梯度凝膠及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種梯度凝膠及其制備方法，其特征在于，將水、丙烯酰胺分離膠貯備液、分離膠緩沖液、SDS、過硫酸銨按比例分別調(diào)配成濃度為8％-15％的2種或2種以上分離膠，再迅速將調(diào)配出來的2種或2種以上不同濃度的分離膠依次按濃度從大到小灌入垂直板電泳的玻璃板夾縫中，加水，待分離膠凝固后，加入濃縮膠，等待濃縮膠凝固。該方法有利于加快電泳速度，加強蛋白分子的穿透能力，提高蛋白轉(zhuǎn)印率和蛋白轉(zhuǎn)印質(zhì)量。
【專利說明】梯度凝膠及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明公開了一種梯度凝膠及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]自身抗體指針對自身組織、器官、細胞及細胞成分的抗體。人體的生長、發(fā)育和生存有完整的自身免疫耐受機制的維持，正常的免疫反應(yīng)有保護性防御作用，即對自身組織、成分不發(fā)生反應(yīng)。一旦自身耐受的完整性遭到破壞，則機體視自身組織、成分為“異物”，而發(fā)生自身免疫反應(yīng)，產(chǎn)生自身抗體。在特定情況下，免疫系統(tǒng)對機體自身物質(zhì)識別失效，把它們認為是外來入侵物，從而產(chǎn)生針對這些物質(zhì)的抗體(即自身抗體)，引發(fā)自身免疫。這些自身抗體會攻擊機體自身細胞、組織、器官，引起炎癥反應(yīng)，對機體造成傷害。常見的自身免疫疾病包括有結(jié)締組織疾病類風濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、皮肌炎、硬皮病、神經(jīng)肌肉疾病多發(fā)性硬化癥、重癥肌無力、脫髓鞘疾病、內(nèi)分泌性疾病、原發(fā)性腎上腺皮質(zhì)萎縮、慢性甲狀炎、青少年型糖尿病、消化系統(tǒng)疾病慢性非特異性潰瘍性結(jié)腸炎、慢性活動性肝炎、惡習性貧血與萎縮性胃炎、泌尿系統(tǒng)疾病自身免疫性腎小球腎炎、肺腎出血性綜合癥、血液系統(tǒng)疾病自身免疫性溶血性貧血、特發(fā)性血小板減少性紫癜、特發(fā)性白細胞減少癥等。據(jù)相關(guān)調(diào)查表明，自身抗體疾病患者多為邊遠貧困地區(qū)，用于自身抗體檢測的試劑盒等檢測工具的購買者都為這些地區(qū)的基層醫(yī)療機構(gòu)，其有限的經(jīng)濟購買能力決定了自身抗體檢測產(chǎn)品必須價格低廉，經(jīng)濟實用。
[0003]目前，市面上較為普遍的產(chǎn)品有兩種，一種是直接將純抗原包被到膜條上，將膜條與孵育盤、洗滌液、樣本稀釋液、堿性磷酸酶標記的抗人IgG、顯色劑(BCIP/NBT)、陰性和陽性對照血清及使用說明書組成一個商品化的試劑盒，按操作說明書一步一步對人體待測血清進行相應(yīng)抗體檢測。另一種則是采用免疫印跡法技術(shù)，通過凝膠電泳對混合抗原進行蛋白分子分離，再將分離出來的蛋白分子轉(zhuǎn)印到膜上，將膜晾干，切成條，制作成檢測膜條，再跟試劑盒的其他組成成分配合使用。兩種產(chǎn)品各有優(yōu)缺點。第一種采用純抗原，免去了凝膠電泳和轉(zhuǎn)印的麻煩，無需特殊儀器，便于操作，然而由于采用了純抗原，該產(chǎn)品價格相對較高。相反，第二種采用混合抗原的產(chǎn)品，雖然制作工藝較為繁雜，但其憑借可一次性同時檢測多種自身抗體疾病及低廉的價格等優(yōu)點，受到了經(jīng)濟能力相對有限的地區(qū)基層醫(yī)療機構(gòu)及患者的歡迎。
[0004]然而，針對第二種產(chǎn)品，采用免疫印跡法技術(shù)對混合抗原進行凝膠電泳轉(zhuǎn)印的過程中，電泳和轉(zhuǎn)印的等待時間較長，其中電泳通常需要4.5小時，過程較為費時，效率較低。另外，均一凝膠的設(shè)置，若濃度過大會阻礙蛋白分子電泳的速度，影響轉(zhuǎn)印率；濃度太小，蛋白分子電泳速度快了，不同分子量大小的蛋白分子則不能在電泳過程中被清晰分離開來，致使蛋白轉(zhuǎn)印無效，可能造成整個免疫印跡過程失去意義。同時，由于采用了濃度均一的凝膠，無論是凝膠電泳還是蛋白轉(zhuǎn)印，不同分子量大小的蛋白分子都必須統(tǒng)一穿過同一濃度的凝膠，電泳速度慢，效率低，同時轉(zhuǎn)印不夠徹底，等待時間長。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種梯度凝膠及其制備方法，可加快電泳速度，加強蛋白分子的穿透能力，提高蛋白轉(zhuǎn)印率和蛋白轉(zhuǎn)印質(zhì)量，同時，工藝簡單，易于操作。
[0006]解決上述問題的技術(shù)方案是:將水、丙烯酰胺貯備液、分離膠緩沖液、一定濃度SDS、過硫酸銨分別調(diào)配成濃度為8% -15%的2種或2種以上分離膠，再迅速將調(diào)配出來的2種或2種以上不同濃度的分離膠依次按濃度從大到小灌入垂直板電泳的玻璃板夾縫中，加水，待分離膠凝固后，加入濃縮膠，等待濃縮膠凝固，制成濃度遞增的梯度凝膠。其中，調(diào)配出來用于制成梯度凝膠的分離膠濃度越多種，梯度凝膠的濃度階梯便越密集，制成的梯度凝膠越適于分離分子量相差不大或分子量相近的蛋白分子，轉(zhuǎn)印率也愈佳。因此，可根據(jù)實際需要調(diào)配2種或2種以上不同濃度的分離膠制作梯度凝膠。
[0007]其中，所述分離膠由水、丙烯酰胺分離膠貯備液、分離膠緩沖液、SDS、過硫酸銨等調(diào)配而成；所述濃縮膠由水、丙烯酰胺濃縮膠貯備液、濃縮膠緩沖液、SDS、過硫酸銨調(diào)配而成。所述濃縮膠由水、丙烯酰胺濃縮膠貯備液、濃縮膠緩沖液、SDS、過硫酸銨等成分調(diào)配而成。所述分離膠緩沖液和濃縮膠緩沖液的主要成分為Tris-HCl，其中，分離膠的PH值小于7，濃縮膠緩沖液的PH值大于7。所述丙烯酰胺分離膠貯備液由丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺調(diào)配而成。所述丙烯酰胺濃縮膠貯備液由丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺按調(diào)配而成。根據(jù)這一方法制成的梯度凝膠的濃度變化范圍為8%至15%。
[0008]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點是:采用濃度遞增的梯度凝膠，使用逐步篩選的方式對不同分子量大小的蛋白分子進行分離，有利于加快電泳速度，加強蛋白分子的穿透能力，提高蛋白轉(zhuǎn)印率和蛋白轉(zhuǎn)印質(zhì)量。
[0009]由于不同濃度的凝膠適合于分子量范圍不同的蛋白分子，如5%的膠適合于25-200kD的蛋白；10%的膠適合于10-70kD的蛋白；15%的膠適合于10_50kD的蛋白，因此，對不同分子量區(qū)段的蛋白采用不同濃度的凝膠進行分離，可彌補均一膠的缺陷，取得均一膠所不能達到的效果。該方法不僅加快了電泳的效率，同時，在蛋白轉(zhuǎn)印環(huán)節(jié)，梯度凝膠依蛋白分子量大小而設(shè)，使不同分子量蛋白能夠得以較好電泳分離。同時也在一定程度上加強了蛋白分子在凝膠中的穿透能力。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1為運用本發(fā)明實施例1的方法轉(zhuǎn)印出來的蛋白膜條進行包被后滴加帶有抗SSA、抗SSB抗原的血清的試驗結(jié)果。其中，抗SSA陽性結(jié)果對應(yīng)分子量為45、47kD的蛋白分子檢測顯色條帶；抗SSB陽性結(jié)果對應(yīng)分子量為52kD的蛋白分子檢測顯色條帶。
[0011]圖2為運用本發(fā)明實施例3的方法轉(zhuǎn)印出來的蛋白膜條進行包被后滴加帶有抗SSA、抗SSB抗原的血清的試驗結(jié)果。其中，抗SSA陽性結(jié)果對應(yīng)分子量為45、47kD的蛋白分子檢測顯色條帶；抗SSB陽性結(jié)果對應(yīng)分子量為52kD的蛋白分子檢測顯色條帶。
【具體實施方式】
[0012]下面結(jié)合自身抗體檢測的實施例，對本發(fā)明做進一步描述。
[0013]由于用于檢測抗Sm、抗U1RNP、抗SSA、抗SSB、抗rRNP、抗Scl_70、抗Jo-1抗體的相應(yīng)抗原的分子量范圍為13.5kD-86kD，因此，采用8% -15%的梯度凝膠最為合適。配備這一梯度凝膠的方法如下:
[0014]實施例1:
[0015]1、調(diào)配分離膠:將!120、丙烯酰胺貯備液、分離膠緩沖液、10% SDS、過硫酸銨按一定比例調(diào)成8%、10%、13%、15%濃度的分離膠。下面是這兩種不同濃度分離膠的配方:
[0016](I)濃度為8%的分離膠:7.8mL H2O, 3.3mL丙烯酰胺分離膠貯備液，7.0lmL分離膠緩沖液，0.19mL10% SDS, 0.42mL16mL/mL 的過硫酸銨；
[0017](2)濃度為15%的分離膠:0.78mL H20,9.5mL丙烯酰胺分離膠貯備液，7.0lmL分離膠緩沖液，0.19mL10% SDS,0.42mL16mL/mL的過硫酸銨。
[0018]2、調(diào)配濃縮膠:將13.3mL H2O, 1.SmL丙烯酰胺濃縮膠貯備液，2.3mL濃縮膠緩沖液，0.19mL10% SDS, 0.42mL16mL/mL的過硫酸銨調(diào)配成濃縮膠。
[0019]3、取2支試管，命名為A、B，分別加入8%濃度的分離膠7mL(A試管)，15%濃度的分離膠9.5mL(D試管)，將B、A2支試管按分離膠的濃度從高到低依次快速灌入垂直板電泳的玻璃板夾縫中，加水用以平齊分離膠膠面，待分離膠凝固后，灌注濃縮膠，濃縮膠凝固后，即為制備好的，濃度為8%至15%的梯度凝膠。
[0020]實施例2:
[0021]1、調(diào)配分離膠:將!120、丙烯酰胺貯備液、分離膠緩沖液、10% SDS、過硫酸銨按一定比例調(diào)成濃度的分離膠。下面是這 三種不同濃度分離膠的配方:
[0022](I)濃度為8%的分離膠:7.8mL H2O, 3.3mL丙烯酰胺分離膠貯備液，7.0lmL分離膠緩沖液，0.19mL10% SDS, 0.42mL16mL/mL 的過硫酸銨；
[0023](2)濃度為11 %的分離膠:3.2mL H2O, 7.68mL丙烯酰胺分離膠貯備液，7.0lmL分離膠緩沖液，0.19mL10% SDS, 0.42mL16mL/mL的過硫酸銨；
[0024](3)濃度為15%的分離膠:0.78mL H20,9.5mL丙烯酰胺分離膠貯備液，7.0lmL分離膠緩沖液，0.19mL10% SDS,0.42mL16mL/mL的過硫酸銨。
[0025]2、調(diào)配濃縮膠:將13.3mL H2O, 1.SmL丙烯酰胺濃縮膠貯備液，2.3mL濃縮膠緩沖液，0.19mL10% SDS, 0.42mL16mL/mL的過硫酸銨調(diào)配成濃縮膠。
[0026]3、取3支試管，命名為A、B、C，分別加入8%濃度的分離膠5mL(A試管)，11 %濃度的分離膠5.5mL(B試管)，13%濃度的分離膠6mL(C試管)，15%濃度的分離膠6.6mL(D試管)，將C、B、A3支試管按分離膠的濃度從高到低依次快速灌入垂直板電泳的玻璃板夾縫中，加水用以平齊分離膠膠面，待分離膠凝固后，灌注濃縮膠，濃縮膠凝固后，即為制備好的，濃度為8 %、11 %、15 %逐漸變化的梯度凝膠。
[0027]實施例3:
[0028]1、調(diào)配分離膠:將!120、丙烯酰胺貯備液、分離膠緩沖液、10% SDS、過硫酸銨按一定比例調(diào)成8%、10%、13%、15%濃度的分離膠。下面是這四種不同濃度分離膠的配方:
[0029](I)濃度為8%的分離膠:7.8mL H2O, 3.3mL丙烯酰胺分離膠貯備液，7.0lmL分離膠緩沖液，0.19mL10% SDS, 0.42mL16mL/mL 的過硫酸銨；
[0030](2)濃度為10%的分離膠:3.8mL H20,6.65mL丙烯酰胺分離膠貯備液，7.0lmL分離膠緩沖液，0.19mL10% SDS, 0.42mL16mL/mL的過硫酸銨；
[0031](3)濃度為13%的分離膠:1.2mL H20,9.5mL丙烯酰胺分離膠貯備液，7.0lmL分離膠緩沖液，0.19mL10% SDS,0.42mL16mL/mL 的過硫酸銨。[0032](4)濃度為15%的分離膠:0.78mL H20,9.5mL丙烯酰胺分離膠貯備液，7.0lmL分離膠緩沖液，0.19mL10% SDS,0.42mL16mL/mL的過硫酸銨。
[0033]2、調(diào)配濃縮膠:將13.3mL H2O, 1.8mL丙烯酰胺濃縮膠貯備液，2.3mL濃縮膠緩沖液，0.19mL10% SDS, 0.42mL16mL/mL的過硫酸銨調(diào)配成濃縮膠。
[0034]3、取4支試管，命名為A、B、C、D，分別加入8 %濃度的分離膠1.65mL(A試管)，10%濃度的分離膠3.3mL(B試管)，13%濃度的分離膠4.95mL(C試管)，15%濃度的分離膠
6.6mL(D試管)，將D、C、B、A4支試管按分離膠的濃度從高到低依次快速灌入垂直板電泳的玻璃板夾縫中，加水用以平齊分離膠膠面，待分離膠凝固后，灌注濃縮膠，濃縮膠凝固后，即為制備好的，濃度為逐漸變化的梯度凝膠。
[0035]以上僅為本發(fā)明的具體實施例，并不以此限定本發(fā)明的保護范圍；在不違反本發(fā)明構(gòu)思的基礎(chǔ)上所作的任何替換與改進，均屬本發(fā)明的保護范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種梯度凝膠及其制備方法，其特征在于，將水、丙烯酰胺分離膠貯備液、分離膠緩沖液、SDS、過硫酸銨調(diào)配成濃度為8% -15%的2種或2種以上分離膠，再迅速將調(diào)配出來的2種或2種以上不同濃度的分離膠依次按濃度從大到小灌入垂直板電泳的玻璃板夾縫中，加水，待分離膠凝固后，加入濃縮膠，等待濃縮膠凝固。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的梯度凝膠及其制備方法，其特征在于，所述分離膠由水、丙烯酰胺分離膠貯備液、分離膠緩沖液、SDS、過硫酸銨等成分調(diào)配而成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的梯度凝膠及其制備方法，其特征在于，所述濃縮膠由水、丙烯酰胺濃縮膠貯備液、濃縮膠緩沖液、SDS、過硫酸銨等成分調(diào)配而成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的梯度凝膠及其制備方法，其特征在于，所述分離膠緩沖液的主要成分是Tris-HCl，PH值小于7。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的梯度凝膠及其制備方法，其特征在于，所述濃縮膠緩沖液的主要成分是Tris-HCl，PH值大于7。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的梯度凝膠及其制備方法，其特征在于，所述丙烯酰胺分離膠貯備液由丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺調(diào)配而成。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的梯度凝膠及其制備方法，其特征在于，所述丙烯酰胺濃縮膠貯備液由丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺按調(diào)配而成。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的梯度凝膠及其制備方法，其特征在于，梯度凝膠的濃度變化范圍為8%至15%。
【文檔編號】G01N27/447GK103575792SQ201210271189
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2012年8月1日 優(yōu)先權(quán)日:2012年8月1日
【發(fā)明者】王繼華 申請人:廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司