用于檢測生物學(xué)樣品中的Aβ特異性抗體的方法
【專利摘要】公開了一種用于檢測生物學(xué)樣品中的Aβ特異性抗體的方法，其包括下列步驟：使所述樣品與Aβ聚集體或與具有Aβ聚集體樣表面的顆粒接觸，并且容許所述Aβ特異性抗體結(jié)合所述Aβ聚集體，并通過單一顆粒檢測技術(shù)，優(yōu)選通過熒光活化細(xì)胞分選(FACS)檢測與所述Aβ聚集體結(jié)合的所述Aβ特異性抗體。
【專利說明】用于檢測生物學(xué)樣品中的Αβ特異性抗體的方法
[0001]本發(fā)明涉及用于檢測生物學(xué)樣品(尤其與阿耳茨海默氏病(Alzheimer’ sdisease, AD)有關(guān))的生物學(xué)樣品中的Αβ特異性抗體的方法。
[0002]AD是一種復(fù)雜的進(jìn)行性病癥，其牽涉使病理學(xué)級聯(lián)，包括腦中的淀粉狀蛋白-β聚集和斑形成，tau蛋白的超磷酸化(hyperphosphorylation)與神經(jīng)元內(nèi)纏結(jié)的形成相互作用。伴隨這些腦蛋白質(zhì)的聚集和超磷酸化，炎性過程促成突觸完整性的喪失和進(jìn)行性神經(jīng)變性。
[0003]淀粉狀蛋白β肽(Αβ或A-beta)從具有主要為alpha-螺旋或無規(guī)卷曲二級結(jié)構(gòu)的可溶性形式轉(zhuǎn)化成具有beta-片層二級結(jié)構(gòu)的聚集形式(其最終在腦中形成淀粉狀蛋白斑)代表AD病理學(xué)的第一標(biāo)志之一。Αβ的幾種形式，即C及N端截短的或經(jīng)修飾的肽促成腦中的A β斑形成。Αβ的三種主要C端變體包括肽A β 1-40(由40個氨基酸(aa)組成，Val-40為最后一個aa), Αβ 1-42,和Αβ 1-43。除了 C端截短肽的這些主要形式外,還存在不太頻繁出現(xiàn)的其它截短形式，即Αβ 1-37，Αβ 1-38，和Αβ 1-39。Αβ的N端變體由Αβ 3-40/42/43和Αβ 11-40/42/43組成。在所有這些N端截短形式中，谷氨酸占據(jù)第一個位置。此aa不是穩(wěn)定的，而是經(jīng)歷變化以建立焦谷氨酸(pE)，導(dǎo)致形成Αβ P (E) 3-40/42和A β P (E) 11-40/42。ρΕ殘基自發(fā)形成或者通過稱為谷氨?；h(huán)化酶的酶酶促形成。
[0004]直到最近，AD的診斷是完全臨床診斷，其基于至少兩個領(lǐng)域(例如認(rèn)識，功能)的認(rèn)知缺陷的逐漸發(fā)生，這在沒有另一種可辨別原因(例如血管)的情況中負(fù)面影響患者的日常生活。AD的臨床診斷的限制是誤診的高比率(專家為80%診斷特異性)和如下的實情，即僅可以在疾病已經(jīng)停止導(dǎo)致功能性缺陷的實質(zhì)性神經(jīng)元喪失的晚期時間點時做出診斷。
[0005]基于經(jīng)過過去20年搜集的知識,診斷AD的方式在快速變化。一組由B.Dubois(巴黎)領(lǐng)導(dǎo)的研究人員第一次整合數(shù)據(jù)，其已經(jīng)從調(diào)查出現(xiàn)AD根本的病理學(xué)，出現(xiàn)診斷性算法(Dubois等，Lancet Neurol.9 (2010): 1118-1127)。依照作者，AD的診斷基于特定的認(rèn)知缺陷(情景記憶的變化)，其必須與疾病特異性生物標(biāo)志物的變化(如通過結(jié)構(gòu)MRI評估的海馬萎縮；AD典型的腦脊液標(biāo)簽(signature)(低A42,高總tau,高磷酸Tau);陽性淀粉狀蛋白成像；限定的遺傳風(fēng)險)組合發(fā)生。最近，NIH-NINCDS工作組已經(jīng)很大程度上采用此病理生理學(xué)驅(qū)動的診斷算法(McKhann 等，Alzheimer’ s&Dementia7 (2011): 263-269)。主要出于實際目的，NIH NINCDS工作組保留AD型的MCI (輕度認(rèn)知損傷)為AD的早期階段的診斷。
[0006]由國立老齡化研究所(NationalInstitute of Aging) (NIA, NIH, USA)和阿爾茨海默協(xié)會(Alzheimer Association)任命的工作組已經(jīng)采用如下的觀念，即依靠反映疾病病理學(xué)的生物標(biāo)志物增強AD的臨床診斷。通過這樣做，AD不再是通過排除進(jìn)行的診斷，而是開始為正面診斷。NIA和AA沒有完全遵循由Dubois及同事提出的生物標(biāo)志物驅(qū)動的算法的實情反映目前可用的生物標(biāo)志物的限制。AD腦脊液(CSF)標(biāo)簽可以作為一個例子討論。AD患者的CSF顯示典型的樣式，即Αβ 1-42的降低和總Tau(tTau)和磷酸Tau(pTau)的升聞。[0007]標(biāo)簽存在于AD患者中，但是沒有隨時間檢出變化。實際上，在有AD風(fēng)險的患者(即MCI患者)群體中，其鑒定出繼續(xù)形成臨床癥狀的對象。已經(jīng)處于所述階段，CSF顯示與在充分發(fā)展的AD患者中相同的表達(dá)樣式和變化量。如此，雖然不可能限定Αβ l-42、tTau和pTau的正常范圍，但是沒有定義轉(zhuǎn)折點，即給定患者中例如Aβ生理學(xué)從正常轉(zhuǎn)化成病理學(xué)的時刻。任何目前遵循但尚未確認(rèn)的生物標(biāo)志物也就是如此。這點的主要原因是僅有幾項評估此問題的縱向研究，因為由于它們對患者造成的風(fēng)險和/或與其關(guān)聯(lián)的成本而不可能容易地重復(fù)CSF、MR1、淀粉狀蛋白成像檢查。
[0008]如此，仍然缺乏可以以低風(fēng)險和成本重復(fù)應(yīng)用的可靠生物標(biāo)志物。由于至今開發(fā)基于血液的生物標(biāo)志物耗費的全部努力失敗，情況尤其如此(Hampel等，Nat.Rev.DrugDiscov.9 (2010):560-574)。此類生物標(biāo)志物的利用度對于疾病緩解療法的開發(fā)會是最重要的。此類療法施用得越早，成功的機會越大。而且，可以將此類努力限于借助于特定生物標(biāo)志物鑒定的真正AD病例。
[0009]至今，已經(jīng)在AD和MCI (AD的癡呆前階段)中評估了 A β (測試的各種A β種類和聚集體狀態(tài))。最近的發(fā)現(xiàn)顯示了存在有AD患者和健康對照的血漿和腦脊液中含有的IgG和 IgM 的抗促淀粉狀變(amyloidogenic)活性(O’Nuallain 等，J.Clin.1mmunol.30(2010)Suppl.1: S37-S42; Marcel1 等,J Neural.Transm.116 (2009): 913-920)。通過評估對各種A β形式/聚集狀態(tài)特異性的IgG和/或IgM的ELISA或免疫沉淀測定法獲得的結(jié)果顯示了 AD和MCI患者比健康對照展現(xiàn)出更低水平的血清Αβ自身抗體。雖然這些研究顯示了自身抗體濃度的差異，使用的方法缺乏靈敏性和特異性，其對于使用它們作為以高選擇性和特異性鑒定AD或MCI患者的預(yù)測性診斷工具會是必需的。至今使用的大多數(shù)方法基于ELISA技術(shù)。為了提高這些測定法的靈敏性，一些方法使用A β 1-42肽的放射性標(biāo)記。用經(jīng)氯胺T標(biāo)記的Αβ 1-42使用免疫沉淀測定法來測量健康對照和AD患者之間的差異，Brettschneider等,(Brettschneider等,Biol.Psychiatry57(2005):813-817)的 ROC (接收器工作特性)分析在靈敏性設(shè)置為81.3%時達(dá)到46.7%的特異性。比較而言，Bayer等(W02010/128139Al;Marcello 等，JNeural.Transm.116(2009):913-920)使用基于ELISA 的方法，其中將焦谷氨酸-Αβ片段在板上包被。在此情況中，用抗IgM-HRP抗體檢測健康對照和AD患者中的抗A β特異性IgM-自身抗體顯示了在靈敏性設(shè)置為80%時特異性是60%。至今，這些方法無一滿足會使它們符合作為AD的預(yù)測性生物標(biāo)志物(>80%特異性)的標(biāo)準(zhǔn)。
[0010]不知道這兩組患者中降低的Αβ特異性抗體血清濃度的原因。有兩種一般且非互相排斥的解釋:降低的生成(疾病特異性對一般免疫衰老)和再分布(抗體在例如腦中存在的淀粉狀蛋白沉積物中包載)。關(guān)于這些Αβ同源性(自身)抗體的潛在功能的支持來自最近的研究，其證明了商品化血液產(chǎn)品，即從源自健康供體的血漿提取的合并IgG級分已經(jīng)顯示為含有對Αβ肽特異性的抗體。兩家不同公司的兩種此類產(chǎn)品，即靜脈內(nèi)免疫球蛋白(IVIG)制劑目前在進(jìn)行臨床測試以評估其干擾或預(yù)防AD病理學(xué)的潛力。
[0011]另一個未答復(fù)的問題是Αβ特異性抗體的水平在疾病實體中是否降低，所述疾病實體在其病理生理學(xué)，即帕金森氏癡呆(PDD)、癡呆伴路易體(DLB)、腦淀粉樣血管病(CAA)、慢性頭部創(chuàng)傷(例如拳擊)中具有Αβ組分。這些疾病中A β聚集體(aggregate)特異性抗體水平的調(diào)查可以添加至對導(dǎo)致AD中Αβ聚集體特異性抗體的血清濃度降低的過程的目前了解。具有這些疾病的患者的血清的調(diào)查可以澄清如下的問題，該問題關(guān)于AD是否源自特定的免疫缺陷(在Αβ特異性抗體滴度僅在AD中而不在以A β病理學(xué)為特征的其它疾病中降低的情況中)或者降低的Αβ特異性抗體水平是否源自由于廣泛的Aβ病理學(xué)所致的再分布。在前一種情況中，測試會是高度疾病特異性的生物標(biāo)志物，并且因此應(yīng)當(dāng)有助于區(qū)別AD與前述疾病實體。假設(shè)第二種情況，測試可以適合于鑒定疾病由Αβ病理學(xué)驅(qū)動的患者。
[0012]在W02010/128139A1中，公開了用于診斷AD的生物標(biāo)志物和方法，尤其是針對 pGlu A β 的抗體。Funke 等(Curr.Alz.Res., 6 (3) (2009): 285-289)討論 了 體液中Αβ聚集體的檢測是否是適合于AD早期診斷的方法。Maetzler等(J.Alz.Dis.26 (I)(2011):171-179)報告了針對淀粉狀蛋白和神經(jīng)膠質(zhì)衍生的抗原的自身抗體在路易體關(guān)聯(lián)癡呆的血清和腦脊液中升高。Funke等(Rejuv.Res.13(2-3) (2010):206-209)公開了用于Αβ 聚集體的單一顆粒檢測系統(tǒng)。Fukumoto 等(Faseb J.，I (24) (2010):2716-2726)公開了高分子量β -淀粉狀蛋白寡聚體在AD患者的腦脊液中升高。
[0013]雖然認(rèn)為AD是一種變性性腦疾病，但是免疫系統(tǒng)在疾病過程中也具有重要的作用。在最近幾年，基于免疫的療法設(shè)計為從腦中除去淀粉狀蛋白-beta肽。這些療法觀念在疾病的動物模型中給出陽性結(jié)果。在一些患者形成腦膜腦炎(Meningoencephalitis)后中斷阿耳茨海默氏病患者的主動淀粉狀蛋白-beta疫苗接種的臨床試驗。目前在調(diào)查使用基于體液和細(xì)胞的方法的新免疫療法，用于治療和預(yù)防阿耳茨海默氏病及還有其它相關(guān)疾病。在此類免疫治療方法中，對可靠的生物標(biāo)志物有未滿足的需要，所述生物標(biāo)志物監(jiān)測或證明疾病治療和形成期間患者的免疫應(yīng)答。還需要鑒定指示疫苗接種患者中的疫苗接種目標(biāo)的相關(guān)A β抗體。
[0014]因此，本發(fā)明的目的是提供用于檢測生物學(xué)樣品中，尤其是人AD患者或懷疑具有或者有風(fēng)險形成AD的人個體的樣品中的抗A β抗體的手段。別的目的是提供用于對用于治療AD的藥物，尤其是免疫治療性干預(yù)觀察臨床試驗發(fā)展，及用于觀察用此類免疫治療性干預(yù)處理的患者的可靠工具。
[0015]因此，本發(fā)明提供了用于檢測生物學(xué)樣品中的Αβ特異性抗體的方法，其包括下列步驟:
[0016]-使所述樣品與Αβ聚集體或與具有Αβ聚集體樣表面的顆粒接觸，并且容許Aβ特異性抗體結(jié)合Aβ聚集體，并
[0017]-通過單一顆粒檢測技術(shù)，優(yōu)選通過熒光活化細(xì)胞分選FACS檢測與Aβ聚集體結(jié)合的Αβ特異性抗體。
[0018]憑借本發(fā)明，公開了檢測Αβ特異性抗體的新方法，其可以用作對使用治療AD的免疫治療方法監(jiān)測臨床試驗的發(fā)展非常有用的診斷工具。本方法基于如下的發(fā)明，不僅使用單一 Αβ肽作為Αβ特異性抗體的捕捉工具，而是取而代之，使用A β聚集體，且由此使用單一顆粒檢測技術(shù)檢測生成的抗體-A β聚集體復(fù)合物。簡言之，例如通過過夜溫育生成Αβ聚集體(源自不同Αβ截短的和經(jīng)修飾的型式)。隨后，將Αβ聚集體與源自健康供體(HD)或AD患者的血清樣品一起溫育以容許本抗體(IgG和IgM兩者)的結(jié)合。可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員可用的任何合適的方法，例如通過使用識別與A β聚集體結(jié)合的A β特異性抗體的經(jīng)標(biāo)記的二抗檢測與A β聚集體結(jié)合的抗體。例如，可以使用經(jīng)藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的二抗。此后，使用單一顆粒檢測技術(shù)，諸如FACS (熒光活化細(xì)胞分選)分析(又稱為流式細(xì)胞術(shù))測量包含與A β聚集體結(jié)合的A β特異性抗體(和任選一種或多種檢測劑，諸如二抗)的免疫復(fù)合物。此外，使用依照本發(fā)明的方法，可以顯示源自AD患者的Αβ特異性免疫球蛋白(針對依照本發(fā)明提供的Αβ聚集體)的反應(yīng)性可以通過稱為解蔽(demasking)(從自身抗體除去潛在結(jié)合的Aβ抗原)的方法提高。另一方面，解蔽(=血清中已經(jīng)結(jié)合的Αβ解離)后IgM抗體的反應(yīng)性揭示了 AD患者中升高的IgM水平。此外，憑借本發(fā)明，提供了數(shù)據(jù)，其顯示了與至今公開的方法相比，本方法具有高得多的檢測Αβ特異性抗體的能力，如此具有高得多的監(jiān)測AD血清樣品中Αβ特異性抗體濃度變化的能力。鑒于這些實情，依照本發(fā)明的方法滿足合適方法追蹤給定患者對治療的臨床響應(yīng)的理論前提。
[0019]本發(fā)明開發(fā)用于分析人樣品中的Αβ特異性抗體。因此，優(yōu)選的實施方案是檢測人Αβ特異性抗體,優(yōu)選人IgG或IgM抗體,尤其是人IgG抗體。如已經(jīng)提及的,人中Aβ特異性抗體的檢測原則上是本領(lǐng)域中已知的；然而，不能證實作為可能的生物標(biāo)志物的作用。如用本發(fā)明顯示的，這也是由于本領(lǐng)域中可用的檢測方法的分析不足所致。由于依照本發(fā)明的方法的優(yōu)越性，實現(xiàn)人樣品中的這些抗體作為生物標(biāo)志物的利用度，尤其用于監(jiān)測AD免疫療法。因此，本發(fā)明特別適合于檢測生物學(xué)樣品中的抗體。因而，在本方法的一個優(yōu)選的實施方案中，要檢測和量化的A β特異性抗體是抗體。
[0020]與現(xiàn)有技術(shù)方法形成對比，本方法使用A β聚集體作為探針用于結(jié)合來自樣品的Αβ特異性抗體。雖然此類聚集體原則上是本領(lǐng)域中已知的，但是沒有認(rèn)識到在分析Αβ特異性抗體(尤其在人樣品中)中使用此類聚集體可以顯著改善還與單一顆粒檢測技術(shù)，諸如FACS組合的此類方法。由于使用此類聚集體，用單一顆粒檢測技術(shù)(其是多個不同領(lǐng)域中且用于不同問題的建立技術(shù))的檢測對于分析人樣品(諸如血液)中的Αβ特異性抗體是可能的，所述人樣品通常是非常復(fù)雜且難以處理的。
[0021]優(yōu)選地，要依照本發(fā)明使用的聚集體的尺寸經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化以進(jìn)行分析使用。這可以通過在生成聚集體期間建立某些參數(shù)完成。根據(jù)生成聚集體期間應(yīng)用的條件，可以調(diào)節(jié)聚集體的大小。依照本發(fā)明的A β聚集體的優(yōu)選大小是50nm至15 μ m,優(yōu)選IOOnm至10 μ m,尤其是200nm至5μπι(以聚集體的長度(即最常的延伸)限定)。
[0022]提供適合于本發(fā)明的聚集體的優(yōu)選方法包括如下的步驟，即于2至9的pH將A β ~1~42妝，A β -1~43妝，A β -3-42或A β -p (E) 3-42妝或不太優(yōu)選C端截短的A β妝,諸如Αβ-1-40肽溫育至少20分鐘，優(yōu)選至少I小時，尤其是至少4小時。溫育的持續(xù)時間是調(diào)節(jié)聚集體大小的參數(shù)之一:溫育越長，聚集體越大。典型的溫育時間是10分鐘至24小時。較短的溫育時間通常導(dǎo)致僅非常短的聚集體和少量的聚集體；在顯著長于48小時的溫育時間的情況中生成的聚集體通常不是本方法中優(yōu)選的。當(dāng)然，也可以將聚集體分選并“篩選”以達(dá)到期望的大小(若想要的話)，例如通過分級離心和類似的技術(shù)進(jìn)行。
[0023]依照本方法，使其中要檢測Αβ特異性抗體的樣品與Αβ聚集體接觸以實現(xiàn)樣品中可能存在的A β特異性抗體(和反應(yīng)性相對A β聚集體)結(jié)合。因此，必須調(diào)節(jié)A β聚集體的濃度以提供對于抗體足夠的結(jié)合位置。因而，優(yōu)選地，用于結(jié)合樣品中的抗體的Αβ聚集體的濃度在0.001至I μ Μ，優(yōu)選0.01至0.1 μ M的范圍中。最佳濃度還依賴于要結(jié)合的抗體的性質(zhì)，樣品的性質(zhì)，計劃的接觸時間和聚集體的大小。
[0024]本方法主要用于對人樣品應(yīng)用。因此，優(yōu)選的是，生物學(xué)樣品是人血液或源自人血液的樣品，優(yōu)選人血清或人血漿；人腦脊液或人淋巴。憑借此類樣品來源，還可以建立連續(xù)且常規(guī)的測試(尤其對于源自血液的樣品)。
[0025]容許樣品中的抗體與聚集體適當(dāng)結(jié)合的優(yōu)選接觸時間是至少10分鐘(例如10分鐘至48小時)，優(yōu)選15分鐘至24小時，尤其是30分鐘至2小時。
[0026]若生物學(xué)樣品沒有特別預(yù)處理，則具有對A β聚集體的結(jié)合能力的A β特異性抗體會在與Αβ聚集體接觸期間被結(jié)合。依照本發(fā)明的方法不會檢出樣品中遮蔽的Αβ特異性抗體(即那些已經(jīng)與結(jié)合配偶(例如包含A β的結(jié)構(gòu)，或內(nèi)源A β肽)結(jié)合的抗體)(缺乏此類特定樣品預(yù)處理)。雖然僅反應(yīng)性抗體的鑒定和量化在許多情況中會是足夠且期望的，但是可以有如下的情況或診斷問題，其中應(yīng)當(dāng)檢測樣品中Αβ特異性抗體的總量(反應(yīng)性和非反應(yīng)性)或全部的、反應(yīng)性Αβ特異性抗體，非反應(yīng)性(“遮蔽”)(“masked”)的數(shù)目和Αβ特異性抗體的總數(shù)。
[0027]因此，依照本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實施方案，將樣品解蔽，即在與依照本發(fā)明的Αβ聚集體接觸前將Αβ特異性抗體從對樣品中存在的結(jié)合配偶的任何結(jié)合“釋放”。這容許檢測樣品中的所有Αβ特異性抗體而不僅僅檢測那些沒有與樣品中的結(jié)合配偶結(jié)合的抗體(“游離的”或“反應(yīng)性”抗體)。如上文所述，本方法還適合于測定樣品中的Αβ特異性抗體總體量，即游離的(或“反應(yīng)性”)抗體及那些在樣品中已經(jīng)(例如與Αβ結(jié)構(gòu))結(jié)合的抗體。這可以有助于建立樣品中反應(yīng)性對非反應(yīng)性抗體的差(△)，即對于AD診斷也可能有重大意義的參數(shù)。為了使用Αβ特異性IgM作為用于AD診斷的參數(shù)，實施本方法前的解蔽步驟是特別優(yōu)選的，如此樣品中反應(yīng)性對非反應(yīng)性抗體的差(△)會限定并用作相關(guān)參數(shù)。
[0028]依照本發(fā)明的方法應(yīng)用單一顆粒檢測技術(shù)。此類技術(shù)容許鑒定并量化(“計算”)Αβ特異性抗體對Αβ聚集體的“陽性”結(jié)合結(jié)果的數(shù)目和計數(shù)。此技術(shù)的一個優(yōu)選的實施方案是FACS，其是一種在本領(lǐng)域中建立的技術(shù)。要用于檢測與Αβ聚集體結(jié)合的抗體的其它檢測方法是例如Luminex或質(zhì)譜術(shù)。
[0029]依照Luminex技術(shù)，可以如材料和方法中描述的那樣實施樣品制備。在樣品制備后，可以通過與熒光染色的微球偶聯(lián)的二抗檢測由特異性Aβ特異性抗體識別的Αβ聚集體，所述熒光染色的微球可以在多重檢測系統(tǒng)，例如Luminex閱讀器中檢測(Binder等，Lupusl5(2005):412-421)。
[0030]若使用質(zhì)譜術(shù)作為單一顆粒檢測技術(shù)，則也可以如在下文實施例部分的材料和方法中描述的那樣實施樣品制備。如描述的那樣完成樣品制備。在樣品制備后，可以通過與過渡元素的穩(wěn)定同位素偶聯(lián)的二抗檢測由特異性抗體識別的Αβ聚集體，所述過渡元素的穩(wěn)定同位素可以通過原子質(zhì)譜術(shù)檢測。然后，可以將樣品噴霧到加熱至溫度>5，500Κ的充滿氬等離子體的感應(yīng)線圈。將樣品蒸發(fā)并離子化成其原子組成，并且通過飛行時間質(zhì)譜術(shù)量化有同位素標(biāo)簽的抗體的數(shù)目(Janes等，Nat.Biotechnol.29(2011):602-604)。
[0031]或者，也有可能應(yīng)用單一顆粒檢測技術(shù)，其中一個結(jié)合配偶(Αβ聚集體或抗體/血清)是固定化的，但是在流動條件下測量結(jié)合。例子是Hybcell技術(shù)和表面等離振子共振技術(shù)。在本發(fā)明中使用Hybcell技術(shù),可以將血清樣品定位于Hybcell (旋轉(zhuǎn)圓筒)表面上，并且可以與直接熒光標(biāo)記的預(yù)溫育的Aβ聚集體或備選與經(jīng)熒光標(biāo)記的單克隆Aβ特異性二抗一起實施溫育。用激光檢測與Αβ聚集體結(jié)合的抗體(Ronacher, AnagnosticsTechnical Note ANA-TN-005 (2010))。若在依照本發(fā)明的方法中使用表面等離振子共振，可以應(yīng)用相反設(shè)置:可以在芯片表面上固定化預(yù)溫育的Αβ聚集體。可以通過芯片表面上質(zhì)量增加檢測來自血清的Αβ特異性抗體對芯片上Αβ聚集體的結(jié)合，因此結(jié)合配偶的無標(biāo)記是必需的。為了提高靈敏性或者測定IgG亞型，抗IgG-AB的連續(xù)注射是有可能的(Cannon等，Anal.Biochem.328 (2004): 67-75)。代替對芯片表面直接固定化A β聚集體，可以使用捕捉抗體。對于此設(shè)置，將Αβ特異性抗體在芯片表面上固定化，接著注射預(yù)溫育的Αβ聚集體。在捕獲聚集體后，將血清注射，并通過質(zhì)量增加測量反應(yīng)性。
[0032]可以通過已知的任何合適的方法，例如熒光分光術(shù)實施檢測A β特異性抗體對依照本發(fā)明的Αβ聚集體的結(jié)合(Missailidis等，Methods in MolecularBiology248 (2003):431 _ 441),所述突光分光術(shù)用于通過二抗(例如經(jīng)標(biāo)記的抗IgG或抗IgM 二抗)檢測與Αβ聚集體結(jié)合的Αβ特異性抗體。
[0033]還可以使用特異性結(jié)合抗體的底物，諸如蛋白A或蛋白G實施與聚集體結(jié)合的自身抗體的檢測。另一種可能性是使用Αβ聚集體沉淀Αβ聚集體特異性自身抗體，清洗復(fù)合物，并將抗體生物素化。隨后，然后可以使用鏈霉抗生物素蛋白作為第二步試劑。
[0034]依照本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案，具有A β聚集體樣表面的顆粒是具有在其表面上固定化的Αβ聚集體的珠，尤其是磁珠。
[0035]憑借本發(fā)明，提供經(jīng)歷免疫療法的人患者中的Αβ特異性(自身)抗體作為AD狀態(tài)的標(biāo)志物。在AD治療開始前測試AD患者。然后，在療法(例如用特定A β疫苗，優(yōu)選模擬位疫苗的AD疫苗接種療法)過程中測試Αβ特異性抗體。然后，Αβ特異性抗體的量在AD患者中應(yīng)當(dāng)上升。此上升證明抗體水平上免疫應(yīng)答的成功引發(fā)。因此，若此水平在AD患者或有形成AD風(fēng)險或懷疑具有AD的受試者中是修飾的，則此類修飾水平與AD免疫療法的成功相關(guān)聯(lián)。“修飾”水平可以是Αβ特異性抗體絕對數(shù)目的修飾或Aβ特異性抗體(例如給定類別的Αβ特異性抗體(IgG，IgM，等等))總數(shù)的反應(yīng)性的修飾。例如，增加的反應(yīng)性Αβ特異性IgG與成功的AD疫苗接種相關(guān)聯(lián)并且是成功的AD疫苗接種的標(biāo)志。另一方面，在IgM的情況中，(非反應(yīng)性；即結(jié)合的或遮蔽的)Αβ特異性IgM水平變化為其他方向就AD而言具有標(biāo)志功能。憑借本方法，在反應(yīng)性A β特異性IgG的“初始”水平設(shè)置為100%時，反應(yīng)性A β特異性IgG的顯著增加，例如增加至125%和更高，至150%或更高或至200%和更高，指示成功的免疫療法。另一方面，在反應(yīng)性Αβ特異性IgM的“初始”水平設(shè)置為100%時，血液樣品中總IgM(反應(yīng)性+非反應(yīng)性)增加至少30%，例如至少50%或至少100%指示AD的形成。
[0036]優(yōu)選地，Αβ特異性抗體的檢出量與其它AD狀態(tài)測試，尤其是簡短精神狀態(tài)檢查(MMSE)相關(guān)聯(lián)。從對象取得樣品同時同一 AD患者的麗SE結(jié)果。例如，可以將在對此患者開始疫苗接種策略前的MMSE結(jié)果與貫穿整個治療過程(及此后)產(chǎn)生的后來MMSE比較以觀察無惡化或甚至改善(指示成功的AD免疫療法)或惡化(指示不成功的免疫療法)?？梢詫MSE與依照本發(fā)明的抗體檢測方法聯(lián)系起來:抗體量增加(指示成功的AD免疫療法)或抗體量減少(指示不成功的免疫療法)。
[0037]因此，依照本發(fā)明的方法特別適合于在疾病治療的發(fā)展方面監(jiān)測給定的AD患者，尤其是用于將依照本發(fā)明的診斷結(jié)果與用于測定AD狀態(tài)和/或用于監(jiān)測治療性干預(yù)的效率的其它診斷工具聯(lián)系起來。因而，在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，對在不同時間取得的同一患者的樣品實施所述方法至少兩次。優(yōu)選地，將Αβ特異性抗體的檢出量與從患者取得樣品同時同一患者的MMSE結(jié)果聯(lián)系起來。為了監(jiān)測給定患者中AD的形成，優(yōu)選的是以定期時間間隔實施依照本發(fā)明的方法，例如每6個月至少一次，優(yōu)選每3個月至少一次，尤其是每個月至少一次。
[0038]還有可能為限定疾病狀態(tài)(例如“健康”，輕度AD，晚期AD，或依照麗SE量表)限定樣品中Αβ特異性抗體的某些閾值數(shù)值。閾值數(shù)值當(dāng)然取決于樣品和精確的檢測系統(tǒng)，但是可以開發(fā)用于實施本發(fā)明的任何標(biāo)準(zhǔn)化方式。健康對象的血清中的Αβ特異性IgG濃度通常介于1000和5000ng/ml之間，而AD患者的IgG濃度通常低得多，例如范圍為250至1500ng/ml。大多數(shù)AD患者具有小于1000ng/ml。因此，依照本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案，樣品中低于閾值水平的A β特異性抗體量的檢出指示AD，其中閾值水平是1500ng/ml或更低，優(yōu)選1000ng/ml或更低，尤其是750ng/ml或更低。另一方面，在AD治療(尤其是通過免疫療法的AD治療)過程中此IgG濃度的上升指示成功的免疫療法。例如，若水平從在750ng/ml下上升至超過1000ng/ml或甚至超過1500ng/ml,則這會指示成功的免疫療法。
[0039]因此，本方法特別適合于在隨時間以監(jiān)測方式與給定患者的AD免疫療法結(jié)合使用。
[0040]就與Αβ聯(lián)系或相關(guān)的所有病理學(xué)(“Αβ病理學(xué)”)，特別是疾病過程中出現(xiàn)A β沉積物的病理學(xué)而言，本發(fā)明還可用于免疫療法。關(guān)于此類Αβ病理學(xué)的例子是帕金森氏癡呆(PDD)，癡呆伴路易體(DLB)，腦淀粉樣血管病(CAA)，包含體肌炎(IBM ;尤其是散發(fā)性IBM(sIBM))，或慢性頭部創(chuàng)傷(例如拳擊)(參見例如W02004/062556A, W02009/103105A, W02009/149485A, W02009/149486A, W02009/149487A, W02011/020133A, W02006/005707A, W02006/005706A, W02005/025651A,等等)。
[0041]有可能使用此方法以觀察疾病的形成以及可能的治療方法的性能，尤其是治療方法是否使得能夠建立Αβ特異性抗體，尤其是IgG的“健康”或“升高”水平。
[0042]因此，優(yōu)選地，使用本方法來監(jiān)測AD患者，尤其是用治愈或改善AD的藥物治療的AD患者?？梢猿晒?yīng)用本方法以在AD疫苗(例如用依照W02004/062556A，W02006/005707A, W02009/149486A 和 W02009/149485A 的 AD 模擬位；或用依照 W099/27944A 的 A β 衍生的疫苗)或Αβ靶向性疾病緩解藥物的臨床試驗中觀察患者。
[0043]憑借本發(fā)明，原則上有可能就Αβ特異性抗體而言檢測患者的免疫學(xué)設(shè)置變化。這使患者適合AD的早期階段治療方案和/或預(yù)防(或延遲)策略，尤其是疫苗接種。
[0044]依照另一個方面，本發(fā)明涉及用于實施依照本發(fā)明的方法的試劑盒，其包含:
[0045]-A β聚集體，和
[0046]-樣品容器，尤其是用于人樣品(例如血液，血清，血漿)。
[0047]優(yōu)選地，依照本發(fā)明的試劑盒可以進(jìn)一步含有用于檢測與Αβ特異性抗體結(jié)合的Αβ聚集體的手段，優(yōu)選二抗，尤其是經(jīng)標(biāo)記的二抗，例如抗IgG或抗IgM抗體)。其它組分可以是標(biāo)準(zhǔn)品樣品，陽性和/或陰性對照，使用說明書和合適的包裝手段(例如穩(wěn)固的盒，有色的瓶，等等)。
[0048]附圖簡述
[0049]本發(fā)明通過以下實施例和附圖進(jìn)一步例示，但是不限于此。
[0050]圖1顯示了使用FACS分析進(jìn)行的Αβ聚集體大小測定?？梢允褂昧魇郊?xì)胞術(shù)檢測硫磺素(Thioflavin)T陽性Αβ 1-42聚集體，并且其描繪為斑點印跡中FLl-FITC A (對數(shù)分度(log-scale))和FSC-A(對數(shù)分度)通道中的同質(zhì)群體。使用商品化經(jīng)校正的大小珠(1、2、4、6、10、和15 μ m)測定Αβ聚集體的大小分布(以FCS-A信號限定)，如FSC-A直方圖(B)中顯示的。
[0051]圖2顯示了使用基于FACS的測定法檢測對Αβ聚集體的單克隆抗體反應(yīng)性。Αβ 1-42單克隆抗體3Α5特異性結(jié)合Aβ 1_42聚集體(A)，但是不與Aβ p (E) 3_42聚集體(C)相互作用。比較而言，八^出)3-42特異性抗體0129結(jié)合Αβ P (E) 3-42而非Αβ 1-42聚集體(B+D)。在FL2-PE通道中使用抗免疫球蛋白-經(jīng)PE標(biāo)記的二抗測定反應(yīng)性。如B和C中顯示的熒光強度代表背景染色，如在將聚集體與單獨的經(jīng)PE標(biāo)記的二抗一起溫育時看到的。[0052]圖3顯示了三種不同方法的測定靈敏性的比較。㈧將Αβ 1-42聚集體與IVIG稀釋系列一起溫育，并且使用流式細(xì)胞術(shù)在FL-2通道中測定反應(yīng)性。(B)于ρΗ9.2用Αβ1-42包被過夜的Maxisorp ELISA板上的IVIG滴定。(C)使用表面等離振子共振(BiaCore)對與SA-芯片上固定化的主要生物素化的Αβ 1-42相互作用的不同濃度IVIG的無標(biāo)記物檢測。請注意為了比較，所有結(jié)果以倍數(shù)背景信號給出。
[0053]圖4顯示了 IgG反應(yīng)性與簡短精神狀態(tài)檢查(MMSE)得分的關(guān)聯(lián)。對24名AD患者檢查MMSE狀態(tài)，并且將那些患者的血清進(jìn)行描述的FACS測定法，并且測定中值FI。在結(jié)果和前圖中顯示了接受數(shù)據(jù)的關(guān)聯(lián)。
[0054]圖5Α顯示了測定指定血清樣品中Αβ特異性IgM自身抗體反應(yīng)性。將來自健康供體的對照血清，或源自AD患者的血清進(jìn)行描述的FACS測定法。在FL2-PE通道中評估A β聚集體的熒光強度，并且以中值熒光強度(MFI)表示。圖5Β顯示了 ROC曲線分析。比較來自源自AD患者的血清與源自健康供體的血清的IgM特異性抗A β 1-42反應(yīng)性。
[0055]圖6顯示了抗體解蔽后指定血清樣品中Αβ特異性IgM自身抗體反應(yīng)性的測定。將來自健康供體(HI)的對照血清，或源自AD患者的血清進(jìn)行描述的解蔽方法和隨后的FACS測定法。在FL2-PE通道中評估Αβ聚集體的熒光強度，并且以中值熒光強度(MFI)表
/Jn ο
[0056]圖7顯示了 ROC曲線分析。在自身抗體解蔽后比較來自源自AD患者的血清與源自健康供體的血清的IgM特異性抗A β 1-42反應(yīng)性。
[0057]圖8顯示了代表用AFFIT0PE疫苗處理的患者中在疫苗接種之前，期間和之后A β聚集體特異性IgG抗體的絕對MFI值。顯示了源自在具有(患者Α)和沒有明礬(患者B)的情況中免疫的患者的血清的A β 1-42反應(yīng)性。在FL2-PE通道中評估A β聚集體的熒光強度，并且以MFI表示。
[0058]圖9顯示了在具有和沒有明礬的情況中用AFFIT0PE疫苗免疫的患者的以中值MFI數(shù)值表示的針對A β 1-42聚集體的免疫反應(yīng)性的統(tǒng)計學(xué)分析。由于有佐劑組中的一個極值，實施Mann-Whitney檢驗(非正態(tài)分布)(A)在除去極值后,給出正態(tài)分布,并且實施Student t檢驗(B)。這兩種檢驗都是統(tǒng)計學(xué)顯著的(p〈0, 05)。
實施例
[0059]材料和方法[0060]使用表面等離振子共振(SPR-BIAcore)檢測Ag特異性抗體
[0061]Biacore系統(tǒng)提供可以用于固定化的多種芯片。對于此實驗，使用經(jīng)鏈霉抗生物素蛋白(SA)包被的芯片。為了避免配體經(jīng)由側(cè)鏈對芯片表面的非特異性結(jié)合，使用C端生物素化的Aβ肽(購自Anaspec)。由于生物素-鏈霉抗生物素蛋白復(fù)合物是非常穩(wěn)定的，它最適合于延長的連續(xù)實驗。為了優(yōu)化芯片的穩(wěn)健性及因此可再現(xiàn)性，將最大的響應(yīng)單位(約1500RU)固定化至流動池上，而流動池I保持為空，并用作參照。為了避免芯片表面上的非特異性結(jié)合，使用游離的生物素來飽和所有4個流動池上的游離的SA結(jié)合位點。測量人樣品(已經(jīng)在HBS ρΗ7.4中以1:10至1:100稀釋)和范圍為lmg/ml至10 μ g/ml的IVIG稀釋系列(也在HBS pH7.4中稀釋)。在每次樣品注射后用IOmM甘氨酸-HCl (pHl.8)再生芯片表面。將所有實驗于25°C實施。使用標(biāo)準(zhǔn)化方案進(jìn)行注射，以結(jié)合相200秒開始，接著是解離相600秒。Rmax值定義為樣品注射結(jié)束時的響應(yīng)水平(以RU測量)。對于信號評估，使用集成的BIA評估軟件測定Rmax值。
[0062]使用ELISA檢測A g特異性抗體
[0063]將不同A β 肽(購自 rPeptide)在 IOOmM NaHC03 (ρΗ9.2)中以濃度 5 μ g/ml 稀釋，并在MaXisorp96孔板上包被過夜。為了防止非特異性結(jié)合，使用1%BSA/PBS于37°C將板封閉I小時。將ELISA用人血清樣品的連續(xù)稀釋(以1:10稀釋開始)或通過添加結(jié)合緩沖液(PBS/0.l%BSA/0.l%Tween20)中稀釋的范圍為lmg/ml下至10 μ g/ml的濃度的IVIG于37°C實施I小時。在用PBS/0.l%Tween20重復(fù)清洗步驟(3次)后，于37°C添加抗人IgHRP (0.5 μ g/ml)檢測二抗I小時。將樣品再清洗3次，并添加ABTS (在0.1M檸檬酸ρΗ4.3中的0.68mM) 30分鐘以推進(jìn)測定法，之后以波長405nm在讀板儀(Biotek_Gen5Program)上測量0D。
[0064]使用FACS分析檢測Ag特異性抗體
[0065]在分析前，將凍干的β -淀粉狀蛋白肽進(jìn)行解聚方法。出于此目的，將凍干的A β種類在1%ΝΗ40Η(ρΗ11)中溶解。隨后，將溶解的Αβ肽等分取樣，并于_20°C貯存。為了誘導(dǎo)聚集體的形成，將不同Αβ種類以濃度20 μ M在水溶液(ρΗ5)中于37°C在搖動器(350rpm)上在Eppendorf管中溫育過夜?？梢酝ㄟ^FACS (FSC/FL1)中的硫磺素T (ThT)染色確認(rèn)A β聚集體的形成。將聚集的A β種類在無菌過濾的0.5%BSA中稀釋至0.15 μ Μ，并且在終體積95 μ I中在96孔板中預(yù)溫育30分鐘。將5 μ I預(yù)稀釋的人血漿或抗體(在0.5%BSA/PBS中)添加至95μ1 Αβ聚集體溶液。血漿的最終稀釋范圍為1:1000上至1:10.000。對于單克隆抗體，使用低于0.5 μ g/ml的濃度。于室溫(RT)在搖動器(350rpm)上45或60分鐘溫育后，將200 μ 10.5%BSA/PBS在每個孔中添加，并且以3000rpm(96孔板離心機)離心5分鐘。將上清液除去，并且用200 μ 10.5%BSA/PBS將清洗步驟再次重復(fù)。在第二次清洗后，棄去SN，并且將團(tuán)粒在含有1:1000稀釋的經(jīng)標(biāo)記的抗IgG(H+L)-PE或1:500稀釋的抗IgM, Fc5 μ 二抗(都是 Jackson Tmmuno Research)的 100 μ 10.5%BSA/PBS 中重懸。將樣品于RT在搖動器(350rpm)上再溫育45或60分鐘，并在裝備有高通量取樣器(HTS)的FACSCanto上測量。將聚集體在FSC/SSC中門控，并且分別意味著使用FACS Diva軟件，在FL2-PE通道中測量并評估中值熒光強度(MFI)，及在FLl-FITC通道中測量并評估ThT對A β聚集體的反應(yīng)性。
[0066]經(jīng)蔽[0067]為了破壞A β特異性自身抗體對患者血清中可能存在的A β的結(jié)合且因此防止通過基于抗原的方法(如ELISA或FACS)檢出與自身抗體結(jié)合的這些A β，將血清在IOmM甘氨酸ρΗ2.6中以稀釋1:16.7預(yù)稀釋5分鐘。
[0068]為了破壞A β抗原對自身抗體的潛在結(jié)合，將血清在IOmM甘氨酸ρΗ2.6中以稀釋1:16.7預(yù)稀釋5分鐘。然后，將5 μ I酸化的血清與3 μ I A β 1-42 (100 μ g/ml)再溫育5分鐘。然后，通過添加92 μ 10.5%BSA/PBS中和混合物，并溫育20至60分鐘。如上文對非解蔽的血清描述的，實施清洗步驟和與二抗一起溫育。
[0069]結(jié)果
[0070]Αβ聚集體:宴聚化和原纖(fibril)形成
[0071]最近幾年中已經(jīng)在多種條件下廣泛調(diào)查了從單體A β形成Αβ聚集體(包括Αβ寡聚物，原纖和原纖聚集體)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了 Αβ肽的聚集非常多地依賴于不同條件，包括pH、溫度、緩沖劑組成和蛋白質(zhì)濃度。聚集開始于從單體形成β_發(fā)夾，生成可溶性寡聚物。對平行β_片層的構(gòu)象轉(zhuǎn)變導(dǎo)致然后導(dǎo)致形成原纖和原纖聚集體，其可以通過離心沉淀。最近的發(fā)現(xiàn)已經(jīng)顯示了于ΡΗ7.4生成的Aβ 40和Αβ 42聚集體包含具有5nm寬細(xì)絲的原纖，該細(xì)絲具有側(cè)向結(jié)合成束(15至25nm寬的細(xì)絲)的微小趨勢。此類單一原纖的長度位于亞微米(50-100nm)上至10-15 μ m的范圍中，如通過透射電子顯微術(shù)測定的。這些Αβ原纖的一個特征在于它們與熒光染料硫磺素T(ThT) —起特異性插入。
[0072]依照本發(fā)明，生成不同Aβ肽變體(Αβ 1-42、Αβ3-40、和Αβρ(Ε)3-40)(其與ThT一起插入)的Αβ聚集體?？梢允褂肍ACS分析檢測這些A β聚集體。出于此目的，如麗中描述的，將無核(seedless)可溶性Αβ肽以濃度20 μ M于37°C溫育20小時。如圖1A(上部小圖)中顯示的，清楚的ThT陽性同質(zhì)群體(測量為FLl (FITC)陽性信號)，依照本發(fā)明開發(fā)的FACS測定法容許分析體外生成的A β聚集體。使用范圍為I至15 μ m的校正大小珠(Molecular probes的流式細(xì)胞術(shù)大小校正試劑盒(產(chǎn)品目錄編號F-13838))(圖1底部小圖)分析Αβ聚集體的大小分布(通過前向散射FSC-A限定)。使用此分析，顯示了預(yù)期的，生成的A β聚集體的大小范圍為亞微米范圍上至10 μ m，其中大多數(shù)生成的聚集體范圍為約200nm上至3μπι。
[0073]單抗與Ag聚集體的反應(yīng)性
[0074]為了限定A β聚集體是否容許A β特異性抗體結(jié)合并且測定此類相互作用是否可以使用本文描述的基于FACS的測定法監(jiān)測，進(jìn)行另一組實驗。出于此目的，生成A β 1-42及A β P (E) 3-42聚集體，并將其與對A β 1-42 (3Α5)特異性或?qū) β p (E) 3-42 (D129)特異性的單克隆抗體一起溫育。如圖2中的FACS直方圖中顯示的，單克隆抗體3Α5僅僅結(jié)合A β 1_42聚集體，而單抗D129僅與N端截短的焦谷氨酸化的A β種類相互作用。這顯示了描述的基于FACS的測定法容許以特定方式檢測A β特異性抗體。
[0075]限定使用IVIG進(jìn)行的人自身抗體的Αβ結(jié)合的不同檢測方法的靈敏性
[0076]IVIG(靜脈內(nèi)免疫球蛋白)是一種商品化血液產(chǎn)品。它含有自源自健康供體的血漿(來自至少1000名供體的人血漿)提取的合并的IgG級分。已經(jīng)顯示了 IVIG制劑含有對Αβ肽特異性的天然存在的抗體(自身抗體)。
[0077]此實驗的目的是限定并比較用于IVIG(IVIG_Subcuvia,購自Baxter, Austria)的Αβ反應(yīng)性的三種獨立檢測方法(Biacore、ELISA和基于FACS的測定法)的檢測限。因此，將Αβ 1-42固定化至芯片表面上或Maxisorp微量滴定板上，分別用于SPR或ELISA測定?；蛘?，生成A β 1-42聚集體以進(jìn)行FACS分析。隨后，將不同IVIG稀釋液應(yīng)用于各個系統(tǒng)，并且限定Rmax值(在SPR的情況中)，OD值(在ELISA的情況中)或熒光強度(MFI值)(在FACS測定法的情況中)。出于比較原因，對所有IVIG濃度評估信噪比，并且信號以倍數(shù)背景信號(xBG)表示(圖3)。在SPR測量的情況中，IVIG濃度無一給出高于背景的信號(圖3C)。與此形成對比，對照抗體3Α5給出強信號，指示A β 1-42成功固定化至芯片表面，且Αβ肽原則上可以在芯片表面上被抗體識別。使用ELISA作為檢測方法，1000 μ g/mlIVIG給出高于背景的清楚信號(BG的7倍)，而由lOOyg/ml IVIG誘導(dǎo)的信號僅是背景的2倍。10 μ g/ml IVIG沒有產(chǎn)生大于背景的信號(圖3B)。如圖3A中描繪的，基于FACS的測定法提供了比由其它兩種檢測方法投遞的信號高得多的信號。不僅1000 μ g/ml (BG的24倍)，或100 μ g/ml (BG的11倍)，而且還有10 μ g/ml (BG的5倍)，和I μ g/ml (BG的幾何2倍)IVIG稀釋液產(chǎn)生明顯高于背景的信號。這指示檢測Αβ特異性自身抗體的新開發(fā)的基于FACS的測定法比常規(guī)測定法諸如ELISA或Biacore靈敏至少100倍。
[0078]限定源自健康供體和AD患者的人血 液中的抗beta淀粉狀蛋白抗體
[0079]a.1gG 對 A β 1-42 的反應(yīng)性
[0080]試圖限定認(rèn)知和免疫學(xué)數(shù)據(jù)之間的關(guān)聯(lián)，將測量的IgG對AD患者血清(η=24)的Αβ聚集體的反應(yīng)性與血清取樣時患者的簡短精神狀態(tài)檢查(MMSE)的得分聯(lián)系起來。此關(guān)聯(lián)揭示了具有弱測試表現(xiàn)的患者顯示降低的IgG反應(yīng)性的趨勢，如圖4中描繪的。因此，Αβ特異性IgG反應(yīng)性的此降低反映AD進(jìn)展。
[0081]試圖限定認(rèn)知和免疫學(xué)數(shù)據(jù)之間的關(guān)聯(lián)，將AD患者血清(η=24)的測量的IgG反應(yīng)性與來自簡短精神狀態(tài)檢查(MMSE)的結(jié)果聯(lián)系起來。此測試通常用于篩選認(rèn)知損傷和癡呆，并且評估在給定時間點時個體中認(rèn)知損傷的嚴(yán)重性。MFI與MMSE得分的關(guān)聯(lián)揭示了具有弱測試表現(xiàn)的患者顯示降低的IgG反應(yīng)性的趨勢，如圖4中描繪的。
[0082]b.1gG 對 A β 3-42 和 A β p (E) 3-42 的反應(yīng)性
[0083]在限定AD患者和健康受試者的血清中天然存在的免疫球蛋白對A β 1-42聚集體的反應(yīng)性外，還針對A β 3-42以及針對A β P (E) 3-42限定這些血清的反應(yīng)性。
[0084]c.1gM對不同A β聚集體的反應(yīng)性
[0085]在下一組實驗中，使用與上文的描述相同的血清，在源自健康個體或AD患者的血清樣品中限定Αβ聚集體特異性IgM反應(yīng)性。如圖5Α中可以看到的，在測試的所有樣品中檢出對Αβ聚集體特異性的IgM同種型的天然存在的抗體。但是與IgG反應(yīng)性形成對比，源自健康對照的血清樣品沒有表現(xiàn)為比源自AD患者的血清樣品具有更高的IgM對A β聚集體的反應(yīng)性。因此，ROC曲線分析沒有產(chǎn)生描繪靈敏性或特異性的曲線(圖5Β)。
[0086]d.解蔽后IgG和IgM對Αβ聚集體的反應(yīng)性
[0087]在先前的研究中，已經(jīng)顯示了 Αβ特異性自身抗體(主要是IgM同種型的)可以用Αβ抗原占據(jù)以建立免疫復(fù)合物，其是穩(wěn)定的并且在人血液中循環(huán)(W02010/128139Α1;Marcel1 等，2009;Lindhagen-Persson 等，PLoS0NE5(2010):el3928) 0為了限定與自身抗體潛在結(jié)合的A β抗原是否可以阻斷這些抗體對體外生成的A β聚集體的反應(yīng)性，將個體血清進(jìn)行解蔽方法，如材料和方法中描述的。使用低pH，潛在的免疫復(fù)合物被破壞，導(dǎo)致從抗體結(jié)合域除去A β抗原(抗原解離)。如此，若免疫復(fù)合物存在于血清樣品中，則解蔽方法可以在基于FACS的測定法中產(chǎn)生較高的自身抗體信號。令人感興趣地，如圖6中描繪的，與未處理的血清相比，AD患者血清的IgM反應(yīng)性在解蔽后顯著升高，而健康對照血清的反應(yīng)性沒有變化(比較圖9A)。
[0088]在圖7中，已經(jīng)在ROC曲線中匯總了圖6中描繪的結(jié)果。此ROC曲線分析顯示了在靈敏性是78%時，特異性是84%，曲線下面積(AUC)為0.822。
[0089]結(jié)論
[0090]基于這些結(jié)果，可以說明依照本發(fā)明的FACS-聚集測定法的較高靈敏性與Αβ 1-42的不同聚集狀態(tài)直接相關(guān)聯(lián)。對于BIAcore分析，使用新鮮溶解且生物素化的Αβ 1-40以在鏈霉抗生物素蛋白芯片上固定化。此方法有利于在芯片表面上單體Aβ 1-42的結(jié)合，因為肽在沒有預(yù)溫育的情況中立即固定化，并且生物素-標(biāo)簽還減速聚集體的形成。Maxisorp板上于ρΗ9的Αβ 1-42包被似乎也有利于Αβ的單體形式，盡管不能排除一些聚集體的包被。在這些測定法中，抗體和Αβ 1-42肽之間的親和力造成檢測限。
[0091]與這兩種用于依照本發(fā)明的基于FACS的測定法的方法形成對比，將Αβ -1-42聚集體特異性誘導(dǎo)，并且用于檢測IVIG中存在的對Αβ特異性的抗體。這些較大的分子提供多個抗體結(jié)合位點。所得的親合力效應(yīng)(多種協(xié)同低親和抗體-抗原相互作用的總和)可以造成此測定法的較高靈敏性，且通過導(dǎo)致IVIG級分內(nèi)低親和抗體的檢出進(jìn)行。IVIG對Αβ聚集體的反應(yīng)性也可以通過僅存在于Αβ聚集形式上的表位的存在解釋。
[0092]實施例清楚顯示了本發(fā)明比本領(lǐng)域中目前可用的方法的優(yōu)越性，尤其就分析特性，諸如特異性和選擇性而言。
[0093]用依照ΕΡ1583774Β1和ΕΡ1679319Β1的樽擬物瘡苗的臨床研究。
[0094]在含有兩個分支的臨床研究中測試如ΕΡ1583774Β1和ΕΡ1679319Β1中要求保護(hù)的AFFIT0PE-疫苗，其能夠誘導(dǎo)特異性靶向Αβ肽的抗體。將分組I的患者用含有佐劑的AFFIT0PE疫苗免疫，且將分組2中的患者用缺乏作為免疫應(yīng)答增強劑的佐劑的AFFIT0PE疫苗免疫。與無佐劑的疫苗(其中不能預(yù)期Αβ特異性IgG抗體的增加)形成對比，有佐劑的疫苗應(yīng)當(dāng)具有誘導(dǎo)靶向Αβ的抗體的能力。
[0095]為了評估依照本發(fā)明的基于FACS的測定法在臨床研究的過程里監(jiān)測誘導(dǎo)的IgG抗體的能力，將源自疫苗接收者的血清進(jìn)行此測定法。分析源自每位單一患者的I份免疫前血清(在開始免疫方法前收集)和3份免疫后血清。對血清樣品的不同等分試樣完成每個時間點和患者兩次單獨的測量。各位患者中Αβ聚集體特異性IgG抗體隨時間的增加會指示FACS測定法可以適用于隨時間監(jiān)測免疫治療性干預(yù)的效力，且此外，此類結(jié)果會也會指示成功的疫苗接種。
[0096]應(yīng)用依照本發(fā)明的基于FACS的測定法，發(fā)現(xiàn)所有研究參與者的免疫前血清已經(jīng)含有Αβ聚集體特異性IgG，如預(yù)期的。這與最近的出版物一致，其顯示了體液諸如血液(血漿/血清)和CSF含有A β聚集體特異性IgM和IgG抗體。
[0097]圖8中顯示的數(shù)值描繪了隨時間的兩次測量的均值數(shù)值。在此圖中，例示性地，描繪了源自分組I的患者(患者Α)和用缺乏佐劑的疫苗免疫的患者(分組2-患者B)中的Αβ特異性IgG抗體應(yīng)答的形成。如圖8中可以看出的，來自患者A的免疫血清2和3的MFI信號顯著高于源自前血清的熒光信號，指示增加的Αβ特異性IgG。與此形成對比，源自患者B的免疫血清沒有產(chǎn)生升高的熒光信號。這些結(jié)果對于相應(yīng)組是代表性的。[0098]為了限定個體患者中Αβ 1-42反應(yīng)性的升高，已經(jīng)計算最后一次免疫血清與相應(yīng)的前血清的兩次獨立測量的均值MFI值的差。在圖9中，可以看出使用FACS測定法分析免疫血清導(dǎo)致這兩組間的明顯差異。來自用有佐劑的疫苗免疫的患者的免疫血清一致顯示Αβ特異性IgG的增加。
[0099]為了評估接受有佐劑的或無佐劑的疫苗接種的患者的中值FI值間的統(tǒng)計學(xué)差異，實施兩項不同檢驗。在包括所有患者數(shù)據(jù)時，由于有佐劑的組中的一個極值，在兩組間沒有給出正態(tài)分布。在此前置條件(precondition)下,實施Mann-Whitney檢驗,這產(chǎn)生0.0473的P值(圖9)。為了還在正態(tài)分布條件下進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，從數(shù)據(jù)集除去外層(out-layer),并計算student t檢驗。此分析還產(chǎn)生0.0089的統(tǒng)計學(xué)顯著性P值(圖9)。
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測生物學(xué)樣品中的Αβ特異性抗體的方法，其包括下列步驟: -使所述樣品與A β聚集體或與具有A β聚集體樣表面的顆粒接觸，并且容許所述A β特異性抗體結(jié)合所述Aβ聚集體，并 -通過單一顆粒檢測技術(shù)(single particle detection technique),優(yōu)選通過突光活化細(xì)胞分選(FACS)檢測與所述A β聚集體結(jié)合的所述A β特異性抗體。
2.依照權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述Aβ特異性抗體是人抗體，優(yōu)選人IgG或IgM抗體,特別是人IgG抗體。
3.依照權(quán)利要求1或2的方法，其特征在于所述Aβ特異性抗體是自身抗體。
4.依照權(quán)利要求1至3中任一項的方法,其特征在于所述Αβ聚集體具有50nm至15 μ m,優(yōu)選1OOnm至10 μ m,尤其是200nm至5 μ m的大小。
5.依照權(quán)利要求1至4中任一項的方法，其特征在于所述Aβ聚集體已經(jīng)通過于2至9的pH將A β -1-42肽，A β +43肽，A β -3-42,或A β -p (E) 3-42肽溫育至少20分鐘，優(yōu)選至少I小時,尤其是至少4小時制備。
6.依照權(quán)利要求1至5中任一項的方法，其特征在于所述Aβ聚集體以0.001至1 μ Μ，優(yōu)選0.01至0.1 μ M的量存在，用于使所述樣品與A β聚集體接觸。
7.依照權(quán)利要求1至6中任一項的方法，其特征在于所述生物學(xué)樣品是人血液或自人血液衍生的樣品，優(yōu)選人血清或人血漿；人腦脊液或人淋巴。
8.依照權(quán)利要求1至7中任一項的方法，其特征在于使所述Aβ聚集體與所述樣品接觸至少10分鐘，優(yōu)選10分鐘至24小時，尤其是20分鐘至2小時。
9.依照權(quán)利要求1至8中任一項的方法，其特征在于在使所述樣品與Aβ聚集體接觸前對所述樣品中的所述Αβ特異性抗體實施解蔽步驟，尤其在檢出IgM抗體時。
10.依照權(quán)利要求1至9中任一項的方法，其特征在于所述具有Αβ聚集體樣表面的顆粒是具有在其表面上固定化的A β聚集體的珠，尤其是磁珠。
11.依照權(quán)利要求1至10中任一項的方法，其中所述生物學(xué)樣品是經(jīng)歷或應(yīng)經(jīng)歷AD免疫療法，尤其是AD疫苗接種的AD患者的樣品。
12.依照權(quán)利要求1至11中任一項的方法，其中所述生物學(xué)樣品是經(jīng)歷或應(yīng)經(jīng)歷AD免疫療法的AD患者的樣品，且其中Αβ特異性抗體的檢出量與從所述患者取得所述樣品同時同一患者的簡短精神狀態(tài)檢查(Min1-Mental Stateexamination, MMSE)結(jié)果相關(guān)聯(lián)。
13.依照權(quán)利要求1至12中任一項的方法，其中對不同時間時取得的同一患者的樣品至少兩次實施所述方法，且其中優(yōu)選地，Αβ特異性抗體的檢出量與從所述患者取得所述樣品同時同一患者的MMSE結(jié)果相關(guān)聯(lián)。
14.依照權(quán)利要求13的方法，其中每6個月至少一次，優(yōu)選每3個月至少一次，尤其是每個月至少一次實施所述方法。
15.依照權(quán)利要求1至14中任一項的方法用于監(jiān)測AD患者，尤其是用治愈或改善AD的藥物治療的AD患者的用途。
16.依照權(quán)利要求1至14中任一項的方法用于診斷帕金森氏癡呆(Parkinson’sdementia, PDD)、癡呆伴路易體(Dementia with Lewy Bodies, DLB)、腦淀粉樣血管病(Cerebral Amyloid Angiopathy, CM)、包含體肌炎(Inclusion body myositis, IBM)、或慢性頭部創(chuàng)傷(chronic head trauma)的用途。
17.用于實施依照權(quán)利要求1至10中任一項的方法的試劑盒，其包含:-A β聚集體，和-樣品容器。
【文檔編號】G01N33/68GK103842824SQ201280049115
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2012年9月20日 優(yōu)先權(quán)日:2011年10月4日
【發(fā)明者】G.斯塔夫勒, A.梅爾霍弗, A.施內(nèi)伯格, M.盧特羅瓦, W.施密特, F.馬特納 申請人:阿費里斯股份公司