專利名稱：一種金標(biāo)銀染定量檢測鉛離子的方法及其試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重金屬檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種金標(biāo)銀染定量檢測鉛離子的方法及其試劑盒。
背景技術(shù)：
鉛(Pb)，是重金屬之一，在生物體內(nèi)和環(huán)境中殘留時間長，對人體神經(jīng)系統(tǒng)有嚴(yán)重?fù)p害，對人體健康產(chǎn)生嚴(yán)重威脅。自然界中的鉛主要以離子形式(Pb2+)存在，故實現(xiàn)對鉛離子的準(zhǔn)確、靈敏、快速的現(xiàn)場檢測非常重要。目前檢測鉛離子的方法主要有原子發(fā)射光譜法、ICP-MS法、原子吸收光譜法、電化學(xué)法、離子色譜法、毛細(xì)管電泳法、紫外一可見分光光度法、重金屬快速測定儀法、試紙條法等。原子發(fā)射光譜法、ICP-MS法、原子吸收光譜法、電化學(xué)法、離子色譜法、毛細(xì)管電泳法，準(zhǔn)確度和靈敏度高，但均需使用特定的儀器，價格昂貴，操作繁瑣，且要求檢測人員具備一定的專業(yè)知識，分析成本高，無法應(yīng)用于現(xiàn)場檢測，難以普及；紫外一可見分光光度法選擇性差，檢出限高；重金屬快速測定儀法可應(yīng)用于現(xiàn)場檢測，但靈敏度不高、選擇性差，樣品預(yù)處理復(fù)雜；試紙條法雖然快速、簡便而在現(xiàn)場檢測中別具優(yōu)勢，但其只能夠定性分析鉛離子濃度是否達(dá)到該試紙條的檢測限，而不能準(zhǔn)確定量檢測鉛離子的濃度。金標(biāo)銀染(Gold label silver stain)技術(shù)將納米金顆粒與DNA雜交系統(tǒng)結(jié)合在一起后，浸入含銀離子的銀染試劑中，由于納米金顆粒對銀離子的還原有催化作用，銀染試劑中的銀離子在納米金顆粒表面被還原為單質(zhì)銀而沉積，呈現(xiàn)出黑色的銀染信號。納米金顆粒數(shù)目越多，銀染信號的灰度值越大，而納米金顆粒數(shù)目取決于體系中靶DNA或者其他研究對象的數(shù)目，因此根據(jù)銀染信號的灰度值即可定量檢測靶DNA或者其他研究對象的濃度。目前，國內(nèi)外還沒有關(guān)于將金標(biāo)銀染技術(shù)應(yīng)用于定量檢測鉛離子的相關(guān)研究報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種高靈敏度、高選擇性且可定量分析鉛離子濃度的金標(biāo)銀染定量檢測鉛離子的方法及其試劑盒。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為一種金標(biāo)銀染定量檢測鉛離子的方法，具體包括以下步驟( I)硅烷化載玻片的制備將載玻片置于piranha洗液中，于90_100°C加熱20_40min后取出，用蒸餾水洗滌三次，置于N2氛中干燥后，浸入l_3wt%的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)溶液中，于室溫下硅烷化處理2-6h，再用乙醇洗凈后，于110-130°C真空干燥l_3h后，得到硅烷化載玻片，所述的piranha洗液為98%的濃硫酸和30%雙氧水按體積比7:3的比例混合得到；(2)特異性DNA-納米金探針溶液的制備a.將 10 u L 的 100 u M 序列為 SEQ ID NO:1 所示的 IDNA 與 10 u L 的 100 u M 序列為SEQ ID N0:2所示的2DNA混合均勻，在90° C水浴反應(yīng)5min，自然冷卻至室溫后得50 y M的脫氧核酶結(jié)合物溶液；b.將500 μ L23.5ηΜ的納米金溶液與7.1 μ L50 μ M的脫氧核酶結(jié)合物溶液混合，4°C培育22-26h后，用蒸餾水稀釋100倍，即得特異性DNA-納米金探針溶液；(3)特異性DNA-納米金探針與樣品反應(yīng)及銀染放大將步驟(2)所得的特異性DNA-納米金探針溶液與樣品溶液按體積比1-3:2-6混合，振蕩搖勻10-20min后，加入IuL的ImM EDTA 二鈉鹽(乙二胺四乙酸二鈉)，混勻后，取
2-4uL混合溶液滴在娃燒化載玻片上,于室溫下至試樣點完全干燥后，在試樣點上滴銀染試劑4-6uL，室溫下暗箱靜置20-30min后，立即用蒸餾水沖去多余銀染試劑，然后干燥載玻片;(4)金標(biāo)銀染信號的定量分析將干燥后載玻片上的金標(biāo)銀染試樣點掃描成圖片獲得待測樣品溶液的金標(biāo)銀染信號及其灰度平均值，根據(jù)金標(biāo)銀染信號灰度平均值與鉛離子溶液濃度之間的定量關(guān)系，計算得到待測樣品溶液中鉛離子的準(zhǔn)確濃度。步驟(2)中所述的納米金顆粒的直徑為15_30nm，所述的特異性DNA-納米金探針
的結(jié)構(gòu)如下所示
權(quán)利要求
1.一種金標(biāo)銀染定量檢測鉛離子的方法，其特征在于具體包括以下步驟: (1)娃燒化載玻片的制備 將載玻片置于piranha洗液中，于90-100°C加熱20-40min后取出，用蒸餾水洗滌三次，置于N2氛中干燥后，浸入l_3wt%的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)溶液中，于室溫下硅烷化處理2-6h，再用乙醇洗凈后，于110-130°C真空干燥l_3h后，得到硅烷化載玻片，所述的piranha洗液為98%的濃硫酸和30%雙氧水按體積比7:3的比例混合得到； (2)特異性DNA-納米金探針溶液的制備 a.將IOii L的IOOii M序列為SEQ ID NO:1所示的IDNA與10 y L的100 y M序列為SEQ ID NO: 2所示的2DNA混合均勻，在90° C水浴反應(yīng)5min，自然冷卻至室溫后得50 y M的脫氧核酶結(jié)合物溶液； b.將500u L23.5nM的納米金溶液與7.1 y L50 y M的脫氧核酶結(jié)合物溶液混合，4°C培育22-26h后，用蒸餾水稀釋100倍，即得特異性DNA-納米金探針溶液； (3)特異性DNA-納米金探針與樣品反應(yīng)及銀染放大 將步驟(2)所得的特異性DNA-納米金探針溶液與樣品溶液按體積比1-3:2-6混合，振蕩搖勻10-20min后，加入IuL的ImM EDTA 二鈉鹽(乙二胺四乙酸二鈉)，混勻后，取2_4uL混合溶液滴在娃燒化載玻片上，于室溫下至試樣點完全干燥后，在試樣點上滴銀染試劑4-6uL，室溫下暗箱靜置20-30min后，立即用蒸餾水沖去多余銀染試劑，然后干燥載玻片； (4)金標(biāo)銀染信號的定量分析 將干燥后載玻片上的金標(biāo)銀染試樣點掃描成圖片獲得待測樣品溶液的金標(biāo)銀染信號及其灰度平均值，根據(jù)金標(biāo)銀染信號灰度平均值與鉛離子溶液濃度之間的定量關(guān)系，計算得到待測樣品溶液中鉛離子的準(zhǔn)確濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種金標(biāo)銀染定量檢測鉛離子的方法，其特征在于:步驟(2)中所述的納米金顆粒的直徑為15-30nm，所述的特異性DNA-納米金探針的結(jié)構(gòu)如下所示
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種金標(biāo)銀染定量檢測鉛離子的方法，其特征在于:步驟(3)中所述的銀染試劑由組分A和組分B組成，所述的組分A為含0.25g/mL的AgNO3溶液，組分B為0.0425g/mL的氫醌、0.064g/mL的朽1檬酸、0.059g/mL的朽1檬酸三鈉按等體積比混合而成，臨用前將組分A、組分B按體積比3:100混合即得銀染試劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種金標(biāo)銀染定量檢測鉛離子的方法，其特征在于:步驟(4)的具體過程如下: A.用掃描儀將載玻片上的金標(biāo)銀染試樣點掃描成圖片； B.利用Matlab軟件的imread命令，讀出每個像素點的灰度值，令信號的灰度值=255—讀出的灰度值，使信號的灰度值仍介于0至255之間,無色最小為0,全黑色最大為255,顏色越深，信號的灰度值越大； C.設(shè)置信號的灰度值閾值為10，取信號的灰度值>10時的有效像素點，求出有效像素點數(shù)目；D.將所有的有效像素點的金標(biāo)銀染信號的灰度值加和，即得金標(biāo)銀染信號的灰度總值； E.用金標(biāo)銀染信號的灰度總值除以有效像素點數(shù)目，即得到金標(biāo)銀染信號的灰度平均值； F.配制一系列不同濃度的鉛離子溶液，按照前述步驟獲得金標(biāo)銀染信號及其灰度平均值，建立金標(biāo)銀染信號灰度平均值與鉛離子溶液濃度之間的定量關(guān)系； G.根據(jù)上述步驟獲得待測樣品溶液的金標(biāo)銀染信號及其灰度平均值，根據(jù)金標(biāo)銀染信號灰度平均值與鉛離子溶液濃度之間的定量關(guān)系，計算得到待測樣品溶液中鉛離子的準(zhǔn)確濃度。
5.—種金標(biāo)銀染定量檢測鉛離子的試劑盒，其特征在于:包括硅烷化載玻片、特異性DNA-納米金探針和銀染試劑，所述的特異性DNA-納米金探針在納米金上結(jié)合有特異性DNA，所述的特異性DNA-納米金探針的結(jié)構(gòu)如下所示
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種金標(biāo)銀染定量檢測鉛離子的試劑盒，其特征在于:所述的納米金顆粒的直徑為15-30nm。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種金標(biāo)銀染定量檢測鉛離子的試劑盒，其特征在于:所述的銀染試劑由組分A和組分B組成，所述的組分A為含0.25g/mL的AgNO3溶液，組分B為.0.0425g/mL的氫醌、0.064g/mL的朽1檬酸、0.059g/mL的朽1檬酸三鈉按等體積比混合而成，臨用前將組分A、組分B按體積比3:100混合即得銀染試劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種金標(biāo)銀染定量檢測鉛離子的方法及其試劑盒，特點是包括將載玻片加熱清洗干燥，浸入APTES溶液中，于室溫下硅烷化處理再用乙醇洗凈后，于110-130℃真空干燥1-3h后得到硅烷化載玻片的步驟；將DNA和納米金溶液混合，振蕩搖勻，室溫下溫育加水稀釋得到特異性DNA-納米金探針溶液的步驟；將特異性DNA-納米金探針溶液與樣品溶液混合后，滴在硅烷化載玻片上室溫至試樣點完全干燥后，滴銀染試劑暗箱靜置后，立即用蒸餾水沖洗再干燥的步驟；最后進(jìn)行金標(biāo)銀染信號的定量分析，計算得到待測樣品溶液中鉛離子的準(zhǔn)確濃度的步驟，優(yōu)點是具有高靈敏度、高選擇性且可定量分析鉛離子濃度，不僅操作簡單而且可現(xiàn)場檢測。
文檔編號G01N1/38GK103076327SQ20131000807
公開日2013年5月1日 申請日期2013年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月25日
發(fā)明者郭智勇, 王澤波, 陳貝貝, 郝婷婷, 杜書平, 馬青青 申請人:寧波大學(xué)