專利名稱：一種花生對黃曲霉侵染的抗性的鑒定方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種花生對黃曲霉侵染的抗性的鑒定方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
花生對黃曲霉侵染的抗性是指花生種仁在受到具有產(chǎn)生黃曲霉毒素能力的黃曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(A. parasiticus)侵染后,能夠抑制上述真菌產(chǎn)生黃曲霉的特性。具有對黃曲霉侵染抗性的花生品種能夠顯著降低花生產(chǎn)品中的黃曲霉污染水平。目前鑒定花生對黃曲霉侵染的抗性的方法主要是通過人工接種后檢測黃曲霉的含量，其檢測方法為薄層色譜法和高效液相色譜法，其操作復(fù)雜、樣品檢測費用高、對設(shè)備要求高，不能有效應(yīng)用于花生育種研究中的抗性鑒定。也有通過人工接種后用肉眼觀察估計黃曲霉侵染種仁的數(shù)量和程度，雖然操作簡單，但是由于視覺觀察差異較大，其結(jié)果誤差大， 不能有效的評價花生對黃曲霉侵染的抗性。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種花生對黃曲霉侵染的抗性的鑒定方法。本發(fā)明的另一目的在于提供所述的花生對黃曲霉侵染的抗性的鑒定方法的應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)一種花生對黃曲霉侵染的抗性的鑒定方法，包括以下步驟(I)選擇侵染能力強的黃曲霉菌株；(2)花生種子的選擇、消毒和復(fù)水；
(3)以黃曲酶菌株接種花生種子；(4)暗培養(yǎng)；(5)將暗培養(yǎng)后的種子稱重；(6)計算黃曲霉感染指數(shù)；(7)抗性評價；優(yōu)選的，一種花生對黃曲霉侵染的抗性的鑒定方法，包括以下步驟(I)選擇侵染能力強的黃曲霉菌株進行培養(yǎng)，接種時配制成黃曲霉孢子懸浮液備用；(2)選擇健康的花生種子，剝?nèi)ス?，取種皮完好的種子作為樣品，分裝于已編號的培養(yǎng)皿中，用克菌丹對花生種子消毒后用蒸餾水沖洗干凈，使種子復(fù)水后的含水量為15% 25%，分別稱重，培養(yǎng)皿中樣品種子的重量記為Wi (如WOl、W02、……);選擇高感品種的花生種子作為對照，裝在已編號的培養(yǎng)皿中，用克菌丹對花生種子消毒后用蒸餾水沖洗干凈，使種子復(fù)水后的含水量為15% 25%，稱重，培養(yǎng)皿中對照種子的重量記為WCK ；(3)將步驟(I)制備的黃曲霉孢子懸浮液加入步驟(2)中裝有樣品的培養(yǎng)皿里，轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿使孢子均勻附著在種子表面；對照的操作同樣品，區(qū)別僅在于加入的是無菌水；(4)將培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱中進行暗培養(yǎng)；(5)將暗培養(yǎng)后的種子稱重，樣品種子的重量記為Wif (如W01f、W02f、……)，對照種子的重量記為WCKf ；(6)黃曲霉感染指數(shù)(F)按如下公式進行計算
絕對感染指數(shù)Fi= (Wif-Wi)/Wi相對感染指數(shù)Fi= [(Wif-Wi)/Wi]/[(WCKf-WCK)/WCK]；(7)抗性評價:F在O O. 150的為高抗(HR)，0. 151 O. 300為中抗(MR)，O. 301 O. 500 為中感(MS)，0. 501 I. 000 為高感(HS)；步驟(I)中所述的侵染能力強的黃曲霉菌株優(yōu)選為黃曲霉菌株As33. 2890 ；步驟(I)中所述的培養(yǎng)優(yōu)選在察氏培養(yǎng)基中、28°C黑暗培養(yǎng)；步驟(I)中所述的黃曲霉孢子懸浮液的配制優(yōu)選采用以下方法進行配制接種時，用無菌水收集培養(yǎng)7 8天的孢子，無菌水重懸，并調(diào)整孢子濃度使每毫升水中含有IXlO8個孢子，即得；步驟(2)中所述的分裝的量優(yōu)選為每個培養(yǎng)皿30 50粒；·步驟(2)中所述的高感品種優(yōu)選為汕油523 ；步驟(3)中所述的黃曲霉孢子懸浮液的加入量優(yōu)選為每個培養(yǎng)皿加Iml ；步驟(4)中所述的暗培養(yǎng)的溫度優(yōu)選為25 32°C，時間優(yōu)選為8天。所述的花生對黃曲霉侵染的抗性的鑒定方法可應(yīng)用于花生育種研究中的抗性鑒定，尤其適合應(yīng)用于對花生育種材料作批量篩選。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果本發(fā)明采用計量儀器分析天平，通過稱重的方法檢測黃曲霉侵染的程度，可以在較為簡單的實驗條件下有效的鑒定花生品種對黃曲霉侵染的抗性，尤其適合對花生育種材料作批量篩選，操作簡單，抗性鑒定成本低，實驗結(jié)果精確度高。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。實施例I(I)以侵染力強的黃曲霉菌株As33. 2890 (中國科學院微生物研究所)為接種用菌株；將黃曲霉菌株As33. 2890置于察氏培養(yǎng)基中、28°C黑暗培養(yǎng)，接種時用無菌水收集培養(yǎng)7天的孢子，無菌水重懸，調(diào)整孢子濃度使每毫升水中含有I X IO8個孢子，作為黃曲霉孢子懸浮液備用；(2)選擇花生品種臺山三粒肉(廣東省農(nóng)科院作物研究所)種子，選擇健康的花生種子，剝?nèi)スぃx取種皮完好的種子作為樣品，分裝3個已編號的培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿40粒種子，用克菌丹對花生種子消毒后用蒸餾水沖洗干凈，使種子含水量為20%，分別稱重，培養(yǎng)皿中樣品種子的重量記為W01=22. 1203g、W02=22. 2315g、W03=22. 2543g ;選擇高感品種汕油523 (廣東省汕頭市農(nóng)業(yè)科學研究所)40粒種子作為對照，裝在已編號的一個培養(yǎng)皿中，稱重,培養(yǎng)皿中對照種子的重量記為WCK=28. 6400g (見表I);將花生種子排列于的無菌培養(yǎng)皿中；(3)往步驟(2)中裝有樣品的每個培養(yǎng)皿加入Iml步驟(I)制備的黃曲霉孢子懸浮液，轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿使孢子均勻附著在種子表面；對照的操作同樣品，區(qū)別僅在于加入的是無菌水；(4)將培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱中，25°C暗培養(yǎng)8天；(5)將暗培養(yǎng)后的種子稱重，樣品種子的重量分別記為WOlf = 25. 8807g、W02f =28. 4786g、W03f = 25. 7259g (見表 I )，將對照種子的重量記為 WCKf，WCKf = 58. 2824g，相應(yīng)的 WCK=28. 6400g ；(6)黃曲霉感染指數(shù)(F)的計算如樣本01，Wi=W01=22. 1203g,W01f = 25. 8807g,WCK=28. 6400g,WCKf = 58. 2824g,代入公式分別計算絕對感染指數(shù)和相對感染指數(shù)則絕對感染指數(shù)RU= (WOlf-WOl)/WOl=O. 1700，
相對感染指數(shù)RU= [(WOlf-WOl)/W01]/[(WCKf-WCK)/WCK] = 0.1643，依此類推，計算樣本02、03的感染指數(shù)(見表I)；抗性評價臺山三粒肉品種的絕對感染指數(shù)和相對感染指數(shù)都在O. 151 O. 300之間，屬于中抗(HR)。表I臺山三粒肉品種的抗性鑒定結(jié)果
—樣本編號種子重接種8天后重量絕對感染指數(shù)相對感染指數(shù)
0122.120325.88070.17000.16430222.2315 28.4786 0.2810 0.2715 0322.2543 25.72 0.1560 0.1507 CK28.6400_58.2824_1.0350_1.0000實施例2(I)以侵染力強的黃曲霉菌株As33. 2890 (中國科學院微生物研究所)為接種用菌株；將黃曲霉菌株As33. 2890置于察氏培養(yǎng)基中、28°C黑暗培養(yǎng)，接種時用無菌水收集培養(yǎng)7天的孢子，無菌水重懸，調(diào)整孢子濃度使每毫升水中含有I X IO8個孢子，作為黃曲霉孢子懸浮液備用；(2)選擇花生品種湛秋48 (廣東省農(nóng)科院作物研究所)種子，選擇健康的花生種子，剝?nèi)スぃx取種皮完好的種子作為樣品，分裝3個已編號的培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿30粒種子，用克菌丹對花生種子消毒后用蒸餾水沖洗干凈，使種子含水量為20%，分別稱重，培養(yǎng)皿中樣品種子的重量記為W01=18. 3600g、W02=18. 4800g、W03=18. 6000g ;選擇高感品種汕油523 (廣東省汕頭市農(nóng)業(yè)科學研究所)30粒種子作為對照，裝在已編號的一個培養(yǎng)皿中，用克菌丹對花生種子消毒后用蒸餾水沖洗干凈，使種子含水量為20%，稱重，培養(yǎng)皿中對照種子的重量記為WCK=19. 1400g (見表2)；(3)往步驟(2)中裝有樣品的每個培養(yǎng)皿加入Iml步驟(I)制備的黃曲霉孢子懸浮液，轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿使孢子均勻附著在種子表面；對照的操作同樣品，區(qū)別僅在于加入的是無菌水；(4)將培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱中，32°C暗培養(yǎng)8天；(5)將暗培養(yǎng)后的種子稱重，樣品種子的重量分別記為WOlf = 24. 5767g、W02f =26. 4190g、W03f = 27. 8126g (見表 2)，對照種子的重量記為 WCKf，WCKf = 38. 5547g，相應(yīng)的 WCK=19. 1400g ；(6)按照黃曲霉感染指數(shù)(F)公式計算樣本01 W01=18. 3600g,W01f = 24. 5767g,WCK=19. 1400g,WCKf = 38. 5547g，則代入公式分別計算絕對感染指數(shù)和相對感染指數(shù)則絕對感染指數(shù)RU= (WOlf-WOl)/WOl=O. 3386，相對感染指數(shù)RU= [(WOlf-WOl)/W01]/[(WCKf-WCK)/WCK] = 0.3338，
依此類推，計算樣本02、03的感染指數(shù)(見表2)；抗性評價湛秋48的感染指數(shù)在O. 301 O. 500之間，屬于中感(MS)。表2湛秋48的抗性鑒定結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種花生對黃曲霉侵染的抗性的鑒定方法，其特征在于包括以下步驟 (1)選擇侵染能力強的黃曲霉菌株進行培養(yǎng)，接種時配制成黃曲霉孢子懸浮液備用； (2)選擇健康的花生種子，剝?nèi)ス?，取種皮完好的種子作為樣品，分裝于已編號的培養(yǎng)皿中，用克菌丹對花生種子消毒后用蒸餾水沖洗干凈，使種子復(fù)水后的含水量為15% 25%，分別稱重，培養(yǎng)皿中樣品種子的重量記為Wi ;選擇高感品種的花生種子作為對照，裝在已編號的培養(yǎng)皿中，用克菌丹對花生種子消毒后用蒸餾水沖洗干凈，使種子復(fù)水后的含水量為15% 25%，稱重，培養(yǎng)皿中對照種子的重量記為WCK ； (3)將步驟(I)制備的黃曲霉孢子懸浮液加入步驟(2)中裝有樣品的培養(yǎng)皿里，轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿使孢子均勻附著在種子表面；對照的操作同樣品，區(qū)別僅在于加入的是無菌水； (4)將培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱中進行暗培養(yǎng)； (5)將暗培養(yǎng)后的種子稱重，樣品種子的重量記為Wif，對照種子的重量記為WCKf； (6)黃曲霉感染指數(shù)F按如下公式進行計算 絕對感染指數(shù)Fi= (Wif-Wi)/Wi，相對感染指數(shù) Fi= [ (ffif-ffi) /Wi]/[ (WCKf-WCK) /WCK]； (7)抗性評價:F在O O.150的為高抗，O. 151 O. 300為中抗，O. 301 O. 500為中感,0. 501 I. 000為高感。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的花生對黃曲霉侵染的抗性的鑒定方法，其特征在于步驟(I)中所述的侵染能力強的黃曲霉菌株為黃曲霉菌株As33. 2890。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的花生對黃曲霉侵染的抗性的鑒定方法，其特征在于步驟(I)中所述的培養(yǎng)在察氏培養(yǎng)基中、28 °C黑暗培養(yǎng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的花生對黃曲霉侵染的抗性的鑒定方法，其特征在于步驟(I)中所述的黃曲霉孢子懸浮液的配制采用以下方法進行配制接種時，用無菌水收集培養(yǎng)7 8天的孢子，無菌水重懸，并調(diào)整孢子濃度使每毫升水中含有I X IO8個孢子，即得。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的花生對黃曲霉侵染的抗性的鑒定方法，其特征在于步驟(2)中所述的分裝的量為每個培養(yǎng)皿30 50粒。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的花生對黃曲霉侵染的抗性的鑒定方法，其特征在于步驟(2)中所述的高感品種為汕油523。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的花生對黃曲霉侵染的抗性的鑒定方法，其特征在于步驟(3)中所述的黃曲霉孢子懸浮液的加入量為每個培養(yǎng)皿加1ml。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的花生對黃曲霉侵染的抗性的鑒定方法，其特征在于步驟(4)中所述的暗培養(yǎng)的溫度為25 32°C，時間為8天。
9.權(quán)利要求I 8任一項所述的花生對黃曲霉侵染的抗性的鑒定方法的應(yīng)用，其特征在于所述的花生對黃曲霉侵染的抗性的鑒定方法在花生育種研究的抗性鑒定中進行應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的花生對黃曲霉侵染的抗性的鑒定方法的應(yīng)用，其特征在于所述的花生對黃曲霉侵染的抗性的鑒定方法在對花生育種材料作批量篩選中進行應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種花生對黃曲霉侵染的抗性的鑒定方法及其應(yīng)用。本發(fā)明以黃曲酶菌株接種花生種子后進行暗培養(yǎng)，然后采用計量儀器分析天平，將暗培養(yǎng)后的種子稱重，最后計算黃曲霉感染指數(shù)并進行抗性評價。本發(fā)明可以在較為簡單的實驗條件下有效的鑒定花生品種對黃曲霉侵染的抗性，尤其適合對花生育種材料作批量篩選，操作簡單，抗性鑒定成本低，實驗結(jié)果準確，精確度高。
文檔編號G01N5/00GK102818740SQ20121033264
公開日2012年12月12日 申請日期2012年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月10日
發(fā)明者周桂元, 梁炫強 申請人:廣東省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所