專利名稱：一種運(yùn)用圓二光譜檢測l-半胱氨酸濃度的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種運(yùn)用圓二光譜檢測L-半胱氨酸濃度的方法，涉及一種利用金納米粒子自組裝技術(shù)和等離子手性技術(shù)結(jié)合用于測定L-半胱氨酸濃度的方法，屬于分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
目前常用的半胱氨酸檢測方法，都是基于物理或化學(xué)的方法，如電感藕合等離子發(fā)射光譜、流動注射原子吸收分光光度計、電感藕合等離子體質(zhì)譜、極譜法和伏安電極、原子熒光光譜分析、原子爐吸收光譜。上述主要的儀器檢測法的最大的優(yōu)點(diǎn)就是準(zhǔn)確，但這些傳統(tǒng)方法均需要復(fù)雜的前處理，分析時間長，勞動強(qiáng)度大且成本昂貴，只能在實驗室內(nèi)由專業(yè)人員進(jìn)行具體操作，需要專業(yè)的技術(shù)人員進(jìn)行大量的樣品預(yù)處理等缺陷，難以應(yīng)用于現(xiàn)場檢測。由于這些明顯的缺點(diǎn)，所以檢測的樣品數(shù)一般達(dá)不到要求的最佳抽檢量。納米顆粒(nanoparticles,Nas) —般是指尺寸至少有一維在1-100 nm間的粒子。納米尺度是處在原子簇和宏觀物體交界的過渡區(qū)域，處于這個區(qū)域的材料具有一些獨(dú)特性質(zhì)，如小尺寸效應(yīng)、表面、界面效應(yīng)和量子尺寸效應(yīng)等。空氣中納米顆粒雖然濃度很低，但具有很高的顆粒物數(shù)目。將宏觀物體細(xì)分成納米顆粒后，它的光學(xué)、熱學(xué)、電學(xué)、磁學(xué)、力學(xué)以及化學(xué)性質(zhì)和大體積固體相比將會顯著不同。納米材料的小尺寸、化學(xué)成分、表面結(jié)構(gòu)、溶解性、外形和聚集情況決定著它們特殊的物理化學(xué)性質(zhì)，這些性質(zhì)使得納米材料在將來有著廣泛的用途。隨著納米科技的發(fā)展，納米粒子組裝體系的研究變得日益活躍。納米粒子的二維和三維有序組裝結(jié)構(gòu)也因其重要的物理和化學(xué)性質(zhì)近年來受到人們的廣泛重視，它們在許多領(lǐng)域如:傳感器、催化劑、磁化材料、表面增強(qiáng)拉曼和光學(xué)材料等有著潛在的應(yīng)用。金納米材料自組裝體，可通過表面等離子共振介導(dǎo)及手性分子誘導(dǎo)等機(jī)理產(chǎn)生圓二光譜(⑶)信號。但通過這種組裝系統(tǒng)結(jié)合L-半胱氨酸經(jīng)典吸附原理用于構(gòu)建L-半胱氨酸的檢測方法尚屬空白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種運(yùn)用圓二光譜檢測L-半胱氨酸濃度的方法，運(yùn)用圓二光譜高靈敏檢測L-半胱氨酸。本發(fā)明的技術(shù)方案:一種運(yùn)用圓二光譜檢測L-半胱氨酸濃度的方法，用合成的金納米粒子與待檢測目標(biāo)物L(fēng)-半胱氨酸反應(yīng)，L-半胱氨酸的加入，使其通過Au-S鍵修飾于金納米粒子表面，利用L-半胱氨酸的靜電相互作用在液體的環(huán)境下金納米粒子與L-半胱氨酸反應(yīng)形成金納米粒子二聚體，金納米粒子二聚體的形成可以導(dǎo)致等離子手性的產(chǎn)生，金納米粒子二聚體在可見光區(qū)產(chǎn)生圓二光譜⑶信號。通過圓二光譜測定液體環(huán)境中的⑶信號強(qiáng)度來測定L-半胱氨酸含量。工藝步驟為:
(I)25nm金納米粒子的合成25nm金納米粒子用檸檬酸三納還原法合成；潔凈的三口燒瓶中加入47.5mL超純水，力口入0.8mL質(zhì)量濃度0.4%氯金酸溶液，攪拌并加熱至沸騰，7-8min后加入ImL質(zhì)量濃度1%檸檬酸三鈉溶液，溶液從無色變?yōu)榧t色后，停止加熱，繼續(xù)攪拌30min ；
(2)金納米粒子組裝
取1000 μ L步驟(I)制備出來的25nm金納米粒子,8000 rpm離心10 min,重懸至相同體積的0.01 M的pH6.0磷酸鹽緩沖液中，加入100 μ L 50nM L-半胱氨酸溶液反應(yīng)30 min,組裝形成金納米粒子二聚體；
PH緩沖液優(yōu)化
對步驟(2)體系所用緩沖液體系進(jìn)行優(yōu)化。為了提高該法的靈敏度和穩(wěn)定性，故需要對反應(yīng)體系PH進(jìn)行選擇。最適宜的pH是在加標(biāo)準(zhǔn)溶液反應(yīng)以后，圓二光譜測定后CD信號強(qiáng)度最大。具體的步驟是:
①分別向離心管中加入IOOyL金納米粒子，各離心管分別再加入IOyL0.0lM不同pH:pH 5.0, pH 5.5, pH 6.0, pH 6.5, pH 7.0, pH 8.5的磷酸鹽緩沖液后，混勻，室溫反應(yīng)30min ；
②反應(yīng)結(jié)束，用圓二光譜測定該反應(yīng)液在525nm處的CD信號強(qiáng)度，重復(fù)兩次；結(jié)果顯示PH6.0反應(yīng)體系中圓二光譜測定的CD信號強(qiáng)度最大。(3)金納米粒子二聚體結(jié)構(gòu)的表征
步驟(I)制備的25 nm金納米粒子與步驟(2)制備的金納米粒子二聚體各取10 μ L滴于銅網(wǎng)上進(jìn)行電鏡表征；
步驟(I)制備的25 nm金納米粒子與步驟(2)制備的金納米粒子二聚體各取IOOOyL進(jìn)行動態(tài)光散射表征；
(4)圓二光譜檢測，繪制CD信號強(qiáng)度 L-半胱氨酸濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線取1000 μ L步驟(I)制備出來的25nm金納米粒子,8000 rpm離心10 min,重懸至相同體積的0.0lM的pH6.0磷酸鹽緩沖液中；在該相同體系中分別加入100μ L不同濃度OnM、0.05ηΜ、0.1ηΜ、0.2nM、0.5nM、1ηΜ、2ηΜ、5ηΜ的L-半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液反應(yīng)30 min，加入到微量比色皿中，測CD信號，繪制525nm處CD信號強(qiáng)度與L-半胱氨酸濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。對照組設(shè)置:分別以L-酪氨酸，L-甘氨酸，L-丙氨酸，L-蘇氨酸，D-蘇氨酸，L-谷氨酸，D-谷氨酸代替L-半胱氨酸，其它操作同上。結(jié)果如圖5所示，這些氨基酸不影響L-半胱氨酸的靈敏度和穩(wěn)定性。本發(fā)明的有益效果:與傳統(tǒng)的儀器方法相比，本發(fā)明在液體的環(huán)境下利用AuNPs和L-半胱氨酸反應(yīng)形成金納米粒子二聚體，二元組裝體的形成可以放大L-半胱氨酸的手性，金納米粒子二聚體在可見光區(qū)產(chǎn)生⑶信號。通過圓二光譜測定液體環(huán)境中的⑶信號強(qiáng)度來測定L-半胱氨酸含量。本發(fā)明只在液體環(huán)境中反應(yīng)，不需要清洗的步驟，只需要一步反應(yīng)，簡化了反應(yīng)的條件，提高了檢測的靈敏度。


圖1典型的金 納米粒子二聚體電鏡圖。圖225nm金納米粒子與金納米粒子二聚體的動態(tài)光散射表征圖。圖3圓二光譜檢測不同濃度L-半胱氨酸、在不同檢測波長下的CD信號曲線圖。
圖4在525nm處⑶信號強(qiáng)度與L-半胱氨酸濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。圖5不同氨基酸在525nm處⑶信號強(qiáng)度特異性圖。
具體實施例方式實施例1
(1)25nm金納米粒子的合成
25nm金納米粒子采用檸檬酸三納一步法還原氯金酸法合成:潔凈的三口燒瓶中加入47.5mL超純水，加入0.8mL 0.4%氯金酸溶液，攪拌并加熱至沸騰，7_8min后加入ImL 1%檸檬酸三鈉溶液，溶液從無色變?yōu)榧t色后，停止加熱，繼續(xù)攪拌30min ;透射電鏡顯示平均粒徑為25nm ；
(2)金納米粒子組裝
取1000 μ L步驟(I)制備出來的25nm金納米粒子,8000 rpm離心IOmin,重懸至相同體積的0.01 M的pH6.0磷酸鹽緩沖液中，加入100 μ L 50nM L-半胱氨酸溶液反應(yīng)30min，組裝形成金納米粒子二聚體；
緩沖液PH的選擇
為了提高該法的靈敏度和穩(wěn)定性，故需要對反應(yīng)體系PH進(jìn)行選擇。最適宜的pH是在加標(biāo)準(zhǔn)溶液反應(yīng)以后，圓二光譜測定后CD信號強(qiáng)度最大。具體的步驟是:
①分別向離心管中加入IOOyL金納米粒子，各離心管分別再加入IOyL0.01M不同pH:pH 5.0, pH 5.5，pH 6.0, pH 6.5，pH 7.0, pH 8.5的磷酸鹽緩沖液后，混勻，室溫反應(yīng)30min ；
②反應(yīng)結(jié)束，用圓二光譜測定該反應(yīng)液在525nm處的CD信號強(qiáng)度，重復(fù)兩次。結(jié)果顯示pH6.0反應(yīng)體系中圓二光譜測定的CD信號強(qiáng)度最大。(3)金納米粒子二聚體結(jié)構(gòu)的表征
步驟(I)制備的25 nm金納米粒子和步驟(2)制備的金納米粒子二聚體各取10 μ L滴于銅網(wǎng)上進(jìn)行電鏡表征，如圖1所示。步驟(I)制備的25 nm金納米粒子和步驟(2)制備的金納米粒子二聚體各取1000 μ L進(jìn)行動態(tài)光散射表征，如圖2所示。(4)圓二光譜檢測，繪制⑶信號強(qiáng)度 L-半胱氨酸濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線
取1000 μ L步驟(I)制備出來的25nm金納米粒子,8000 rpm離心IOmin,重懸至相同體積的0.01 M的pH 6.0磷酸鹽緩沖液中，在該相同體系中分別加入100μ L不同濃度OnM、
0.05ηΜ、0.1ηΜ、0.2nM、0.5nM、1ηΜ、2ηΜ、5ηΜ的L-半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液反應(yīng)30 min，加入到微量比色皿中，測CD信號，繪制525nm處CD信號強(qiáng)度與L-半胱氨酸濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖3、圖4所示。對照組設(shè)置:L_酪氨酸，L-甘氨酸，L-丙氨酸，L-蘇氨酸，D-蘇氨酸，L-谷氨酸，D-谷氨酸代替L-半胱氨酸，其它操作同上。結(jié)果如圖5所示，這些氨基酸不影響L-半胱氨酸的靈敏度和穩(wěn)定性。
權(quán)利要求
1.一種運(yùn)用圓二光譜檢測L-半胱氨酸濃度的方法，其特征在于用合成的金納米粒子與待檢測目標(biāo)物L(fēng)-半胱氨酸反應(yīng)，L-半胱氨酸通過Au-S鍵修飾于金納米粒子表面，利用L-半胱氨酸的靜電相互作用在液體的環(huán)境下金納米粒子與L-半胱氨酸反應(yīng)形成金納米粒子二聚體，金納米粒子二聚體的形成導(dǎo)致等離子手性的產(chǎn)生，金納米粒子二聚體在可見光區(qū)產(chǎn)生圓二光譜CD信號，通過圓二光譜測定液體環(huán)境中的CD信號強(qiáng)度來測定L-半胱氨酸含量; 工藝步驟為: (1)25nm金納米粒子的合成 25nm金納米粒子用檸檬酸三納還原法合成:潔凈的三口燒瓶中加入47.5mL超純水，力口入0.8mL質(zhì)量濃度0.4%氯金酸溶液，攪拌并加熱至沸騰，7-8min后加入ImL質(zhì)量濃度1%檸檬酸三鈉溶液，溶液從無色變?yōu)榧t色后，停止加熱，繼續(xù)攪拌30min ； (2)金納米粒子組裝 取1000 μ L步驟(I)制備出來的25nm金納米粒子,8000 rpm離心IOmin,重懸至相同體積的0.01 M的pH6.0磷酸鹽緩沖液中，加入100 μ L 50nM L-半胱氨酸溶液反應(yīng)30 min,組裝形成金納米粒子二聚體； (3)金納米粒子二聚體結(jié)構(gòu)的表征 步驟(I)制備的25 nm金納米粒子與步驟(2)制備的金納米粒子二聚體各取10 μ L滴于銅網(wǎng)上進(jìn)行電鏡表征； 步驟(I)制備的25 nm金納米粒子與步驟(2)制備的金納米粒子二聚體各取IOOOyL進(jìn)行動態(tài)光散射表征； (4)圓二光譜檢測，繪制CD信號強(qiáng)度 L-半胱氨酸濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線 取1000yL步驟(I)制備出來的25nm金納米粒子,8000 rpm離心10 min,重懸至相同體積的0.0lM的pH6.0磷酸鹽緩沖液中；在該相同體系中分別加入100μ L不同濃度OnM、.0.05ηΜ、0.1ηΜ、0.2nM、0.5nM、1ηΜ、2ηΜ、5ηΜ的L-半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液反應(yīng)30 min，加入到微量比色皿中，測CD信號，繪制525nm處CD信號強(qiáng)度與L-半胱氨酸濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。
全文摘要
一種運(yùn)用圓二光譜檢測L-半胱氨酸濃度的方法，屬于分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明通過將L-半胱氨酸與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生自組裝形成金納米粒子二聚體，再將反應(yīng)物置于圓二光譜分析儀下，檢測主波長525nm處信號強(qiáng)度，從而測算出L-半胱氨酸的濃度大小。與傳統(tǒng)的儀器方法相比，本發(fā)明在液體的環(huán)境下利用AuNPs和L-半胱氨酸反應(yīng)形成金納米粒子二聚體，二元組裝體的形成可以放大L-半胱氨酸的手性，金納米粒子二聚體在可見光區(qū)產(chǎn)生CD信號。通過圓二光譜測定液體環(huán)境中的CD信號強(qiáng)度來測定L-半胱氨酸含量。本發(fā)明只在液體環(huán)境中反應(yīng)，不需要清洗的步驟，只需要一步反應(yīng)，簡化了反應(yīng)的條件，提高了檢測的靈敏度。
文檔編號G01N21/19GK103163076SQ20131006059
公開日2013年6月19日 申請日期2013年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月26日
發(fā)明者胥傳來, 王利兵, 許宙, 徐麗廣, 馬偉, 李灼坤 申請人:江南大學(xué)