選取5名優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員，每名靜脈取血5ml，于抗凝管中備用(抗凝管編號(hào)為
01-05，設(shè)為5個(gè)重復(fù))，設(shè)為實(shí)驗(yàn)組；選取5名普通人進(jìn)行靜脈取血，每名5ml，于抗凝管中備用(抗凝管編號(hào)為06-10，設(shè)為5個(gè)重復(fù))，設(shè)為對(duì)照組。ELISA定量檢測(cè)血清中骨鈣素，具體方法如下:I)上述骨鈣素蛋白用PBS配成100μ g/ml的溶液，按100 μ I/每孔加入96孔酶標(biāo)板，4°C過(guò)夜吸附；2)次日將過(guò)夜包被的酶標(biāo)板中未吸附的蛋白溶液倒掉，以PBS洗3次。加入3%(質(zhì)量百分比)BSA (用PBS配制不含Tween20)封閉，100 μ I/每孔，37°C，1.5h ；3)用PBS徹底洗2 )中的沉淀4次后加入實(shí)驗(yàn)組血清或?qū)φ战M血清(用PBS按體積比為 I: 100,1: 500,1: 2500,1: 12500 或 I: 62500 稀釋)，100 μ I/每孔，37°C，
1.5h ；4)用PBS洗3)中的沉淀4次，加二抗(兔抗人IgG用PBS按體積比為1: 10000稀釋)，100 μ I/每孔，37°C，lh ；5)用PBS洗4)中的沉淀4次，加AP顯色液P-NPP (2mg/ml)，80 μ I/每孔，避光反應(yīng)，加等體積0.2Μ NaOH終止反應(yīng)；6)取100 μ 15)中終止反應(yīng)后的溶液100μ 1，用酶標(biāo)儀測(cè)定405nm下的OD值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出血清中BGP的含量。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的測(cè)定結(jié)果比較其差異，并取實(shí)驗(yàn)組結(jié)果的平均值作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)組測(cè)定結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組血清中的BGP濃度為1.50±0.76nmol/L相對(duì)對(duì)照組血清中 BGP 濃度 1.48±0.58nmol/L 較高。
權(quán)利要求
1.一種預(yù)測(cè)優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員的身高的分子生物學(xué)方法。
2.依據(jù)權(quán)利要求1所述的分子生物學(xué)方法，其特征在于通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)檢測(cè)優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員血清中骨鈣素的表達(dá)量來(lái)預(yù)測(cè)優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員的身高。
3.依據(jù)權(quán)利要求2所述，通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)檢測(cè)優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員血清中骨鈣素濃度為1.50±0.76nmol /L相對(duì)普通人血清中BGP濃度1.48±0.58nmol/L較高。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種預(yù)測(cè)優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員身高的分子生物學(xué)方法。本發(fā)明通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)檢測(cè)并比較了優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員和普通人血液中骨鈣素的表達(dá)量，骨鈣素通過(guò)對(duì)成骨細(xì)胞的作用進(jìn)而影響人的身高，因此，骨鈣素的表達(dá)水平可以間接地預(yù)測(cè)優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員的最適身高。結(jié)果顯示，通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)檢測(cè)優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員血清中骨鈣素濃度為1.50±0.76nmol/L相對(duì)普通人血清中骨鈣素濃度1.48±0.58nmol/L較高。說(shuō)明血清中相對(duì)較高的骨鈣素含量可以作為衡量?jī)?yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員的最適身高。本發(fā)明為建立該項(xiàng)目運(yùn)動(dòng)員潛能的早期預(yù)測(cè)、評(píng)定、選材和育材的科學(xué)體系打下堅(jiān)實(shí)的理論和技術(shù)基礎(chǔ)，提升選材的成功率，突破一次性選材的理論和技術(shù)難關(guān)。
文檔編號(hào)G01N33/68GK103235138SQ201310113488
公開(kāi)日2013年8月7日 申請(qǐng)日期2013年4月3日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月3日
發(fā)明者趙玉華, 朱志強(qiáng), 劉冬, 崔鵬, 金紅, 關(guān)偉軍 申請(qǐng)人:哈爾濱體育學(xué)院