專利名稱：一種快速診斷胰腺創(chuàng)傷和急性胰腺炎的測試卡及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及臨床診斷領(lǐng)域，尤其涉及一種快速診斷胰腺創(chuàng)傷和急性胰腺炎的測試卡及其制備方法
背景技術(shù)：
胰腺創(chuàng)傷和急性胰腺炎是臨床上常見的急危重病，若不及時治療往往危及患者生命，因此對胰腺創(chuàng)傷和急性胰腺炎的及時診斷對于挽救患者的生命非常重要。目前胰腺創(chuàng)傷和急性胰腺炎的常規(guī)診斷主要是測定腹腔滲出液及血液中的淀粉酶活性，以其活性的急劇升高作為診斷依據(jù)，但該方法的準確性欠佳，因為仍然有部分患者 測得的淀粉酶活性沒有較大的變化。另外還通過APACHE II評分對胰腺創(chuàng)傷和急性胰腺炎進行診斷，但該評分方法過于繁瑣，若評分不足則容易導(dǎo)致患者病情延誤；若評分過高則容易導(dǎo)致治療過渡，因此該評分方法也不能滿足對胰腺創(chuàng)傷和急性胰腺炎的快速診斷的要求。近年來，隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)在急性胰腺炎和胰腺創(chuàng)傷發(fā)生時，胰蛋白酶原被激活時產(chǎn)生一個小分子肽，叫做胰蛋白酶原激活肽(TAP)，該分子在腹水、血液以及尿液中含量的升高與急性胰腺炎和胰腺創(chuàng)傷的發(fā)生密切相關(guān)，通過TAP含量測定不僅可以診斷胰腺創(chuàng)傷和急性胰腺炎的病情，還可以對患者預(yù)后進行有效評估，因此有研究者開始把該分子作為急性胰腺炎和胰腺創(chuàng)傷的特異性診斷物并取得良好的效果。目前對TAP的檢測方法主要是酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，但該方法耗時較長(4 5小時)，還需要特定的吸光度檢測儀器和專業(yè)人員操作，另外價格也較貴，因此不能滿足對病情快速診斷的要求，更不適合在基層醫(yī)療機構(gòu)使用。申請人在使用中發(fā)現(xiàn)，公開號CN101609093A的發(fā)明專利申請在實際使用中存在以下問題，因?qū)游瞿?、吸水墊、過濾墊均由易吸濕的材料制備，在實際使用中常常因環(huán)境濕度較大和存放時間較長而降低材料的性能，繼而影響測試卡的測試準確度實驗發(fā)現(xiàn)使用依照CN101609093A的測試卡測試約100個樣品，使用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)驗證有近15%的假陽性(誤差率)，而且使用依照CN101609093A的測試卡不能同時對待測樣品作平行和對照測試，降低了測試的準確性。更不能實現(xiàn)對測試樣品大致定量的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種適合現(xiàn)場使用的，檢測方便快速、靈敏度和準確度高、性能穩(wěn)定、成本低廉的快速診斷胰腺創(chuàng)傷和急性胰腺炎的測試卡及其制備方法，該測試卡通過設(shè)置多個加樣孔，可同時進行待測樣品的平行測試和陰性、陽性對照測試，通過設(shè)置防水薄膜，以及使用微孔濾膜作為過濾墊，使測試結(jié)果更加準確可靠。本發(fā)明所依據(jù)的原理是待檢樣品中的TAP與結(jié)合墊上的膠體金標記的TAP單克隆抗體特異性結(jié)合，結(jié)合物以及被樣品中的水份溶解的膠體金標記的單克隆抗體在層析作用的推動下向試紙另一端移動，當(dāng)移動至包被TAP多克隆抗體的測試線時，形成雙抗體夾心復(fù)合物并聚集顯色，而游離的膠體金標記的TAP單克隆抗體在移動到質(zhì)控線時與兔抗小鼠免疫球蛋白抗體捕獲并顯色以表明測試卡的有效性。本發(fā)明的技術(shù)方案為一種快速診斷胰腺創(chuàng)傷和急性胰腺炎的測試卡及其制備方法，包括塑料外殼，所述塑料外殼上部設(shè)置有加樣孔和觀察窗，其中所述加樣孔的數(shù)量為至少三個，所述多個加樣孔沿所述塑料外殼寬度的方向等距離分布在所述塑料外殼的一端，所述加樣孔和所述觀察窗上固定有一層透明的防水薄膜；底襯，所述底襯以粘接的方式固定于所述塑料外殼內(nèi)底部；檢測模塊，所述檢測模塊包括層析膜、結(jié)合墊、樣品墊、過濾墊和吸水墊，所述結(jié)合 墊、樣品墊和過濾墊從下至上依次粘接在所述層析膜上面對應(yīng)于所述加樣孔的一端，其中所述過濾墊位于所述檢測模塊的最上層，并對應(yīng)于所述加樣孔的位置，所述吸水墊設(shè)置于所述層析膜上面的另一端，所述層析膜上設(shè)置有測試線和質(zhì)控線，所述測試線為包被的TAP多克隆抗體，所述質(zhì)控線為包被的兔抗小鼠免疫球蛋白抗體，所述層析膜與底襯粘接在一起。優(yōu)選的是，所述的快速診斷胰腺創(chuàng)傷和急性胰腺炎的測試卡中，所述底襯上設(shè)置有多個縱向平行排列的凹槽；所述檢測模塊為多個，其數(shù)量與所述底襯的凹槽數(shù)量一致，并分別粘貼于所述底襯的各個凹槽內(nèi)，彼此之間由所述凹槽的側(cè)壁隔開，所述加樣孔對應(yīng)于所述凹槽內(nèi)檢測模塊上部的位置。優(yōu)選的是，所述的快速診斷胰腺創(chuàng)傷和急性胰腺炎的測試卡中，所述結(jié)合墊、樣品墊和過濾墊的長度小于所述層析膜的長度，對應(yīng)于所述塑料外殼上部加樣孔的位置，且其邊緣不超過所述觀察窗的左側(cè)邊緣；所述吸水墊的長度小于所述層析膜的長度，且其邊緣不超過所述觀察窗的右側(cè)邊緣。優(yōu)選的是，所述的快速診斷胰腺創(chuàng)傷和急性胰腺炎的測試卡中，所述檢測模塊中的過濾墊為微孔濾膜，濾膜孔徑為O. 2-0. 45 μ。優(yōu)選的是，所述的快速診斷胰腺創(chuàng)傷和急性胰腺炎的測試卡中，所述吸水墊由至少一層濾紙包被干燥劑而成，呈長方體，其底面與所述層析膜接觸。優(yōu)選的是，所述的快速診斷胰腺創(chuàng)傷和急性胰腺炎的測試卡中，所述測試線與質(zhì)控線設(shè)置于層析膜上對應(yīng)于所述觀察窗的位置，其中所述測試線數(shù)量為三條，每條測試線之間的距離為3-6mm，按照從左到右的順序三條測試線的TAP多克隆抗體的濃度分別為l-10nmol/L、10-50nmol/L和50-100nmol/L ;所述質(zhì)控線數(shù)量為一條,位于所述測試線右側(cè)的位置，所述質(zhì)控線與最右側(cè)測試線之間的距離為3-8mm。優(yōu)選的是，所述的快速診斷胰腺創(chuàng)傷和急性胰腺炎的測試卡的制備方法中，所述TAP多克隆抗體測試線的制備過程如下步驟一、合成人源TAP，并以合成的人源TAP作為抗原；步驟二、制備膠體金溶膠；步驟三、制備TAP單克隆抗體，a、采用常規(guī)的戊二醛交聯(lián)法，將人源TAP分別與血藍蛋白和血清蛋白交聯(lián)制成TAP-KLL偶聯(lián)物和TAP-BSA偶聯(lián)物；
b、用TAP-KLH偶聯(lián)物免疫Balb/c小鼠；C、取免疫小鼠脾細胞和商品SP2/0骨髓瘤細胞在聚乙二醇PEG-4000作用下，按照常規(guī)方法進行細胞融合，生成雜交瘤細胞株懸液；d、采用間接酶聯(lián)免疫吸附法篩選抗TAP的雜交瘤細胞株；e、將雜交瘤細胞株接種于用福氏不完全佐劑預(yù)處理I周后的Balb/c小鼠腹腔內(nèi)，收集腹水按照單克隆抗體亞類的不同采用辛酸法或硫酸銨法或聚乙二醇PEG沉淀法純化腹水即收獲TAP單克隆抗體。步驟四、將TAP單克隆抗體用磷酸鹽緩沖液溶解作為母液加入膠體金溶膠，去上清液后用磷酸鹽緩沖液復(fù)溶即制成膠體金標記的TAP單克隆抗體；步驟五、將磷酸鹽緩沖液制備溶液復(fù)溶，復(fù)溶后與福氏完全佐劑混合，然后將此混合物在家兔的不同部位進行皮下注射，重復(fù)多次后收集家兔血液，去除血凝塊后通過離心 機收集含多克隆抗體的抗血清，將抗血清純化后得到TAP多克隆抗體溶液；步驟六、將TAP多克隆抗體溶液制成不同濃度后包被在層析膜上即成測試線。優(yōu)選的是，所述的快速診斷胰腺創(chuàng)傷和急性胰腺炎的測試卡的制備方法中，所述兔抗小鼠免疫球蛋白抗體質(zhì)控線的制備過程如下步驟一、將Balb/c小鼠的免疫球蛋白作為抗原，對家兔不同部位進行皮下注射，重復(fù)多次后收集家兔血液；步驟二、通過離心機離心收集兔血中的抗血清；步驟三、將收集到的抗血清進行純化；步驟四、將純化后所得到的溶液包被在層析膜上，即成質(zhì)控線。本發(fā)明具有以下有益效果通過在一個測試卡中設(shè)置平行的多個加樣孔和多條檢測模塊，可以實現(xiàn)以下功能(I)加入待檢測樣品，并加入陰性對照和陽性對照作為對照參考，提高了檢測的準確度和靈敏度；(2)可同時加入待檢測的多個樣品作為平行，提高檢測效率，或?qū)ν粯悠愤M行多次測試，以提高測試準確度；(3)加入待檢測的樣品，并同時加入高低TAP含量的標準對照品，觀察待檢測樣品與標準對照品的顯色情況，從而判斷是低于低標準對照品，介于高低標準對照品之間，或高于高標準對照品，從而對胰腺炎和胰腺創(chuàng)傷的急慢性和輕重度做出大致的判斷，為臨床診斷確診提供依據(jù)。通過在加樣孔和觀察窗的位置設(shè)置透明的防水薄膜，能防止檢測模塊受潮造成檢測的結(jié)果不準確，從而提高了檢測卡的性能穩(wěn)定性；通過在檢測模塊的樣品墊上方設(shè)置微孔濾膜作為過濾墊，能夠過濾待檢測樣品中干擾檢測反應(yīng)的一些大分子物質(zhì)，提高了檢測的準確率。本發(fā)明利用免疫學(xué)中抗原抗體能特異結(jié)合的原理，利用成熟的膠體金免疫層析技術(shù)，以人源TAP作為抗原，制備檢測TAP含量的測試卡，可快速半定量檢測病人尿液和腹腔滲出液中的TAP來反映急性胰腺炎和胰腺創(chuàng)傷的病情發(fā)展程度，整個測試過程只需10 15分鐘，使本發(fā)明具有靈敏度與準確度高、特異性強、性能穩(wěn)定、價格低廉及不需要任何輔助儀器設(shè)備等優(yōu)點，非常適合在基層醫(yī)療機構(gòu)現(xiàn)場使用。測試約100個樣品，使用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)驗證準確率為100%。


圖I為本發(fā)明所述的快速診斷胰腺創(chuàng)傷和急性胰腺炎的測試卡的結(jié)構(gòu)示意圖2為本發(fā)明所述的快速診斷胰腺創(chuàng)傷和急性胰腺炎的測試卡的正面示意圖。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做詳細說明，以令本領(lǐng)域普通技術(shù)人員參閱本說明書后能夠據(jù)以實施。如圖I所示，一種快速診斷胰腺創(chuàng)傷和急性胰腺炎的測試卡及其制備方法，包括塑料外殼I，所述塑料外殼I上部設(shè)置有加樣孔10和觀察窗9，其中所述加樣孔10的數(shù)量為多個，包括至少一個待測樣品加樣孔、一個陰性對照加樣孔和一個陽性對照加樣孔，可同時加入一個待檢測個體的多個樣品進行平行測試，并進行陰性和陽性對照測試，增加了檢測的準確性，或同時對不同待檢測個體的多個樣品進行檢測，提高了檢測的效率，并降低檢測成本。所述多個加樣孔10沿所述塑料外殼I寬度的方向等距離分布在所述塑料外殼I的一端。所述加樣孔10和所述觀察窗9上固定有一層透明的防水薄膜，使檢測模塊與外界隔絕，起到防潮防塵的作用，增加了檢測模塊的性能穩(wěn)定性和檢測結(jié)果的準確率。底襯，所述底襯以粘接的方式固定于所述塑料外殼I內(nèi)底部；檢測模塊，所述檢測模塊包括層析膜2、結(jié)合墊5、樣品墊4、過濾墊3和吸水墊7，所述結(jié)合墊5、樣品墊4和過濾墊3從下至上依次 粘接在所述層析膜2上面的一端，其中所述過濾墊3位于所述檢測模塊的最上層，并對應(yīng)于所述加樣孔10的位置，所述吸水墊7粘接在層析膜2上面的另一端，所述層析膜2上設(shè)置有測試線8和質(zhì)控線6，所述測試線8為包被的TAP多克隆抗體，所述質(zhì)控線6為包被的兔抗小鼠免疫球蛋白抗體，所述層析膜2與底襯粘接在一起。所述檢測模塊中樣品墊4、結(jié)合墊5和層析膜2的選擇材料及處理方法如下樣品墊4 :由玻璃纖維紙制成，用pH 7. O 8. 4的PBS浸泡2min后取出，80°C以下烘干或者其它方式干燥。結(jié)合墊5 :由玻璃纖維紙制成，用pH 7.0 8.4的？85浸泡211^11后取出，801以下烘干，冷卻后浸入到10 lOOnmol/L濃度范圍的膠體金標記的TAP單克隆抗體溶液中，IOmin后取出在室溫下干燥。層析膜2:材料為硝酸纖維素膜(NC膜)，用0.8% (g/ml)的戊二醛溶液浸泡30min，取出，室溫下干燥，在上面包被3條不同濃度的TAP多克隆抗體線作為測試線8，同時包被I條兔抗小鼠免疫球蛋白抗體線作為質(zhì)控線6。所述的快速診斷胰腺創(chuàng)傷和急性胰腺炎的測試卡中，所述底襯上設(shè)置有多個縱向平行排列的凹槽；所述檢測模塊為多個，其數(shù)量與所述底襯的凹槽數(shù)量一致，并分別粘貼于所述底襯的各個凹槽內(nèi)，彼此之間由所述凹槽的側(cè)壁隔開，所述加樣孔10對應(yīng)于所述凹槽內(nèi)檢測模塊上部的位置。所述凹槽的側(cè)壁具有一定高度，所述檢測模塊由所述凹槽的側(cè)壁隔開，彼此之間不相互接觸，從而使加入的各個樣品不會相互滲透干擾。所述的快速診斷胰腺創(chuàng)傷和急性胰腺炎的測試卡中，所述結(jié)合墊5、樣品墊4和過濾墊3的長度小于所述層析膜2的長度，對應(yīng)于所述塑料外殼I上部加樣孔10的位置，且其邊緣不超過所述觀察窗9的左側(cè)邊緣；所述吸水墊7的長度小于所述層析膜2的長度，且其邊緣不超過所述觀察窗9的右側(cè)邊緣，使層析膜2上部相對于觀察窗9的位置形成一開放的空間，可以直觀地觀察檢測的結(jié)果。所述的快速診斷胰腺創(chuàng)傷和急性胰腺炎的測試卡中，所述檢測模塊中的過濾墊3為微孔濾膜，濾膜孔徑為O. 2-0. 45 μ。所述微孔濾膜可選混合纖維素微孔濾膜，濾膜孔徑為
O.2-0. 45 μ，所述微孔濾膜表面平滑，質(zhì)地輕薄，孔隙率高，且微孔結(jié)構(gòu)均勻，具有流速快，不易吸附的特點，可以有效過濾待檢測樣品中的一些能夠干擾檢測反應(yīng)的大分子物質(zhì)所述的快速診斷胰腺創(chuàng)傷和急性胰腺炎的測試卡中，所述吸水墊7由至少一層濾紙包被干燥劑而成，呈長方體，其底面與所述層析膜2接觸。所述干燥劑可選擇硅膠、生石灰粉、氯化鎂、活性炭等，因其具有良好的吸水性，一方面能夠起到虹吸作用，另一方面能夠保持檢測模塊的干燥，增加檢測模塊的穩(wěn)定性。所述的快速診斷胰腺創(chuàng)傷和急性胰腺炎的測試卡及其制備方法中，所述測試線8與質(zhì)控線6設(shè)置于層析2上對應(yīng)于所述觀察窗99的位置，其中所述測試線8數(shù)量為三條，在3條測試線8上采用噴涂機(市售)包被TAP多克隆抗體，3條測試線8上包被物的濃度依次遞增，每條測試線8之間的距離為3-6mm，按照從左到右的順序三條測試線8的TAP多克隆抗體的濃度分別為I-IOnmol/L、10-50nmol/L和50-100nmol/L ;所述質(zhì)控線6數(shù)量為 一條，位于所述測試線8右側(cè)的位置，質(zhì)控線6包被范圍為I 100nmol/L的兔抗小鼠免疫球蛋白抗體，所述質(zhì)控線6與最右側(cè)測試線8之間的距離為3-8mm。當(dāng)3條測試線8任意一條呈現(xiàn)紅色時，表示樣品為陽性；當(dāng)測試線8第I條顯色，第2、3條測試線8不顯色時，表示待測樣品中TAP的含量大于2nmol/L ;當(dāng)?shù)?、2條測試線8顯色，第3條測試線8不顯色時，表明待測樣品中的TAP含量大于25nmol/L ;當(dāng)3條測試線8均顯色時，表示待測樣品中TAP含量大于90nmol/L ;質(zhì)控線6始終顯色，若不顯色表明試紙條失效。籍此,加入待檢測的樣品，并同時加入高低TAP含量的標準對照品，觀察待檢測樣品與標準對照品的顯色情況，從而判斷是低于低標準對照品，介于高低標準對照品之間，或高于高標準對照品，從而對胰腺炎和胰腺創(chuàng)傷的急慢性和輕重度做出大致的判斷，為臨床診斷確診提供依據(jù)。所述TAP多克隆抗體測試線8的制備方法如下步驟一、合成人源TAP，并以合成的人源TAP作為抗原；步驟二、制備膠體金溶膠；步驟三、制備TAP單克隆抗體；步驟四、將TAP單克隆抗體用磷酸鹽緩沖液溶解作為母液加入膠體金溶膠，去上清液后用磷酸鹽緩沖液復(fù)溶即制成膠體金標記的TAP單克隆抗體，具體操作為將TAP單克隆抗體用磷酸鹽緩沖液(O. 01mol/L, pH 7. O 7. 5)溶解并稀釋至2 4mg/ml，作為母液。每IOOml膠體金溶膠加入I 3ml抗體母液，振蕩2min，用0. 2mol/L的K2C03調(diào)節(jié)pH至 8.4，振蕩 5min，加入 2ml 11% (g/ml)聚乙二醇 PEG-10000 (市售)，振蕩 5min，8000 15000rpm離心15min,除去上清后用磷酸鹽緩沖液復(fù)溶。在6000 13000rpm離心15min,去上清，將沉淀用磷酸鹽緩沖液稀釋后即得膠體金標記的TAP單克隆抗體。步驟五、將磷酸鹽緩沖液制備溶液復(fù)溶，復(fù)溶后與福氏完全佐劑混合，然后將此混合物在家兔的不同部位進行皮下注射，重復(fù)多次后收集家兔血液，去除血凝塊后通過離心機收集含多克隆抗體的抗血清，將抗血清純化后得到TAP多克隆抗體溶液；步驟六、將TAP多克隆抗體溶液制成不同濃度后包被在層析膜2上即成測試線8。所述的快速診斷胰腺創(chuàng)傷和急性胰腺炎的測試卡及其制備方法中，所述TAP單克隆抗體的制備方法如下步驟一、采用常規(guī)的戊二醛交聯(lián)法，將TAP與血藍蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)交聯(lián)，具體方法為將5mg合成的TAP分別加入到7mg的KLH和BSA中，邊振蕩邊緩慢加入Iml新鮮配制的O. 3% (g/ml)戊二醛溶液，室溫下反應(yīng)2h，以pH8. 5硼酸緩沖液透析過夜即得。制成的TAP-KLH偶聯(lián)物和TAP-BSA偶聯(lián)物分別用于小鼠免疫和單克隆抗體篩選；步驟二、用TAP-KLH偶聯(lián)物免疫Balb/c小鼠，用TAP-KLH偶聯(lián)物免疫6周齡的Balb/C小鼠，首先用300 μ g的TAP-KLH偶聯(lián)物與福氏完全佐劑等量混合成的油包水乳化液進行腹腔注射。之后每隔4周，用同樣劑量的TAP-KLH偶聯(lián)物與福氏不完全佐劑等量混合進行腹腔注射。如此共免疫4次，最后I次腹腔和尾靜脈各注射TAP-KLH偶聯(lián)物150 μ g進行加強免疫，3天后取脾細胞進行細胞融合；步驟三、取免疫小鼠脾細胞和購買的SP2/0骨髓瘤細胞在聚乙二醇PEG_4000(市售)作用下，按照常規(guī)方法進行細胞融合。用市售的HAT培養(yǎng)基(即含有黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶脫氧核苷的細胞培養(yǎng)基)進行培養(yǎng)，I周后換用市售采用HT培養(yǎng)基(即含有次黃嘌呤和胸腺嘧啶脫氧核苷的細胞培養(yǎng)基)培養(yǎng)；
步驟四、采用間接酶聯(lián)免疫吸附法篩選分泌抗TAP的單克隆抗體雜交瘤細胞株，具體操作為將10 μ g/ml的TAP-BSA偶聯(lián)物按常規(guī)方法包被在市售聚乙烯軟板的孔中，采用pH 9. 6,0. 02mol/L碳酸鹽緩沖液為包被緩沖液。在包被好的孔中加入待檢樣品100 μ 1，37°C孵育lh，洗滌，加羊抗小鼠酶標抗體(市售，工作濃度為I : 1000稀釋)100 μ 1，37°C孵育45min，洗滌，加底物3’，3’，5，5’ _四甲基聯(lián)苯胺(TMB) 100 μ 1，37。。孵育15min，加入2mol/L的硫酸100 μ I終止反應(yīng)，在波長450nm處比色以篩選分泌TAP單克隆抗體的雜交瘤細胞株，用有限稀釋法進行克隆化，共進行4次克?。徊襟E五、將雜交瘤細胞懸液接種于預(yù)先以福氏不完全佐劑預(yù)處理I周后的Balb/C小鼠腹腔內(nèi)，收集腹水，按照單克隆抗體亞類的不同采用辛酸/硫酸銨法或者聚乙二醇PEG沉淀法純化腹水即收獲TAP單克隆抗體。所述的快速診斷胰腺創(chuàng)傷和急性胰腺炎的測試卡及其制備方法中，所述兔抗小鼠免疫球蛋白抗體質(zhì)控線6的制備方法如下步驟一、將Balb/c小鼠的免疫球蛋白作為抗原，對家兔不同部位進行皮下注射，重復(fù)多次后收集家兔血液；步驟二、通過離心機離心收集兔血中的抗血清；步驟三、將收集到的抗血清進行純化；步驟四、將純化后所得到的溶液包被在層析膜2上，即成質(zhì)控線6。應(yīng)用實例(一 )配制不同濃度的樣品液進行檢測I、用磷酸鹽緩沖液(O. 01mol/L, pH 7. O 7. 5)配制濃度為lnmol/L的TAP溶液作為待測樣品液，取2 3滴直接滴在測試卡的加樣孔10上，放置IOmin后觀察，質(zhì)控線6顯色而測試線8無明顯色帶出現(xiàn)，表明樣品中TAP含量低于2nmol/L。2、用磷酸鹽緩沖液(O. 01mol/L,pH 7. O 7. 5)配制濃度為10nmol/L的TAP溶液作為待測樣品液，取2 3滴直接滴在測試卡的加樣孔10上，放置IOmin后觀察，第I條測試線8和質(zhì)控線6均顯色。表明樣品中TAP含量在2 25nmol/L之間。3、用磷酸鹽緩沖液(0. 01mol/L,pH 7. O 7. 5)配制濃度為50nmol/L的TAP溶液作為待測樣品液，取2 3滴直接滴在測試卡的加樣孔10上，放置IOmin后觀察，第1、2條測試線8和質(zhì)控線6均顯色，表明樣品中TAP含量在25 90nmol/L之間。4、用磷酸鹽緩沖液(O. 01mol/L, pH 7. O 7. 5)配制濃度為IOOnmoI/L的TAP溶液作為待測樣品液，取2 3滴直接滴在測試卡的加樣孔10上，放置IOmin后觀察，3條測試線8和質(zhì)控線6均顯色，表明樣品中TAP大于90nmol/L。(二)干擾測定將正常人的尿液以及用pH 7. O 8. 4的PBS配制成濃度為10、50、100nmol/L的人胰蛋白酶、人蛋白酶原-I、人蛋白酶原-2、 人血清白蛋白、人免疫球蛋白溶液，用測試卡進行檢測，結(jié)果均為陰性，表明上述物質(zhì)均不對測試造成干擾。(三)病人標本檢測I、尿液標本取2 3滴病人尿液直接滴在測試卡的加樣孔10上,放置IOmin后觀察，若無測試線8顯色，表明尿液中的TAP含量低于2nmol/L，診斷為無急性胰腺炎和胰腺創(chuàng)傷發(fā)生；若僅第I條測試線8顯色，表明尿液中的TAP含量在2 25nmol/L之間，診斷為可能發(fā)生急性胰腺炎和胰腺創(chuàng)傷;若僅第1、2條測試線8顯色，表明尿液中的TAP含量在25 90nmol/L之間，診斷為極有可能發(fā)生急性胰腺炎和胰腺創(chuàng)傷；若3條測試線8均顯色，表明尿液中的TAP含量高于90nmol/L，診斷為重癥急性胰腺炎和胰腺創(chuàng)傷；若質(zhì)控線6無顯色，表明測試卡失效。2、腹腔滲出液標本取2 3滴病人腹腔滲出液直接滴在測試卡的加樣孔10上，放置IOmin后觀察，若無測試線8顯色，表明腹腔滲出液中的TAP含量低于2nmol/L，診斷為無急性胰腺炎和胰腺創(chuàng)傷發(fā)生；若僅第I條測試線8顯色，表明腹腔滲出液中的TAP含量在2 25nmol/L之間，診斷為可能發(fā)生急性胰腺炎和胰腺創(chuàng)傷；若僅第1、2條測試線8顯色，表明腹腔滲出液中的TAP含量在25 90nmol/L之間，診斷為極有可能發(fā)生急性胰腺炎和胰腺創(chuàng)傷；若3條測試線8均顯色，表明腹腔滲出液中的TAP含量高于90nmol/L，診斷為重癥急性胰腺炎和胰腺創(chuàng)傷；若質(zhì)控線6無顯色，表明測試卡失效。盡管本發(fā)明的實施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實施方式中所列運用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域，對于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地實現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細節(jié)和這里示出與描述的圖例。
權(quán)利要求
1.一種快速診斷胰腺創(chuàng)傷和急性胰腺炎的測試卡，其特征在于，包括 塑料外殼，所述塑料外殼上部設(shè)置有加樣孔和觀察窗，其中所述加樣孔的數(shù)量為至少三個，所述多個加樣孔沿所述塑料外殼寬度的方向等距離分布在所述塑料外殼的一端，所述加樣孔和所述觀察窗上固定有一層透明的防水薄膜； 底襯，所述底襯以粘接的方式固定于所述塑料外殼內(nèi)底部； 檢測模塊，所述檢測模塊包括層析膜、結(jié)合墊、樣品墊、過濾墊和吸水墊，所述結(jié)合墊、樣品墊和過濾墊從下至上依次粘接在所述層析膜上面對應(yīng)于所述加樣孔的一端，其中所述過濾墊位于所述檢測模塊的最上層，并對應(yīng)于所述加樣孔的位置，所述吸水墊設(shè)置于所述層析膜上面的另一端，所述層析膜上設(shè)置有測試線和質(zhì)控線，所述測試線為包被的TAP多克隆抗體，所述質(zhì)控線為包被的兔抗小鼠免疫球蛋白抗體，所述層析膜與底襯粘接在一起。
2.如權(quán)利要求I所述的快速診斷胰腺創(chuàng)傷和急性胰腺炎的測試卡，其特征在于，所述底襯上設(shè)置有多個縱向平行排列的凹槽；所述檢測模塊為多個，其數(shù)量與所述底襯的凹槽數(shù)量一致，并分別粘貼于所述底襯的各個凹槽內(nèi)，彼此之間由所述凹槽的側(cè)壁隔開，所述加樣孔對應(yīng)于所述凹槽內(nèi)檢測模塊上部的位置。
3.如權(quán)利要求2所述的快速診斷胰腺創(chuàng)傷和急性胰腺炎的測試卡，其特征在于，所述結(jié)合墊、樣品墊和過濾墊的長度小于所述層析膜的長度，對應(yīng)于所述塑料外殼上部加樣孔的位置，且其邊緣不超過所述觀察窗的左側(cè)邊緣；所述吸水墊的長度小于所述層析膜的長度，且其邊緣不超過所述觀察窗的右側(cè)邊緣。
4.如權(quán)利要求3所述的快速診斷胰腺創(chuàng)傷和急性胰腺炎的測試卡，其特征在于，所述檢測模塊中的過濾墊為微孔濾膜，濾膜孔徑為O. 2-0. 45 μ。
5.如權(quán)利要求4所述的快速診斷胰腺創(chuàng)傷和急性胰腺炎的測試卡，其特征在于，所述吸水墊由至少一層濾紙包被干燥劑而成，呈長方體，其底面與所述層析膜接觸。
6.如權(quán)利要求5所述的快速診斷胰腺創(chuàng)傷和急性胰腺炎的測試卡，其特征在于，所述測試線與質(zhì)控線設(shè)置于層析膜上對應(yīng)于所述觀察窗的位置，其中所述測試線數(shù)量為三條，每條測試線之間的距離為3-6mm，按照從左到右的順序三條測試線的TAP多克隆抗體的濃度分別為I-IOnmol/L、10-50nmol/L和50-100nmol/L ;所述質(zhì)控線數(shù)量為一條，位于所述測試線右側(cè)的位置，所述質(zhì)控線與最右側(cè)測試線之間的距離為3-8_。
7.如權(quán)利要求2或6所述的快速診斷胰腺創(chuàng)傷和急性胰腺炎的測試卡的制備方法，其中所述TAP多克隆抗體測試線的制備過程如下 步驟一、合成人源TAP，并以合成的人源TAP作為抗原； 步驟二、制備膠體金溶膠； 步驟三、制備TAP單克隆抗體 a、采用常規(guī)的戊二醛交聯(lián)法，將人源TAP分別與血藍蛋白和血清蛋白交聯(lián)制成TAP-KLL偶聯(lián)物和TAP-BSA偶聯(lián)物； b、用TAP-KLH偶聯(lián)物免疫Balb/c小鼠； C、取免疫小鼠脾細胞和商品SP2/0骨髓瘤細胞在聚乙二醇PEG-4000作用下，按照常規(guī)方法進行細胞融合，生成雜交瘤細胞株懸液； d、采用間接酶聯(lián)免疫吸附法篩選抗TAP的雜交瘤細胞株； e、將雜交瘤細胞株接種于用福氏不完全佐劑預(yù)處理I周后的Balb/c小鼠腹腔內(nèi)，收集腹水按照單克隆抗體亞類的不同采用辛酸法或硫酸銨法或聚乙二醇PEG沉淀法純化腹水即收獲TAP單克隆抗體。
步驟四、將TAP單克隆抗體用磷酸鹽緩沖液溶解作為母液加入膠體金溶膠，去上清液后用磷酸鹽緩沖液復(fù)溶即制成膠體金標記的TAP單克隆抗體； 步驟五、將磷酸鹽緩沖液制備溶液復(fù)溶，復(fù)溶后與福氏完全佐劑混合，然后將此混合物在家兔的不同部位進行皮下注射，重復(fù)多次后收集家兔血液，去除血凝塊后通過離心機收集含多克隆抗體的抗血清，將抗血清純化后得到TAP多克隆抗體溶液； 步驟六、將TAP多克隆抗體溶液制成不同濃度后包被在層析膜上即成測試線。
8.如權(quán)利要求2或6所述的快速診斷胰腺創(chuàng)傷和急性胰腺炎的測試卡的制備方法，其中所述兔抗小鼠免疫球蛋白抗體質(zhì)控線的制備過程如下 步驟一、將Balb/c小鼠的免疫球蛋白作為抗原，對家兔不同部位進行皮下注射，重復(fù)多次后收集豕兔血液； 步驟二、通過離心機離心收集兔血中的抗血清； 步驟三、將收集到的抗血清進行純化； 步驟四、將純化后所得到的溶液包被在層析膜上，即成質(zhì)控線。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速診斷胰腺創(chuàng)傷和急性胰腺炎的測試卡及其制備方法，包括塑料外殼、底襯和檢測模塊，其中塑料外殼上有加樣孔和觀察窗，觀察窗上和加樣孔上固定有透明的防水薄膜。所述底襯上設(shè)置有多個縱向平行排列的凹槽；所述檢測模塊為多個，其數(shù)量與所述底襯凹槽的數(shù)量一致，各個檢測模塊粘接于所述底襯的各個凹槽內(nèi)。檢測模塊包括層析膜、結(jié)合墊、樣品墊、過濾墊和吸水墊。層析膜上設(shè)置有測試線和質(zhì)控線，測試線為包被的TAP多克隆抗體，質(zhì)控線為包被的兔抗小鼠免疫球蛋白抗體。本發(fā)明可快速準確地診斷胰腺創(chuàng)傷和急性胰腺炎的病癥，可同時加入多個樣品和陰性、陽性對照，具有檢測方便快速、靈敏度準確率高、性能穩(wěn)定、成本低廉的優(yōu)點。
文檔編號G01N33/68GK102879583SQ201210355770
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月21日
發(fā)明者田伏洲, 任建東 申請人:田伏洲, 任建東