專利名稱：傳染性單核細(xì)胞增多癥膠體金檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及ー種膠體金檢測(cè)試劑盒，具體涉及傳染性單核細(xì)胞增多癥檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
單核細(xì)胞增多癥(Infectious mononucleosis)是由EBV病毒(一種接觸傳染性病毒，Epstein-Barr virus)所致的急性自限性傳染病。其臨床特征為發(fā)熱，咽喉炎，肝脾淋巴結(jié)腫大，外周血淋巴細(xì)胞顯著增多并出現(xiàn)異常淋巴細(xì)胞，嗜異性凝集試驗(yàn)陽性，感染后體內(nèi)出現(xiàn)抗EBV抗體。青少年及年輕成年人較易發(fā)生(12到40歲)。單核細(xì)胞增多癥潛伏期在4 15天，成人可更長(zhǎng)，起病急緩不一。約40%單核細(xì) 胞增多癥患者有前驅(qū)癥狀，歷時(shí)4 5天，如全身不適、乏力、頭痛、惡心、稀便、畏寒等，癥狀較典型，如不及時(shí)治療還可能出現(xiàn)心血管系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等并發(fā)癥，因此，對(duì)單核細(xì)胞增多癥的早期診斷有助于該病的治療，并減少并發(fā)癥帶來的身體傷害。EBV病毒在健康人體中也有存在，因此不適于作為單核細(xì)胞增多癥檢測(cè)的指標(biāo)，而其抗體IgM因出現(xiàn)時(shí)間早、消失快、靈敏度和特異性高，已被廣泛的應(yīng)用于單核細(xì)胞增多癥的早期診斷當(dāng)中。目前，主要的檢測(cè)方法為免疫熒光法和酶免疫吸附法，這兩種方法操作復(fù)雜，成本高，實(shí)驗(yàn)條件嚴(yán)格，不利于基層的推廣，急需ー種操作簡(jiǎn)單、成本低、檢測(cè)快速準(zhǔn)確的新方法用于單核細(xì)胞增多癥的早期診斷。

實(shí)用新型內(nèi)容本實(shí)用新型的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，從提高檢測(cè)靈敏度出發(fā)，提供一種既方便又快速的單核細(xì)胞增多癥膠體金快速檢測(cè)試劑盒。本實(shí)用新型采用了下述技術(shù)方案來解決上述技術(shù)問題一種傳染性單核細(xì)胞增多癥膠體金檢測(cè)試劑盒，包括盒座、盒蓋和試劑條，其中，所述試劑條固定于所述盒座中部且位于所述盒座與所述盒蓋之間，所述盒蓋上設(shè)有加樣孔與觀察ロ，所述試劑條包括底層與上層，所述底層為塑料薄片，所述上層依次頭尾相接排列有濾樣紙、免疫膠體金紙片、免疫硝酸纖維素膜和吸水紙，所述免疫膠體金紙片上包被有膠體金標(biāo)記抗人IgM抗體，所述免疫硝酸纖維素膜上設(shè)有平行的一條檢測(cè)線和一條質(zhì)控線，所述檢測(cè)線上包被有異嗜性抗原，所述質(zhì)控線上包被有羊抗鼠IgG。進(jìn)ー步的，所述檢測(cè)線靠近所述免疫硝酸纖維素膜的近免疫膠體金紙片端，質(zhì)控線靠近所述免疫硝酸纖維素膜的近吸水紙端。進(jìn)ー步的，所述盒蓋的加樣孔位于所述試劑條的濾樣紙之上，部分濾樣紙裸露于所述加樣孔之中，所述盒蓋的觀察ロ位于所述試劑條的免疫硝酸纖維素膜之上，所述免疫硝酸纖維素膜上的檢測(cè)線與質(zhì)控線完全或部分裸露于所述觀察ロ之中。進(jìn)ー步的，所述加樣孔貫穿盒蓋。進(jìn)ー步的，所述觀察ロ貫穿盒蓋。[0012]進(jìn)ー步的，所述盒蓋與盒座的邊緣相匹配且相互粘合，或者盒蓋與盒座上設(shè)有對(duì)應(yīng)的卡合或扣合連接部件，并可經(jīng)所述連接部件相卡合或扣合。所述膠體金標(biāo)記人IgM抗體可采用人IgM抗體常規(guī)方法標(biāo)記膠體金獲得。試劑盒的工作原理為試劑盒的檢測(cè)線包被有異嗜性抗原，免疫膠體金紙片上包被有膠體金標(biāo)記抗人IgM抗體。檢測(cè)時(shí)，(一)、如果血液中沒有EBV病毒抗體IgM存在，血液和免疫膠體金紙片上的抗人IgM抗體-膠體金混合，經(jīng)毛細(xì)作用在硝酸纖維素膜上層祈，依次通過T線和C線，在樣品混合物通過T線時(shí)，不會(huì)被包被在T線的異嗜性抗原結(jié)合，T線捕捉不到膠體金因而不顯色，只在C線出現(xiàn)一條紅色線條。(ニ )、如果血液中含有EBV病毒抗體IgG，血液中EBV病毒抗體IgG便首先與免疫膠體金紙片上的抗人IgM抗體-膠體金結(jié)合，形成“ IgM抗體-膠體金-抗人IgM抗體復(fù)合物”。樣品混合物繼續(xù)在硝酸纖維素膜上層析，依次通過T線和C線，在樣品混合物通過T線時(shí)，包被在T線的異嗜性抗原與血
液樣品中的IgM抗體結(jié)合形成“ IgM抗體-膠體金-抗人IgM抗體-異嗜性抗原”復(fù)合物，T線捕捉到膠體金顆粒因而顯色。血液中IgM抗體濃度的越高，T線的顏色越深。(三)、包被在質(zhì)控線(C線)上的羊抗人IgG為多克隆抗體，其總是能捕獲人源性的抗體，所以總能與抗人IgM抗體-膠體金形成“羊抗人IgG-抗人IgM抗體-膠體金”復(fù)合物。因此，在C線處總是形成一定深度的紅線。C線的出現(xiàn)和血液中有無IgM抗體無關(guān)，它的出現(xiàn)表明檢測(cè)操作正確、試劑盒反應(yīng)系統(tǒng)工作正常。同吋，C線也是判斷T線強(qiáng)度的參照線。本實(shí)用新型提供的傳染性單核細(xì)胞增多癥膠體金檢測(cè)試劑盒敏感性高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便省吋，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定，可用于單核細(xì)胞增多癥的早期診斷。

圖I:傳染性單核細(xì)胞增多癥膠體金檢測(cè)試劑盒示意圖圖2 :去盒蓋的傳染性單核細(xì)胞增多癥膠體金測(cè)試劑盒示意圖圖3 :傳染性單核細(xì)胞增多癥膠體金測(cè)試劑盒的試劑條側(cè)視示意圖附圖標(biāo)記I :盒座 2 :盒蓋3 :試劑條4 :加樣孔5:觀察ロ 6:濾樣紙7:免疫膠體金紙片 8:免疫硝酸纖維素膜9 :吸水紙 10 :檢測(cè)線(T線)11 :質(zhì)控線(C線) 12 :塑料薄片
具體實(shí)施例如圖1-3所示傳染性單核細(xì)胞增多癥膠體金檢測(cè)試劑盒，包括盒座I、盒蓋2和試劑條3，其中，試劑條3固定于盒座中部且位于盒座I與盒蓋2之間，盒蓋上設(shè)有加樣孔4與觀察ロ 5，試劑條3包括底層與上層，所述底層為塑料薄片12，所述上層依次頭尾相接排列有濾樣紙6、免疫膠體金紙片7、免疫硝酸纖維素膜8和吸水紙9，免疫膠體金紙片7上包被有膠體金標(biāo)記抗人IgM抗體，免疫硝酸纖維素膜8上設(shè)有平行的一條檢測(cè)線10和一條質(zhì)控線11，所述檢測(cè)線10上包被有異嗜性抗原，所述質(zhì)控線11上包被有羊抗鼠IgG。檢測(cè)線10靠近免疫硝酸纖維素膜8的近免疫膠體金紙片端，質(zhì)控線11靠近所述免疫硝酸纖維素膜8的近吸水紙端。盒蓋的加樣孔4位于試劑條的濾樣紙6之上，部分濾樣紙裸露于所述加樣孔之中，盒蓋的觀察ロ 5位于試劑條的免疫硝酸纖維素膜8之上，免疫硝酸纖維素膜上的檢測(cè)線10與質(zhì)控線11完全或部分裸露于觀察ロ 5之中。為便于觀察，檢測(cè)線10與質(zhì)控線11的至少90%應(yīng)裸露于觀察ロ之中。加樣孔4和觀察ロ 5均貫穿盒蓋。盒蓋I與盒座2的設(shè)計(jì)是為了防止污染，盒蓋I與盒座2的邊緣相匹配且相互粘合，或者盒蓋與盒座上設(shè)有對(duì)應(yīng)的卡合或扣合連接部件，并可經(jīng)所述連接部件相卡合或扣
ム
ロ ο上述試劑盒可采用下列方法制備I.用檸檬酸三鈉還原法備膠體金溶液。2.用膠體金標(biāo)記抗人IgM抗體，制備抗人IgM抗體-膠體金免疫復(fù)合物溶液。a)計(jì)算需要的原始抗體量，用O. 1M，pH7. 2的磷酸鹽緩沖液將抗人IgM抗體的濃度調(diào)整至I. Omg/ml,備用。b)取IOOOml膠體金溶液，加入O. 1M、ρΗ7· 2的磷酸鹽緩沖液100ml，混勻。c)量取18ml I. Omg/ml的抗人IgM抗體加入到膠體金溶液中。室溫反應(yīng)10分鐘，并不時(shí)攪拌。d)反應(yīng)結(jié)束后，加入5%的BSA (作為抗體-膠體金結(jié)合物保護(hù)劑)，使溶液中BSA的終濃度為O. I %。室溫保持10分鐘并不時(shí)攪拌。e)反應(yīng)復(fù)合物純化反應(yīng)結(jié)束后將復(fù)合物泵入“膠體金洗滌濃縮系統(tǒng)”，用pH7. 2,0. OlM磷酸-O. Ol % BSA緩沖液循環(huán)純化，至流出的廢液變得清晰或?yàn)闇\粉紅為止(OD540 ^ O. 05) οf)純化結(jié)束后，濃縮抗體-膠體金復(fù)合物溶液至終體積約80ml。3.將抗人IgM抗體-膠體金溶液包被到玻璃纖維膜上制得免疫膠體金紙片。4.用羊抗鼠IgG配制質(zhì)控線(C線)溶液，用異嗜性抗原配制檢測(cè)線(T線)溶液。4. IC線的配置a.配制批量為20ml，羊抗鼠IgG抗體蛋白終濃度為2. 5mg/ml。b. O. 05M EDTA溶液準(zhǔn)備在IOml O. OlM, pH7. 2、O. OlM磷酸緩沖液中加入O.186gEDTA。c. 2. 5mg/ml羊抗鼠IgG溶液準(zhǔn)備用O. 01M，pH7. 2,0. OlM磷酸緩沖液將原始羊抗鼠IgG液稀釋至蛋白終濃度2. 5mg/ml。d.取上述I. 5mg/ml羊抗鼠IgG溶液20ml。加入O. 13ml的(λ 05M的EDTA溶液，使EDTA終濃度為O. 33mM。4· 2T線的配置a.配制批量為20ml，異嗜性抗原的終濃度為I. 5mg/ml。b. I. Omg/ml異嗜性抗原溶液用O. 01M，pH7. 2,0. OlM磷酸緩沖液將原始抗原容液稀釋至蛋白終濃度為I. Omg/ml οc.取上述I. Omg/ml異嗜性抗原溶液20ml,加入O. 13ml的O. 05M的EDTA溶液,使EDTA終濃度為O. 33mM。5.在硝酸纖維素膜上噴點(diǎn)C、T線，制得免疫硝酸纖維素膜。6.用Tris-HCl緩沖液處理濾樣紙，干燥即得。[0050]7.將免疫膠體金紙片、免疫硝酸纖維素膜、濾樣紙及吸水紙粘貼在塑料薄片上組成單核細(xì)胞增多癥膠體金檢測(cè)試劑卡片。本實(shí)用新型試劑盒的使用方法為I.將試劑盒放置在水平臺(tái)面上。2.用加樣吸管吸取尿樣，然后滴3滴(約120ul)血漿或血清樣品到試劑盒的加樣孔中。觀察結(jié)果在滴加樣品后10-15分鐘判讀結(jié)果。檢測(cè)結(jié)果的判斷方法陽性在結(jié)果觀察窗口內(nèi)出現(xiàn)兩條色帶，即檢測(cè)線(T線)和質(zhì)控線(C線)位置各出現(xiàn)一條紅色線條，表示樣品中有IgM抗體的存在。陰性只在結(jié)果觀察窗ロ的質(zhì)控線(C線)位置出現(xiàn)一條紅色線條，檢測(cè)線(T線)未出現(xiàn)任何線條，表示樣品中無IgM抗體的存在。無效質(zhì)控線(C線)不出現(xiàn)。任何情況下，C線均應(yīng)形成，表示加樣和操作正確。C線未出現(xiàn)表明測(cè)試結(jié)果是不確定的，應(yīng)重做。
權(quán)利要求1.一種傳染性單核細(xì)胞增多癥膠體金檢測(cè)試劑盒，包括盒座、盒蓋和試劑條，所述試劑條固定于所述盒座中部且位于所述盒座與所述盒蓋之間，所述盒蓋上設(shè)有加樣孔與觀察口，其特征在于，所述試劑條包括底層與上層，所述底層為塑料薄片，所述上層依次頭尾相接排列有濾樣紙、免疫膠體金紙片、免疫硝酸纖維素膜和吸水紙，所述免疫膠體金紙片上包被有膠體金標(biāo)記抗人IgM抗體，所述免疫硝酸纖維素膜上設(shè)有平行的一條檢測(cè)線和一條質(zhì)控線，所述檢測(cè)線上包被有異嗜性抗原，所述質(zhì)控線上包被有羊抗鼠IgG。
2.如權(quán)利要求I所述傳染性單核細(xì)胞增多癥膠體金檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述檢測(cè)線靠近所述免疫硝酸纖維素膜的近免疫膠體金紙片端，質(zhì)控線靠近所述免疫硝酸纖維素膜的近吸水紙端。
3.如權(quán)利要求I所述傳染性單核細(xì)胞增多癥膠體金檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述盒蓋的加樣孔位于所述試劑條的濾樣紙之上，部分濾樣紙裸露于所述加樣孔之中，所述盒蓋的觀察口位于所述試劑條的免疫硝酸纖維素膜之上，所述免疫硝酸纖維素膜上的檢測(cè)線與質(zhì)控線完全或部分裸露于所述觀察口之中。
4.如權(quán)利要求I所述傳染性單核細(xì)胞增多癥膠體金檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述加樣孔和觀察口均貫穿盒蓋。
5.如權(quán)利要求I所述傳染性單核細(xì)胞增多癥膠體金檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述盒蓋與盒座的邊緣相匹配且相互粘合，或者盒蓋與盒座上設(shè)有對(duì)應(yīng)的卡合或扣合連接部件，并可經(jīng)所述連接部件相卡合或扣合。
專利摘要本實(shí)用新型提供了一種傳染性單核細(xì)胞增多癥膠體金檢測(cè)試劑盒，包括盒座、盒蓋和試劑條，其中，所述試劑條包括底層與上層，所述底層為塑料薄片，所述上層依次頭尾相接排列有濾樣紙、免疫膠體金紙片、免疫硝酸纖維素膜和吸水紙，所述免疫膠體金紙片上包被有膠體金標(biāo)記抗人ΙgM抗體，所述免疫硝酸纖維素膜上設(shè)有平行的一條檢測(cè)線和一條質(zhì)控線，所述檢測(cè)線上包被有異嗜性抗原，所述質(zhì)控線上包被有羊抗鼠IgG。本實(shí)用新型提供的傳染性單核細(xì)胞增多癥膠體金檢測(cè)試劑盒敏感性高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便省時(shí)，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定，可用于單核細(xì)胞增多癥的早期診斷。
文檔編號(hào)G01N33/558GK202471711SQ20122006645
公開日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2012年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月27日
發(fā)明者張國(guó)華 申請(qǐng)人:上海凱創(chuàng)生物技術(shù)有限公司