專利名稱：一種中國人群耐力指標(biāo)評估試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型提供了一種中國人群耐力指標(biāo)評估試劑盒，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
長久以來，優(yōu)秀運(yùn)動員的運(yùn)動表現(xiàn)一直被認(rèn)為與其遺傳外顯有著顯著相關(guān)性。近年來，隨著生物學(xué)技術(shù)高速的發(fā)展，運(yùn)用生物學(xué)技術(shù)從分子遺傳學(xué)角度來選拔運(yùn)動員，提高運(yùn)動員成材率已成為可能。在啟蒙訓(xùn)練前，通過基因檢測就可以確定或淘汰那些不適合從事競技體育的青少年。與此同時，還能比較精準(zhǔn)地預(yù)測受試者是否具有運(yùn)動天賦，并適合從事哪個運(yùn)動項(xiàng)目。目前科學(xué)技術(shù)水平已經(jīng)可以進(jìn)行基因多態(tài)性(基因型)與運(yùn)動表現(xiàn)(表型)之間的研究。國際上已經(jīng)進(jìn)行的一些相關(guān)研究項(xiàng)目結(jié)果顯示，個體的遺傳特性和后天環(huán)境因素對運(yùn)動員的運(yùn)動水平和訓(xùn)練效果起到重要作用。已經(jīng)確定了至少36個遺傳標(biāo)記(位于20個常染色體基因和線粒體DNA)與運(yùn)動水平相關(guān),39個遺傳標(biāo)記(位于19個常染色體基因和線粒體DNA)與訓(xùn)練效果相關(guān)。國內(nèi)目前的相關(guān)報(bào)道多集中于ACTN3和ACE基因與運(yùn)動表現(xiàn)的研究(ACE基因多態(tài)性及與有氧運(yùn)動能力的關(guān)聯(lián)研究，漢族人群ACTN3多態(tài)性及與有氧耐力的關(guān)聯(lián)性分析)，近年來也出現(xiàn)了一些其他基因如ADRA2A、CFTR等的相關(guān)研究(ACTN3、ADRA2A、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子基因多態(tài)性與士兵速度、耐力、力量素質(zhì)的相關(guān)性)。然而這些利用候選基因法進(jìn)行的研究并不能較全面的解釋中國人群遺傳多態(tài)性與運(yùn)動表現(xiàn)的關(guān)系。上海中優(yōu)醫(yī)藥高科技有限公司與上海體育科學(xué)研究所選材研究中心完成了一批小樣本預(yù)實(shí)驗(yàn)，對103例國際/國家健將運(yùn)動員和50例性別、年齡等條件匹配的對照樣本進(jìn)行20個候選基因位點(diǎn)的檢測結(jié)果進(jìn)行ROC曲線驗(yàn)證。結(jié)果顯示利用9個耐力相關(guān)位點(diǎn)(VDR BsmI, VDR ApaI, ACTN3 Arg577Ter, KDR His472Gln, CNTFR C-1703T，ABCC8Serl369Ala, ADRA2A DraI, CKMM NcoI, PPARGCIA Gly482Ser)進(jìn)行耐力優(yōu)秀運(yùn)動員篩選，AUC達(dá)到0.711，最佳切割點(diǎn)敏感度可達(dá)93.10%，特異性可達(dá)44.00% (p=0.0003)。研究結(jié)果提示:該成果在青少年運(yùn)動員選材時的推廣使用，將大大有助于提高優(yōu)秀體育后備苗子選拔與培養(yǎng)的有效性。本實(shí)用新型基于熒光定量PCR技術(shù)，應(yīng)用具有分辨率更高、雜交特異性更強(qiáng)、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)的Taqman-MGB探針，不僅檢測速度快，全部反應(yīng)在封閉的反應(yīng)管中完成，有效避免了交叉污染，且自動化程度高，能夠?qū)崟r監(jiān)控，提供質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品，使結(jié)果判讀更直觀。
發(fā)明內(nèi)容本實(shí)用新型提供了一種中國人群耐力指標(biāo)評估試劑盒，包括包裝盒體1、口腔拭子
2、樣本保存管3、含有熒光定量PCR反應(yīng)液的一個試管4、含陽性對照品的一個試管5、含陰性對照品的一個試管6，能夠快速評估個體毒物激活能力的體征指標(biāo)。為實(shí)現(xiàn)以上目的，本實(shí)用新型提供了一種中國人群耐力指標(biāo)評估試劑盒，其特征在于將樣本采集、評估個體毒物激活能力的SNP位點(diǎn)檢測整合在一個試劑盒內(nèi)，使用更方 便快捷，且成本更低。

圖1為本實(shí)用新型的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為VDR BsmI rsl544410被檢測樣本的示意圖；圖3為VDR ApaI rs7975232被檢測樣本的示意圖；圖4為ACTN3 Arg577Ter rsl815739被檢測樣本的示意圖；圖5為KDR His472Gln rsl870377被檢測樣本的示意圖；圖6為CNTFR C-1703T rs3808871被檢測樣本的示意圖；圖7為ABCC8 Serl369Ala rs5210被檢測樣本的示意圖；圖8為ADRA2A DraI rs553668被檢測樣本的示意圖；圖9為CKMM NcoI rs8111989被檢測樣本的示意圖；圖10 為 PPARGC1A Gly482Ser rs8192678 被檢測樣本的示意具體實(shí)施方式
以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例1步驟1.采集檢測樣品:打開包裝盒體1，取出口腔拭子2在被測者口腔左右兩腮分別各上下刮20次，保證采集到足量的細(xì)胞樣本，采集完畢，樣本保存于樣本保存管3中。步驟2.采用硅膠吸附法抽提樣本的基因組DNA。步驟3:熒光定量PCR反應(yīng)熒光定量PCR反應(yīng)液4的成分分別包含:10XPCR反應(yīng)緩沖液、dNTPs、MgCl2溶液、Taq DNA聚合酶。9個不同SNP位點(diǎn)的正反向引物、熒光探針訂購于美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。對照品分為陽性對照品5和陰性對照品6，陰性對照品為無菌雙蒸水樣品，陽性對照品為口腔粘膜上皮細(xì)胞DNA樣品。檢測在ABI9700型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行，分為27個反應(yīng)孔，每個檢測樣品(基因組DNA、陽性對照或陰性對照)各2ul，分別放入9個反應(yīng)孔，各加入PCR反應(yīng)液、引物及探針共8ul，同時檢測3個SNP位點(diǎn)，反應(yīng)孔總體積IOul。反應(yīng)條件為:50°C、2分鐘，95 V、10分鐘，然后再進(jìn)行60個循環(huán)的95°C >30秒，60°C、1分鐘。反應(yīng)結(jié)束后取出放入ABI7900型熒光定量PCR儀上進(jìn)行終點(diǎn)熒光讀取，根據(jù)設(shè)定的熒光閾值判斷SNP位點(diǎn)基因型。步驟4 =SNP基因型分析將ABI7900型熒光定量PCR儀上顯示的最終樣本熒光信號表和一個NTC空白對照進(jìn)行比較，每個位點(diǎn)理論上存在三種不同的信號，純Vic熒光信號、VIC和FAM雜合熒光信號以及純FAM熒光信號，分別代表該位點(diǎn)三種不同的基因型；每一個被測者的3個點(diǎn)落在表上哪個區(qū)域，即可知道被測者的耐力指標(biāo)評估能力。(I)VDR BsmI rsl544410檢測結(jié)果圖中的一個點(diǎn)代表一個被測者樣本的檢測結(jié)果，坐標(biāo)軸左下區(qū)域黑點(diǎn)為空白對照、坐標(biāo)軸左上區(qū)域藍(lán)點(diǎn)為GG基因型、坐標(biāo)軸右上區(qū)域綠點(diǎn)為GA基因型、坐標(biāo)軸右下區(qū)域紅點(diǎn)應(yīng)為AA基因型。維生素D受體編碼基因，該基因的多態(tài)現(xiàn)象與個體肌肉生長和骨骼強(qiáng)健存在顯著相關(guān)性。(2) VDR ApaI rs7975232檢測結(jié)果圖中的一個點(diǎn)代表一個被測者樣本的檢測結(jié)果，坐標(biāo)軸左下區(qū)域黑點(diǎn)為空白對照、坐標(biāo)軸左上區(qū)域藍(lán)點(diǎn)為CC基因型、坐標(biāo)軸右上區(qū)域綠點(diǎn)為AC基因型、坐標(biāo)軸右下區(qū)域紅點(diǎn)為AA基因型。維生素D受體編碼基因，該基因的多態(tài)現(xiàn)象與個體肌肉生長和骨骼強(qiáng)健存在顯著相關(guān)性。(3) ACTN3 Arg577Ter rsl815739檢測結(jié)果圖中的一個點(diǎn)代表一個被測者樣本的檢測結(jié)果，坐標(biāo)軸左下區(qū)域黑點(diǎn)為空白對照、坐標(biāo)軸左上區(qū)域藍(lán)點(diǎn)為CC基因型、坐標(biāo)軸右上區(qū)域綠點(diǎn)為CT基因型、坐標(biāo)軸右下區(qū)域紅點(diǎn)為TT基因型。輔肌動蛋白3編碼基因，該基因的多態(tài)現(xiàn)象與個體快縮肌纖維比例具有顯著相關(guān)性。(4) KDR His472Gln rsl870377檢測結(jié)果圖中的一個點(diǎn)代表一個被測者樣本的檢測結(jié)果，坐標(biāo)軸左下區(qū)域黑點(diǎn)為空白對照、坐標(biāo)軸左上區(qū)域藍(lán)點(diǎn)為AA基因型、坐標(biāo)軸右上區(qū)域綠點(diǎn)為AT基因型、坐標(biāo)軸右下區(qū)域紅點(diǎn)為TT基因型。激酶插入?yún)^(qū)域受體編碼基因，該基因上的多態(tài)現(xiàn)象與個體VOmax、慢縮肌纖維比例具有顯著相關(guān)性。(5) CNTFR C-1703T rs3808871檢測結(jié)果圖中的一個點(diǎn)代表一個被測者樣本的檢測結(jié)果，坐標(biāo)軸左下區(qū)域黑點(diǎn)為空白對照、坐標(biāo)軸左上區(qū)域藍(lán)點(diǎn)為CC基因型、坐標(biāo)軸右上區(qū)域綠點(diǎn)為CT基因型、坐標(biāo)軸右下區(qū)域紅點(diǎn)為TT基因型。睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子受體編碼基因，該基因在神經(jīng)系統(tǒng)中參與調(diào)節(jié)神經(jīng)傳遞素的合成與分泌以及神經(jīng)突的正常生長，在減少炎癥反應(yīng)造成組織傷害方面起到重要作用，因而可影響肌肉力量的發(fā)展。(6) ABCC8 Serl369Ala rs5210檢測結(jié)果圖中的一個點(diǎn)代表一個被測者樣本的檢測結(jié)果，坐標(biāo)軸左下區(qū)域黑點(diǎn)為空白對照、坐標(biāo)軸左上區(qū)域藍(lán)點(diǎn)為AA基因型、坐標(biāo)軸右上區(qū)域綠點(diǎn)為AG基因型、坐標(biāo)軸右下區(qū)域紅點(diǎn)為GG基因型。ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白C超家族成員8編碼基因，該基因的多態(tài)現(xiàn)象與個體VOmax具有顯著相關(guān)性。(7) ADRA2A DraI rs553668檢測結(jié)果圖中的一個點(diǎn)代表一個被測者樣本的檢測結(jié)果，坐標(biāo)軸左下區(qū)域黑點(diǎn)為空白對照、坐標(biāo)軸左上區(qū)域藍(lán)點(diǎn)為CC基因型、坐標(biāo)軸右上區(qū)域綠點(diǎn)為CT基因型、坐標(biāo)軸右下區(qū)域紅點(diǎn)為TT基因型。腎上腺素能受體a 2A編碼基因，該基因的多態(tài)現(xiàn)象與個體VOmax具有顯著相關(guān)性。(8) CKMM NcoI rs8111989檢測結(jié)果圖中的一個點(diǎn)代表一個被測者樣本的檢測結(jié)果，坐標(biāo)軸左下區(qū)域黑點(diǎn)為空白對照、坐標(biāo)軸左上區(qū)域藍(lán)點(diǎn)為TT基因型、坐標(biāo)軸右上區(qū)域綠點(diǎn)為CT基因型、坐標(biāo)軸右下區(qū)域紅點(diǎn)為CC基因型。肌酸肌酶編碼基因，該基因的多態(tài)現(xiàn)象與個體快縮肌纖維比例具有顯著相關(guān)性。[0045](9) PPARGCIA Gly482Ser rs8192678檢測結(jié)果圖中的一個點(diǎn)代表一個被測者樣本的檢測結(jié)果，坐標(biāo)軸左下區(qū)域黑點(diǎn)為空白對照、坐標(biāo)軸左上區(qū)域藍(lán)點(diǎn)為GG基因型、坐標(biāo)軸右上區(qū)域綠點(diǎn)為GA基因型、坐標(biāo)軸右下區(qū)域紅點(diǎn)為AA基因型。過氧化物酶體增殖活化受體g協(xié)同激活因子編碼基因，該基因是重要的能量平衡調(diào)節(jié)基因，與個體慢縮肌纖維比例具有顯著相關(guān)性。
權(quán)利要求1.一種中國人群耐力指標(biāo)評估試劑盒，其特征是由包裝盒體(I)、口腔拭子(2)、樣本保存管(3)、含有熒光定量PCR反應(yīng)液的一個試管(4)、含陽性對照品的一個試管(5)、含陰性對照品的一個試管(6)組成。
專利摘要本實(shí)用新型提供了一種中國人群耐力指標(biāo)評估試劑盒，包括包裝盒體1、口腔拭子2、樣本保存管3、含有熒光定量PCR反應(yīng)液的一個試管4、含陽性對照品的一個試管5、含陰性對照品的一個試管6，能夠快速評估中國人群耐力的體征指標(biāo)，使用更方便快捷，且成本更低。
文檔編號G01N21/64GK203048917SQ201220731159
公開日2013年7月10日 申請日期2012年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月27日
發(fā)明者傅詠南, 朱建軍, 沈勛章, 蔡廣, 許汪宇, 張奕 申請人:上海中優(yōu)醫(yī)藥高科技有限公司, 上海體育科學(xué)研究所