專利名稱：非放射性判別膜蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運功能的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及膜蛋白質(zhì)功能判別技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一類非放射性判別膜蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運功能的方法。
背景技術(shù)：
膜蛋白結(jié)構(gòu)與功能的研究作為研究藥物靶向性的基礎(chǔ)對治療疾病的發(fā)展是必不可少的。目前研究膜蛋白功能的普遍方法主要是以結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的功能性研究，并且生物信息學技術(shù)作為核心方法被廣泛的應用到對蛋白的結(jié)構(gòu)以及功能方面進行預測。首先，通過在數(shù)據(jù)庫中搜索目標蛋白的序列信息并且進行比對，包括同源序列，拓撲結(jié)構(gòu)，功能團，進化，具體功能相關(guān)序列分析等。在預測結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，膜蛋白的功能研究還主要依賴各種現(xiàn)代生物物理儀器，包括質(zhì)譜儀，核磁共振儀，X射線儀，紅外/紫外/光散射光譜儀等。但是，由于膜蛋白不易于過表達，純化甚至是結(jié)晶，再加上無法確保膜蛋白的天然構(gòu)象，因此在其轉(zhuǎn)運功能方面的研究還是面臨很大的困難的。目前已經(jīng)有很多文獻通過應用放射性元素示蹤的方法報道和研究了相關(guān)膜蛋白的轉(zhuǎn)運功能，主要的研究方法是利用脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)的特性模擬細胞膜結(jié)構(gòu)，將目的蛋白插入到脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)的表面。首先用做好的帶有轉(zhuǎn)運蛋白的膜結(jié)構(gòu)包裹放射性元素標記的底物。在該混合物的基礎(chǔ)上添加放射性元素標記的底物交換物。允許轉(zhuǎn)運反應發(fā)生一段時間后應用蛋白抑制劑停止膜蛋白上的轉(zhuǎn)運活動。最后，通過比較同位素標記的底物以及被交換物與各自標準含量的差別從而判斷蛋白轉(zhuǎn)運的情況。

同位素示蹤法是利用放射性核素作為示蹤劑對研究對象進行標記的微量分析方法，其主要原理是利用核探測器隨時追蹤放射性同位素不斷地放出的特征射線，從而示蹤同位素在體內(nèi)或體外的位置、數(shù)量及其轉(zhuǎn)變等。目前應用比較廣泛的是放射性同位素法。該方法的優(yōu)點在于其靈敏度高，測量方法簡便易行，能準確地定量，準確地定位及符合所研究對象的生理條件等特點。穩(wěn)定同位素因作為一種不釋放射線的示蹤劑，其靈敏度較低，可獲得的種類少，而且價格較昂貴導致它的應用范圍受到限制。就該方法的優(yōu)點而言，膜蛋白上的轉(zhuǎn)運活動的確能夠準確的定位以及定量，但是，即便采取放射防護措施，放射性元素的對機體的損害也是難以避免的。操作者的損害程度與放射照射量，放射照射時間，以及放射射線種類都有直接關(guān)系。放射可以導致機體組織器官發(fā)生病變直至誘發(fā)癌變，并且會引發(fā)遺傳缺陷。更重要的是放射性污物會污染環(huán)境進而影響他人的身體健康。除了健康隱患外，該方法不僅價格昂貴，操作需要的用量以及操作形式都需要謹慎。更重要的是該方法對實驗環(huán)境的要求很高，需要在對周圍環(huán)境沒有污染的，嚴格密閉的條件下進行操作，并切配備先進的生物物理儀器。同位素失蹤法已經(jīng)為研究膜蛋白轉(zhuǎn)運功能方面提供了不可小視的貢獻，但是就該方法的推廣性以及安全性而言，該方法也有它不可避免的弊端。
除了同位素示蹤法，另外一種被廣泛應用研究膜蛋白轉(zhuǎn)運功能的方法是通過檢測在線粒體上轉(zhuǎn)運后的物質(zhì)與其他胞內(nèi)物質(zhì)反應后的生成物從而判斷是否轉(zhuǎn)運的方法。例如研究腺甘酸轉(zhuǎn)運體(ANT4)轉(zhuǎn)運ATP/ADP的功能，通過添加不同濃度的ADP，并且在不同濃度條件下檢測NADPH的生成而判斷ATP的生成。該方法雖然在體外水平能夠保持天然膜蛋白的功能，但是實驗準備條件苛刻，耗時長，需要大量培養(yǎng)細菌并且以及提取新鮮的線粒體。在大多數(shù)的哺乳動物細胞中，線粒體作為主要的ATP合成場所，通過線粒體內(nèi)膜上的氧化磷酸化反應為胞質(zhì)以及其他內(nèi)源性器官提供能量。線粒體是是由外膜，內(nèi)膜，膜間隙以及基質(zhì)四個功能區(qū)構(gòu)成的雙模封閉的亞細胞器。內(nèi)膜較外膜因含有高含量的蛋白質(zhì)和心磷脂具有低通透性，并且其向內(nèi)折疊的結(jié)構(gòu)稱作線粒體嵴，有關(guān)特異性分子運輸，相關(guān)的氧化磷酸化反應以及ATP的合成都在內(nèi)膜上發(fā)生。內(nèi)膜僅允許不帶電荷的小分子物質(zhì)通過，大分子和質(zhì)子需要特殊的轉(zhuǎn)運系統(tǒng)。由內(nèi)膜包裹的基質(zhì)較細胞質(zhì)基質(zhì)黏稠，主要含有參與三羧酸循環(huán)、脂肪酸氧化、氨基酸降解等生化反應的酶等眾多蛋白質(zhì)。大約95%的細胞生命活動是由線粒體支持的。它主要是在結(jié)合能量代謝和自由基代謝的基礎(chǔ)上把氧化底物產(chǎn)生的自由能轉(zhuǎn)化為細胞可以利用的ATP形式。線粒體基質(zhì)中的三羧酸循環(huán)和脂肪酸β-氧化過程生成NADH，通過在線粒體內(nèi)膜上的電子傳遞鏈進行氧化磷酸化。而胞漿中糖酵解生成的NADH在蘋果酸脫氫酶的作用下通過線粒體膜結(jié)構(gòu)進入基質(zhì)參與氧化呼吸鏈的反應。在合成ATP的過程中會產(chǎn)生少量活性氧自由基，這些氧化作用會導致膜轉(zhuǎn)運孔道開放，使得外膜釋放細胞色素C，自由基滲透到基質(zhì)中損傷線粒體自身的DNA等。造成線粒體基質(zhì)內(nèi)的高滲透壓，線粒體內(nèi)外質(zhì)子梯度消失，呼吸鏈脫偶聯(lián)，從而使能量產(chǎn)生中斷。同時，線粒體內(nèi)的氧化應激對引起細胞凋亡起著決定性的作用，例如:外膜釋放的細胞色素C可與凋亡因子結(jié)合形成凋亡體，內(nèi)膜蛋白調(diào)控的紊亂以及胞漿鈣水平升高均可引發(fā)細胞凋亡。線粒體還參與細胞中鈣離子的緩沖。在其內(nèi)膜電位的驅(qū)動下運輸鈣離子進入基質(zhì)。當釋放鈣離子時產(chǎn)生的膜電位差能夠激活一些第二信使系統(tǒng)蛋白協(xié)調(diào)諸如突觸中神經(jīng)遞質(zhì)的釋放以及內(nèi)分泌細胞中急速的分泌等。ANT是線粒體內(nèi)膜上一種含量豐富負責轉(zhuǎn)運ADP和ATP的載體蛋白。它通過參與偶聯(lián)線粒體內(nèi)膜上的氧化磷酸化過程催化轉(zhuǎn)運內(nèi)膜上生成的ATP與胞質(zhì)中ADP的交換。ANT不僅是一種能量轉(zhuǎn)運，而且它也是參與凋亡誘導的雙重功能蛋白。它是組成線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔復合物 mitochondrial permeability - transition pore complex (PTPC)的主要組分，通過與Bcl2家族蛋白結(jié)合從而參與線粒體介導的細胞凋亡。ANT家族的蛋白共同包含一段能夠識別并轉(zhuǎn)運ATP和ADP的氨基酸序列RRRMMM。人類的ANT有四種異構(gòu)體(ANT1，ANT2, ANT3和ANT4)，它們的表達是基于發(fā)育階段，增殖狀態(tài)，組織以及細胞類型的。已經(jīng)有文獻報道通過應用ANT抑制劑證明了 ANT的確能夠轉(zhuǎn)運ATP/ADP。ANT3在所有組織中廣泛表達，并且表達量是直接與氧化代謝水平向關(guān)聯(lián)的。ANTl在包括骨骼肌，心臟，以及大腦這些終端分化組織中高度表達。另外，ANT2只在未分化的細胞或組織中特異性表達，例如淋巴，腎臟和肝臟。最近已有文獻報道ANT參與上調(diào)激素依賴性的癌癥。過表達ANTl和3能夠誘導細胞的凋亡，伴隨膜電位降低，細胞色素C的釋放，caspase被激活以及DNA降解。但是，ANT2缺乏這種特性。抑制ANT2的表達會導致細胞生長停滯以及線粒體膜電位升高。ANT4主要在肝臟，睪丸和腦組織中表達，該蛋白最早發(fā)現(xiàn)于哺乳動物以及雄性成年鼠的精細胞當中。并且它在鼠精原細胞無絲分裂過程中起著重要的作用。
脂質(zhì)體背景及工作原理
脂質(zhì)體是一種人造微囊結(jié)構(gòu)，在疏水作用下它的疏水部分聚集在一起避開水相，而親水部分磷脂分子則暴露于水相使之形成圓形封閉的磷脂單或雙分子層式囊泡結(jié)構(gòu)。脂質(zhì)體大小一般在25到IOOOnm之間，可以根據(jù)其組成成分，結(jié)構(gòu)，所帶電荷以及性能分為好多種。脂質(zhì)體被廣泛的用于生物化學以及制藥方面，根據(jù)其可以與細胞膜融合的特性，脂質(zhì)體可以作為藥物載體包裹小分子藥物，蛋白質(zhì)，核苷酸甚至是質(zhì)粒，再通過設計需要將藥物送到細胞內(nèi)部。脂質(zhì)體的組成主要是磷脂和膽固醇。天然磷脂以卵磷脂(PC)為主，主要來源于蛋黃和大豆。其他合成磷脂例如二棕櫚酰磷脂酰膽堿DPPC，二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺DPPE、二硬脂酰磷脂酰膽堿DSPC等均屬氫化磷脂類，具有性質(zhì)穩(wěn)定，抗氧化性強，成品穩(wěn)定等特點，是目前國外首選的輔料。膽固醇具有調(diào)節(jié)膜流動性的特點，與磷脂共同構(gòu)成脂質(zhì)體膜結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)。根據(jù)其應用的需要，脂質(zhì)體可以被分為普通型，帶電荷型，靶向型等。通過采用不同種類的磷脂分子以及一些親脂衍生物從而對所需脂質(zhì)體進行修飾和改造。分子篩層析/凝膠滲透層析(G50, G75 resin column, HPLC儀)
凝膠過濾層析法是利用凝膠分子篩的特殊結(jié)構(gòu)特點按照分子大小以及形狀分離的方法。層析柱中填充的凝膠主要是多孔交聯(lián)的聚糖，例如葡聚糖或瓊脂糖。根據(jù)目標分子的大小可以選用特定型號的凝膠，例如SephadexG-50,屬于葡聚糖凝膠,能夠分離肽或球狀蛋白分子量在1500到30000道爾頓之間。一般大分子物質(zhì)先流出層析柱，小分子物質(zhì)可以進入凝膠珠從而延緩了流出的速度。凝膠層析法的優(yōu)點在于其操作條件溫和，填充物吸附力弱屬惰性載體，方便使用等。該方法區(qū)別于以下要介紹的高效液相色譜法(HPLC)法主要在于該方法的操作均是按照實驗需要人工準備的小體積層析柱，并且是為下面應用HPLC儀分析做準備。在凝膠分離層析原理的基礎(chǔ)上，采用HPLC儀從而進一步分析轉(zhuǎn)運混合物的成分以及含量，通過分析大分子物質(zhì)相對分子質(zhì)量的分布并且比對滯留時間確定樣品成分，根據(jù)峰面積計算樣品濃度。該方法的優(yōu)點在于其高速，高效，高靈敏度，高自動化。并且已被廣泛應用于分析生物學和醫(yī)藥學相關(guān)重要的分子物質(zhì)，例如蛋白質(zhì)，核酸，多糖類，高聚物，藥物等。該方法的普遍工作過程首先是高壓泵將儲液器中流動相溶劑經(jīng)過進樣器送入色譜柱，然后從控制器的出口流出。當注入欲分離的樣品時，流經(jīng)進樣器儲液器的流動相將樣品同時帶入色譜柱進行分離，然后記錄儀將紫外或熒光檢測器送出的信號記錄從而得到液相色譜圖。

發(fā)明內(nèi)容
解決的技術(shù)問題本發(fā)明提供一種非放射性判別膜蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運功能的方法，該方法優(yōu)于以往研究膜蛋白轉(zhuǎn)運功能的同位素示蹤法，主要表現(xiàn)在其安全性，簡便易行，以及成本低。技術(shù)方案非放射性判別膜蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運功能的方法，步驟為
將天然大豆蛋黃卵磷脂按照100mg/mL的比例溶于氯仿,用氮氣均勻吹干溶液后，用超純水再一次溶解析出的天然大豆蛋黃卵磷脂，并且超聲得到天然大豆蛋黃卵磷脂的脂質(zhì)體； 將膜蛋白與上步經(jīng)處理的天然大豆蛋黃卵磷脂混勻，添加底物ATP以及穩(wěn)定脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)的其他成分并搖勻，得到脂蛋白體重組混合物；按占總體積的比例，具體組成為:去污劑10%wt TritonX-114:8%, 100mg/mL 超聲制備的微脂體:14%, 10mg/mL 心憐脂:8%,0.3 μ g/μ L 膜蛋白:13%，0.1m M 底物(ATP): 1%, 0.1M PIPES 緩沖液:9%，超純水:47% ；
將Amberlite XAD-2大孔樹脂與制備好的脂蛋白體重組混合物按照2:1的體積比例混合后放置搖床上搖勻15分鐘，將混勻樣品加入G75凝膠層析柱分離脂質(zhì)體后，取樣品與ADP按照10:1的體積比例進行轉(zhuǎn)運反應；至少分三個時間點，用膜蛋白活性抑制劑:吡哆醒-5’ -磷酸停止反應；
將樣品添加到G50凝膠層析柱上，進行轉(zhuǎn)運反應后脂蛋白體的純化收集；
最后，將收取的脂蛋白體與乙醇以及氯仿按照1:2:6的體積比例混勻并且放置分層，取上層液400-600 μ L移至新無菌管后放置在4°C冰箱保存，得到包裹的ATP和ADP，再送至HPLC儀，應用HPLC儀分析得到在至少三個反應時間條件下ADP和ATP量的變化，在此基礎(chǔ)上記錄每個條件下ADP以及ATP顯示的峰面積，根據(jù)ADP、ATP的峰面積得到它們在轉(zhuǎn)運反應后的相對量，結(jié)合不同的轉(zhuǎn)運反應時間點得到ADP/ATP的轉(zhuǎn)運趨勢，若隨著反應時間的增加，ATP的含量趨于降低，相對的ADP的含量趨于上升，由此可判斷該膜蛋白具備轉(zhuǎn)運ADP/ATP功能。根據(jù)由HPLC可以得到在各個反應時間點的ATP和ADP量化指標，進而可以得到它們各自在反應過程中升高或降低的趨勢。所述膜蛋白為腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)移酶4 (ANT4)或解偶聯(lián)蛋白UCP2。所述三個反應時間為轉(zhuǎn)運反應的5s、15s和30s。有益效果:
1)、本發(fā)明用到的是天然大豆蛋黃卵磷脂，其成本低，易購買；
2)、本發(fā)明用的凝膠層析柱是人工制作，可重復性操作，內(nèi)添樹脂價格便宜；
3)、本發(fā)明對人身體無害，并且無污染，操作時間短，為直接在體外研究膜蛋白轉(zhuǎn)運功能提供了捷徑。


圖1為實施例1的HPLC圖譜結(jié)果；
圖2為pET-22b的質(zhì)粒圖譜；
圖3為UCP2轉(zhuǎn)運后的結(jié)果分析圖。
具體實施例方式本發(fā)明是一種非放射性判別膜蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運的方法。以下，通過實施例進一步詳細說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限于這些實施例。實施例1:1.ANT4蛋白質(zhì)的過表達和提純
轉(zhuǎn)染pET-22b ANT4 (野生型)質(zhì)粒于大腸桿菌C41并擴增細胞提取ANT4。1.1 ANT4蛋白質(zhì)的表達與細菌擴增克隆ANT4基因到pET-22b (圖2) (Novagen公司)載體上后將攜帶有ANT4基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到大腸桿菌感受態(tài)C41 (DE3) (Avidis公司)中進行表達。重組質(zhì)粒的構(gòu)建:攜帶ANT4基因的pET_22b (圖2) (Novagen公司)的載體構(gòu)建方法參照文獻:Comparative transcriptomic profile analysis of fed-batch culturesexpressing different recombinant proteins in Escherichia coli,Ashish K Sharma,Shubhashree Mahalik, Chaitali Ghosh, Anuradha B Singh and Krishna J Mukherjee,AMB Express 2011, 1:33.將構(gòu)建好的攜帶有ANT4基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到大腸桿菌感受態(tài)C41 (DE3) (Avidis公司)中進行表達。具體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染以及細菌擴增步驟如下:
1)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染
首先，將2-10 μ L pET-22b-ANT4質(zhì)粒與50yL C41 (DE3)菌液混合并且放置冰上30分鐘；其次，將其轉(zhuǎn)移到42 °C水浴鍋中置90秒后再轉(zhuǎn)移至冰上5分鐘；添加ImL液體培養(yǎng)基并且混勻后在37 °C恒溫震動箱(250rpm)中培育15分鐘到I個小時；3000g離心培育好的細胞后移走上清液，將余留的50-100 μ L的菌液涂于帶有氨芐抗性的固體培養(yǎng)基平板表面后置37 1:恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)；
2)大腸桿菌擴增
在固體培養(yǎng)基上挑取單個菌落于15mL無菌EP管中，并且添加按照1000:1的質(zhì)量體積比混合的液體培養(yǎng)基(mL)和氨芐青霉素(mg)。在37°C恒溫震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)不超過12小時；重復該步驟一次，擴增用的菌液體積可根據(jù)個人需要選擇不同體積的無菌管。
1.2 ANT4蛋白質(zhì)提純以及定量分析
I)擴增菌體直至吸光值在600nm時達到I時停止；3000g離心15分鐘擴增后的細菌，用PBS (ρΗ7.4)緩沖液懸浮沉淀；應用功率為130w/頻率為20KHz的Sonics vibra-cell3mm探頭超聲波儀在9KHz45%功率下操作細菌。每操作I分鐘停歇30秒于冰上，以防止超聲產(chǎn)熱致使蛋白變性。該步驟持續(xù)大約30分鐘；之后在IOOOOg條件下離心10分鐘后棄上清，并且在依次更換不同的緩沖液的條件下重復此步驟后最終得到包涵體(表格I)。
權(quán)利要求
1.非放射性判別膜蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運功能的方法，其特征在于步驟為: 將天然大豆蛋黃卵磷脂按照100mg/mL的比例溶于氯仿,用氮氣均勻吹干溶液后，用超純水再一次溶解析出的天然大豆蛋黃卵磷脂，并且超聲得到天然大豆蛋黃卵磷脂的脂質(zhì)體； 將膜蛋白與上步經(jīng)處理的天然大豆蛋黃卵磷脂混勻，添加底物ATP以及穩(wěn)定脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)的其他成分并搖勻，得到脂蛋白體重組混合物；按占總體積的比例，具體組成為:去污劑10%wt TritonX-114:8%, 100mg/mL 超聲制備的微脂體:14%, 10mg/mL 心憐脂:8%,0.3 μ g/μ L 膜蛋白:13%，0.1m M 底物(ATP): 1%, 0.1M PIPES 緩沖液:9%，超純水:47% ； 將Amberlite XAD-2大孔樹脂與制備好的脂蛋白體重組混合物按照2:1的體積比例混合后放置搖床上搖勻15分鐘，將混勻樣品加入G75凝膠層析柱分離脂質(zhì)體后，取樣品與ADP按照10:1的體積比例進行轉(zhuǎn)運反應；至少分三個時間點，用膜蛋白活性抑制劑:吡哆醒-5’ -磷酸停止反應； 將樣品添加到G50凝膠層析柱上，進行轉(zhuǎn)運反應后脂蛋白體的純化收集； 最后，將收取的脂蛋白體與乙醇以及氯仿按照1:2:6的體積比例混勻并且放置分層，取上層液400-600 μ L移至新無菌管后放置在4°C冰箱保存，得到包裹的ATP和ADP，再送至HPLC儀，應用HPLC儀分析得到在至少三個反應時間條件下ADP和ATP量的變化，在此基礎(chǔ)上記錄每個條件下ADP以及ATP顯示的峰面積，根據(jù)ADP、ATP的峰面積得到它們在轉(zhuǎn)運反應后的相對量，結(jié)合不同的轉(zhuǎn)運反應時間點得到ADP/ATP的轉(zhuǎn)運趨勢，若隨著反應時間的增加，ATP的含量趨于降低，相對的ADP的含量趨于上升，由此可判斷該膜蛋白具備轉(zhuǎn)運ADP/ATP 功能。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的非放射性判別膜蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運功能的方法，其特征在于所述膜蛋白為腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)移酶4 (ANT4)或解偶聯(lián)蛋白UCP2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的非放射性判別膜蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運功能的方法，其特征在于所述三個反應時間為轉(zhuǎn)運反應的5s、15s和30s。
全文摘要
非放射性判別膜蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運功能的方法，記錄不同條件下ADP以及ATP顯示的峰面積，根據(jù)ADP、ATP的峰面積得到它們在轉(zhuǎn)運反應后的相對量，結(jié)合不同的轉(zhuǎn)運反應時間點得到ADP/ATP的轉(zhuǎn)運趨勢，若隨著反應時間的增加，ATP的含量趨于降低，相對的ADP的含量趨于上升，由此可判斷該膜蛋白具備轉(zhuǎn)運ADP/ATP功能。該方法優(yōu)于以往研究膜蛋白轉(zhuǎn)運功能的同位素示蹤法，主要表現(xiàn)在其安全性，簡便易行，以及成本低。
文檔編號G01N30/02GK103076412SQ20131001111
公開日2013年5月1日 申請日期2013年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月11日
發(fā)明者李冬海, 張文, 江雪源, 張辰宇 申請人:南京大學