本發(fā)明涉及生物組織、尤其是諸如皮膚的角蛋白材料的觀測。本發(fā)明更具體地但不僅僅涉及旨在確定生物組織中的黑色素的分布、尤其是分布的數量和/或性質，尤其是為了評估美容處理或治療處理的作用。

背景技術：
生物組織的顏色與黑色素的數量和三維分布有緊密的關系。如今，以二維形式，通過在組織學切片上利用FontanaMasson染色的黑色素的白光成像和定量，或者以三維形式，在圖像處理之后，通過黑色素的多光子成像和三維定量，能夠進行表征黑色素的數量和分布。多光子顯微鏡檢查促進生物組織、尤其是高度散射的活的組織的深入觀測。這是因為由于紅外光被較少散射且被較少吸收，故紅外光更好地透入到組織中，并且利用非線性機制來產生信號在散射介質中引入了更強的信號選擇標準。這種非線性機制涉及兩種或甚至更多種光子與期望檢測的分子或結構的同時相互作用。通常，激發(fā)光束被聚焦且掃描在樣品中，檢測所形成的非線性信號，以便獲得圖像。由于具有激發(fā)功率的信號的非限制性依賴，這種類型的成像的特殊性是基于所提供的光學切片性能。由于激發(fā)功率密度在焦點處是非常高的，故所考慮的非線性效應僅有效地出現在有限的聚焦體積中；這種基本性能確保了在樣品中所獲得的信號的控制，因此可以獲得固有的大約微米的三維分辨率。成像深度根據組織而變化，對于人類皮膚，成像深度大約可以是130μm至200μm。此外，由于使用內源性信號源，這種成像技術不需要標記組織成分。通過內源性生色團，形成熒光信號；除了黑色素，可以提及NAD(P)H(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)、黃素、角蛋白和彈性蛋白。申請FR2944425公開了一種通過多光子顯微鏡檢查評估皮膚色素沉著的方法，該方法基于在皮膚中、在表皮的基底層的水平，通過比其他的內源性熒光團更強的熒光強度來反映高度集中的黑色素。具有高強度的像素歸因于黑色素。然而，這種方法不總是令人滿意的，這是因為，首先，該方法可被其他的也顯示出高熒光強度的熒光團(如，角蛋白)所擾亂，其次，該方法未考慮到具有可與其他內源性熒光團相提并論的熒光信號的黑色素。更加特異性的方法包括考慮黑色素的熒光壽命。的確，黑色素的熒光壽命取決于黑色素的固有熒光性質，不取決于熒光強度和在激發(fā)體積中的熒光團濃度。黑色素具有雙光子激發(fā)熒光壽命，該熒光壽命不同于其他內源性熒光團的熒光壽命。根據通過FLIM(熒光壽命成像)所獲得的圖像，可以估計這種熒光壽命，該FLIM為在M.S.Roberts等人的文章“Non-invasiveimagingofskinphysiologyandpercutaneouspenetrationusingfluorescencespectralandlifetimeimagingwithmultiphotonandconfocalmicroscopy”(EuropeanJournalofPharmaceuticsandBiopharmaceutics，2011年第77卷，第469頁至第488頁)中所描述的、包括監(jiān)控熒光信號隨時間減小的一種技術。申請JP2009-142597描述了一種用于可視化黑色素的方法，該方法將多光子顯微鏡檢查和FLIM相結合。為了提供熒光壽命的良好估計，FLIM技術需要在時間和空間上的熒光信號的積分、在時間方面是昂貴的操作，從而限制了這種技術尤其在三維成像背景下的應用的可能性。

技術實現要素：
因此，需要受益于靈敏的、非侵入性的方法，對于生物組織中的黑色素的分布的三維可視化，該方法易于實施，可以獲得可靠的、快速的、有重要性的結果。本發(fā)明的目的是發(fā)展一種比現有技術方法更簡單更快速的方法，該方法可以特異性地檢測黑色素，并且可以表征其在生物組織、尤其在表皮中的三維分布。還需要可以驗證在處理期間使用的，例如基于抗色素沉著活性劑、脫色活性劑或促進色素沉著活性劑的產品的功效或無害性。在表征尤其是皮膚的色素沉著方面還存在優(yōu)勢，以便使黑色素根據皮膚類型、種群、地理位置、或者飲食等的數量和分布的差異具體化，并且以便表征尤其是皮膚的色素沉著癥，如光化性著色斑(actiniclentigenes)、斑點(雀斑)、或黃褐斑(在懷孕期間有時出現的斑)。此外，在探求在合成的方式上重建開發(fā)新的組織的背景下，需要使黑色素根據組織模型、尤其是皮膚模型的類型的數量和分布的差異具體化。本發(fā)明目的在于滿足所有或部分這些需要。因此，根據本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明的主題是一種用于生物組織內的內源性熒光團成分如黑色素的檢測、量化和/或可視化的方法，該方法包括以下步驟：a)在多光子激發(fā)之后，采集一組連續(xù)的提供關于樣本中的熒光信號隨時間減弱的信息的三維圖像或二維圖像，b)通過對所述熒光信號的對數進行線性回歸來處理這些圖像，確定所述線性回歸的斜率在所述樣本中的空間分布，和c)至少根據這種三維空間分布，生成關于熒光團在所述樣本中的存在和/或量的信息。該方法是非侵入性的，可被用在非治療的、美容的情況下。該方法可以評估色素沉著。所采集的圖像為三維時間圖像。術語“三維時間圖像”用于指隨時間的一系列連續(xù)的三維圖像。每個三維圖像對應一疊代表在給定時刻和給定深度的樣本的結構的二維圖像。每個三維圖像或二維圖像的每個像素可由空間坐標(x，y，z)限定，z為在樣本中的深度。因此，每個二維圖像對應三維圖像的一種特殊情況，其中，僅僅在給定深度z處進行采集。三維圖像的像素被一起群集到在各個時刻采集的圖像的具有相同的空間坐標的像素集合中，這些集合中的每一個被稱為“時間像素”。通過在一定時間段中對雙光子激發(fā)的熒光信號積分，可以獲得每個像素的熒光信號的值。特別地，以規(guī)律的間隔，尤其是在1ns和3ns之間(例如，等于1ns、1.5ns、2ns、2.5ns或3ns)的時間段內，可進行熒光信號的積分。通過對熒光壽命的對數的線性回歸，可以獲得熒光信號減弱的斜率。該方法可需要僅采集有限數量的三維時間圖像，例如，三個和五個之間，這在采集時間和精確度之間提供了良好的折衷。通過對數的線性回歸所獲得的斜率的利用促進了采集的數量的該限制。與FLIM技術相比，本發(fā)明降低了時間采集的數量，使該方法更加容易且更加快速地實施。雖然FLIM技術允許更好地估計熒光壽命，但隨著三維圖像的分辨率的降低，需要相當長的采集時間(大約30s)，根據本發(fā)明的方法對于獲得三維可視化或量化是更加快速的且特別有利的，而同時保持相當于顯微鏡的理論分辨率的分辨率。對于給定樣本的坐標(x，y，z)的時間像素總的采集時間大約為0.28μs，而不是FLIM中的幾毫秒(ms)。例如，對于每個時間像素的時間采集的數量等于四，并...