專利名稱：利用子葉下表皮細胞死亡率鑒定棉花耐鹽能力的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及農(nóng)作物耐鹽檢測方法，具體是一種利用子葉下表皮細胞死亡率鑒定棉花耐鹽能力的方法。
背景技術：
目前，在植物耐鹽鑒定方法上眾說紛紜，可以歸納為直接鑒定法和間接鑒定法，直接鑒定包括發(fā)芽比較法、形態(tài)比較法和產(chǎn)量比較法等。間接鑒定就是通過生理生化分析手段研究植物在鹽脅迫條件下生理代謝過程中的物質(zhì)變化而進行耐鹽鑒定，主要指標有脯氨酸、質(zhì)膜透性、葉綠素、K+/Na+、酶活性等。在棉花耐鹽鑒定方面，同樣由于試驗條件、方法、材料的不同，結果也不盡相同，研究比較分散，欠深入，缺乏系統(tǒng)性、綜合性。河北省農(nóng)林科學院濱海農(nóng)業(yè)研究所針對濱海鹽堿土特點，編制了《棉花耐鹽性鑒定評價技術規(guī)范》，為該地區(qū)棉花耐鹽堿品種的篩選、種質(zhì)資源的評價提供了理論依據(jù)。但是此技術規(guī)范均是在 鹽堿池和鹽堿田間進行的，周期較長，對于大量的材料鑒定費時費力。因此，尋找簡單、便捷、快速的鑒定方法是目前一項迫在眉睫的任務。在高滲環(huán)境下，植物細胞因液泡水分流失而出現(xiàn)的細胞質(zhì)與細胞壁分離的現(xiàn)象，稱為質(zhì)壁分離。發(fā)生質(zhì)壁分離的原因是當外界溶液的濃度大于細胞液濃度時，水分會由細胞液中滲出到外界溶液中，造成液泡失水，由于細胞壁和原生質(zhì)層的伸縮性不同，細胞壁伸縮性較小，而原生質(zhì)層伸縮性較大，從而使二者分開，反之，外界溶液濃度小于細胞液濃度，則細胞通過滲透作用吸水，分離后的質(zhì)壁又復原。質(zhì)壁分離是植物生活細胞所具有的一種特性，可以用來區(qū)分細胞的死活。同樣，棉花在受到鹽脅迫時首先通過滲透勢的改變引起細胞內(nèi)容物的外流，出現(xiàn)質(zhì)壁分離現(xiàn)象而導致細胞死亡。耐鹽能力不同的棉花基因型，其葉表皮細胞在鹽溶液中的死亡率有很大差異在高鹽溶液中處理一定時間，葉表皮細胞的死亡率能夠快速準確的反映基因型的耐鹽能力，細胞死亡率高的耐鹽能力低，細胞死亡率低的耐鹽能力高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的皆在針對目前在棉花耐鹽能力鑒定方法上不統(tǒng)一、欠深入、田間或鹽池鑒定周期長、受外界環(huán)境影響大等缺點，提供一種利用子葉下表皮細胞死亡率鑒定棉花耐鹽能力的方法。本發(fā)明通過以下技術方案實現(xiàn)
一種利用子葉下表皮細胞死亡率鑒定棉花耐鹽能力的方法，包括表皮準備，高鹽溶液處理，染色，制片及鏡檢。所述表皮準備，是在棉花子葉期，選取厚度一致的葉片，輕輕撕取葉片的下表皮； 所述高鹽溶液處理，是將準備好的表皮放到濃度為3. 5M的NaCl溶液中處理10
15min ；
所述染色，是利用O. 03 O. 05%的中性紅溶液對經(jīng)鹽溶液處理的表皮，染色5 IOmin ；
所述制片及鏡檢，是將經(jīng)過活體染色的表皮，轉移到PH值略高于7的自來水中，浸泡3 5 min,放到載玻片上,加蓋玻片,放到10倍和40倍的光學顯微鏡下觀察表皮細胞的死亡情況，根據(jù)活細胞染成櫻桃紅色，死細胞不著色的原理，記載同一面積下的細胞死亡數(shù)，通過子葉下表皮細胞的耐鹽能力確定棉花植株的耐鹽能力。上述3. 5M的NaCl溶液確定為鹽濃度臨界值的原理
撕取的棉花子葉下表皮放到1Μ、1· 5Μ、2Μ、2· 5Μ、3Μ、3· 5Μ的NaCl溶液中，處理10 15min，然后用O. 04%的中性紅染色8 min，用100倍光學顯微鏡下觀察，I 2. 5MNaCl溶液處理后的表皮細胞質(zhì)壁分離程度低，細胞死亡率低，而且耐鹽材料和敏鹽材料間細胞死亡率差異不顯著；NaCl溶液濃度越高，相同處理時間內(nèi)的細胞質(zhì)壁分離程度越嚴重。3M和3. 5MNaCl溶液處理的表皮細胞出現(xiàn)大量的死亡，耐鹽材料的表皮細胞死亡率明顯低于敏鹽材料，而且之間表現(xiàn)顯著差異，3. 5MNaCl溶液處理時，敏鹽材料中棉所12比耐鹽材料NYl的 細胞死亡率明顯增加，而對時間長短的靈敏性低，可重復性好。因此，把3. 5M作為NaCl溶液的臨界鹽濃度。上述染色原理中性紅是一種活體染色劑,呈弱堿性，，在pH6. 4 8. O之間由紅變黃，在微堿性環(huán)境中，植物的活細胞能大量吸收中性紅并向液泡中排泌，由于液泡在一般情況下呈酸性，因此，進入液泡的中性紅便解離出大量陽離子而成櫻桃紅色。在這種情況下，原生質(zhì)和細胞壁不著色。死細胞由于原生質(zhì)變性凝固，細胞不能維持在液泡內(nèi)，因此，中性紅染色后，不產(chǎn)生液泡著色現(xiàn)象。棉花子葉下表皮經(jīng)中性紅染色后，細胞被染成櫻桃紅色，全為活細胞，死細胞只能觀察到玻璃膠狀的細胞質(zhì)，但是將棉花子葉下表皮放到鹽溶液中處理一段時間，再用中性紅染色后，部分細胞呈櫻桃紅色，為活細胞，沒有著色的為死細胞。隨著鹽溶液濃度的提高或是處理時間的延長，液泡濃縮成圓球狀。當鹽濃度過高或是時間過長，細胞膜破損，細胞內(nèi)外成一體，觀察不到紅色球團。依照上述技術方案的本發(fā)明，只需20-30分鐘就能準確的判斷基因型的耐鹽能力，省工省時，不受季節(jié)和環(huán)境的影響，提高了鑒定效率。通過該方法淘汰不耐鹽的基因型，實現(xiàn)耐鹽基因與豐產(chǎn)優(yōu)質(zhì)基因的結合，加速耐鹽棉花新品種的選育，具有十分廣闊的應用前景，且對其他作物的耐鹽能力的快速鑒定具有重要的參考價值。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下特點
①以植物細胞的質(zhì)壁分離現(xiàn)象和中性紅染料的著色原理為依據(jù)，只需少量的子葉，就能快速鑒定出植株的耐鹽能力，具有方便、快捷、重復性好、費用低廉等優(yōu)點。②根據(jù)表皮細胞死亡率淘汰大量不耐鹽的基因型，有效地縮減田間試驗的規(guī)模，節(jié)約時間和人力，大幅度提高優(yōu)良耐鹽基因型的篩選效率，加速耐鹽作物育種的步伐。
具體實施例方式下面結合實施例對本發(fā)明作進一步說明，目的僅在于更好地理解本發(fā)明內(nèi)容。因此，所舉實施例并不限制本發(fā)明的保護范圍。本實施例以NYl和中棉所12為例說明。NYl是河北省農(nóng)林科學院濱海農(nóng)業(yè)研究所選育的耐鹽新品系，耐鹽能力強；中棉所12是不耐鹽品種(經(jīng)河北省地方標準棉花耐鹽性鑒定技術規(guī)程鑒定)。通過塑料盒鹽堿原土鑒定NYl和中棉所12的耐鹽性。用O. 4%的鹽堿原土播種，觀察出苗及長勢情況。結果表明，NYl具有很強的耐鹽性，而中棉所12的耐鹽性較差。選取棉花幼苗的一片子葉，撕取葉表皮放在3. 5M的由化學純NaCl配制的NaCl溶液中處理lOmin，然后用O. 04%的中性紅染色8min后，放到pH為7. 2的自來水中浸泡5min，放到10倍和40倍的光學顯微鏡下觀察，結果表明，在3. 5 MNaCl溶液中處理10min，NYl的 子葉下表皮細胞出現(xiàn)明顯的質(zhì)壁分離現(xiàn)象，鹽脅迫引起的細胞死亡率在40%以內(nèi)，而中棉所12的子葉下表皮細胞大量喪失活力，死亡率達到80%以上，NYl葉表皮細胞死亡率比鹽敏感品種中棉所12的葉表皮細胞死亡率低很多。由于棉花植株的耐鹽能力和葉表皮細胞的耐鹽能力高度相關，通過統(tǒng)計葉表皮細胞死亡率，就能快速準確地篩選耐鹽的棉花植株。由此得出NY1是耐鹽能力強的品種，而中棉所12屬于不耐鹽品種。
權利要求
1.一種利用子葉下表皮細胞死亡率鑒定棉花耐鹽能力的方法，包括表皮準備、高鹽溶液處理、染色、制片及鏡檢，其特征在于 所述表皮準備，是在棉花子葉期，選取厚度一致的葉片，輕輕撕取葉片的下表皮； 所述高鹽溶液處理，是將準備好的下表皮放到濃度為3. 5M的NaCl溶液中處理10 15min ； 所述染色，是利用O. 03 O. 05%的中性紅溶液對經(jīng)鹽溶液處理的表皮，染色5 IOmin ； 所述制片及鏡檢，是將經(jīng)過活體染色的表皮，轉移到PH值略高于7的自來水中，浸泡3 5min,放到載玻片上,加蓋玻片,放到10倍和40倍的光學顯微鏡下觀察表皮細胞的死亡情況，根據(jù)活細胞染成櫻桃紅色，死細胞不著色的原理，記載同一面積下的細胞死亡數(shù)，通過子葉下表皮細胞的耐鹽能力確定棉花植株的耐鹽能力。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用子葉下表皮細胞死亡率鑒定棉花耐鹽能力的方法。步驟是:在棉花子葉期，選取厚度一致的葉片，輕輕撕取葉片的下表皮；將準備好的下表皮放到濃度為3.5M的NaCl溶液中處理10～15min；利用0.03～0.05%的中性紅溶液對經(jīng)鹽溶液處理的表皮，染色5～10min；將經(jīng)過活體染色的表皮放入pH值略高于7的自來水中浸泡3～5min，然后通過光學顯微鏡下觀察表皮細胞的死亡情況，根據(jù)活細胞染成櫻桃紅色，死細胞不著色的原理，記載同一面積下的細胞死亡數(shù)，通過子葉下表皮細胞的耐鹽能力確定棉花植株的耐鹽能力。本發(fā)明能快速準確判斷基因型的耐鹽能力，省工省時，不受季節(jié)和環(huán)境的影響，提高了鑒定效率。
文檔編號G01N21/29GK102879341SQ20121037054
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月29日 優(yōu)先權日2012年9月29日
發(fā)明者劉雅輝, 王秀萍, 魯雪林, 張國新, 李九歡, 李強, 劉艷輝, 李克曄 申請人:河北省農(nóng)林科學院濱海農(nóng)業(yè)研究所