專利名稱：一種復(fù)方氨基酸(15)雙肽(2)注射液的分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及氨基酸的高效液相色譜分析方法，尤其涉及一種復(fù)方氨基酸(15)雙肽
(2)注射液的高效液相色譜分析方法。
背景技術(shù)：
由于氨基酸分析在生命科學(xué)、食品科學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域研究中的重要作用，因此，對氨基酸分析方法的研究與改進將會繼續(xù)得到人們的重視。目前對氨基酸的分析方法主要有柱后衍生高效陽離子交換色譜法、高效陰離子交換色譜一積分脈沖安培檢測法及柱前衍生反相高效液相色譜法。柱后衍生高效陽離子交換色譜法是利用氨基酸在酸性條件下形成陽離子而在陽離子交換柱中分離，分離后的氨基酸用茚三酮衍生、紫外可見光度檢測器檢測，此技術(shù)商品化形式氨基酸分析儀已在20世紀(jì)60年代初問世。這類儀器和裝置的缺點是設(shè)備操作復(fù)雜，價格昂貴且應(yīng)用范圍比較單一，不能同時分離多種復(fù)合氨基酸，分析時間長。高效陰離子交換色譜一積分脈沖安培檢測法是基于氨基酸分子中的羧基在強堿性介質(zhì)中可以形成陰離子，而氨基酸分子中的氨基在強堿性介質(zhì)中通過施加一定的電位，可在貴金屬電極表面發(fā)生氧化反應(yīng)，從而實現(xiàn)氨基酸的陰離子交換色譜分離和積分脈沖檢測的一項技術(shù)。此技術(shù)所采用的積分脈沖安培檢測器穩(wěn)定性差，且分析時間較長。柱前衍生反相高效液相色譜法是首先將氨基酸與衍生化試劑進行反應(yīng)，然后在反相色譜體系下分離分析衍生化產(chǎn)物的一項技術(shù)。此技術(shù)分離度高、選擇性好及靈敏快速，且與局限于氨基酸分析的自動分析儀不同，高效液相色譜儀的適用性極廣。復(fù)方氨基酸(15)雙肽(2)注射液為15種氨基酸和2種二肽組成的滅菌水溶液，處方為每IOOOml含有L-丙氨酸(C3H7NO2) 16. 00g, L-精氨酸(C6H14N4O2) 11. 30g, L-天冬氨酸(C4H7NO4)3. 40g，L-谷氨酸(C5H9N04)5 . 60g，L-組氨酸(C6H9N3O2)6. 80g，L-異亮氨酸(C6H13NO2)5. 60g，L-亮氨酸(C6H13NO2 )7. 90g，L-賴氨酸醋酸鹽(C6H14N2O2 -C2H4O2 )12. 70g，L_ 蛋氨酸(C5H11NO2S)5. 60g，L-苯丙氨酸(C9H11NO2) 5. 85g，L-脯氨酸(C5H9NO2) 6. 80g，L_ 絲氨酸(C3H7NO3) 4. 50g，L-蘇氨酸(C4H9NO3) 5. 60g, L-色氨酸(C11H12N2O2) I. 90g, L-纈氨酸(C5H11NO2) 7. 30g 甘氨酰-谷氨酰胺.H2O (C7H13N3O4-H2O) 30. 27g，甘氨酰-酪氨酸*2H20 3. 45g，(相當(dāng)于甘氨酸0. 94g;酪氨酸 2. 28g)。該產(chǎn)品含18種人體必須或非必須氨基酸組成的腸外營養(yǎng)注射劑，根據(jù)患者腸外營養(yǎng)的需要提供相應(yīng)的氨基酸，其中甘氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸三種氨基酸以甘氨酰-谷氨酰胺、甘氨酰-酪氨酸的雙肽形式存在。兩種雙肽(甘氨酰-谷氨酰胺、甘氨酰-酪氨酸)用于提供谷氨酰胺和酪氨酸以促進蛋白質(zhì)的合成，在體內(nèi)直接完全分解為甘氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸三種游離氨基酸。由于復(fù)方氨基酸(15)雙肽(2)注射液中成分復(fù)雜，對其各組分進行定量分析較為困難，目前還沒有文獻(xiàn)報道能夠完成該產(chǎn)品中各組分的含量的分析檢測。葉曉林等人在《復(fù)方氨基酸(15)雙肽(2)注射液中兩組分的含量測定》(中國藥業(yè)，2008年07期)中報道了用反相高效液相色譜法測定復(fù)方氨基酸(15)雙肽(2)注射液中兩種二肽，即甘氨酰-谷氨酰胺(GQ)和甘氨酰-酪氨酸(GY)的含量，該文獻(xiàn)公開的方法，使用乙腈與0. 05mol/L的磷酸二氫鈉溶液(用磷酸調(diào)節(jié)PH值至2. 2)作為流動相，采用了梯度淋洗法，并且還采用了 FDNB(2，4-二硝基氟苯)進行了柱前衍生化處理，該方法檢測方法復(fù)雜，操作步驟多，而且不能同時檢測出十五種氨基酸的含量。陸明等人在《藥物分析雜志》，2011年05期中報道先用強酸型離子交換樹脂處理樣品，除去復(fù)方氨基酸(15)雙肽(2)注射液中左旋氨基酸和雙肽，再用高效液相色譜法同時測定焦谷氨酸和環(huán)(甘氨酰-谷氨酰胺)2種雜質(zhì)的含量，但是未涉及主藥的含量測定。

發(fā)明內(nèi)容
為了填補上述技術(shù)上的空白，我們提供了一種專門用于檢測復(fù)方氨基酸(15)雙肽
(2)注射液中十五種氨基酸及兩種雙肽的柱前衍生反相高效液相色譜法。以異硫氰酸苯酯作為柱前衍生試劑，且能同時分離出十五種氨基酸及兩種雙肽的混合物。該技術(shù)已通過周密的方法學(xué)驗證，結(jié)果表明可用于同時檢測復(fù)方氨基酸(15)雙肽(2)注射液中十五種氨基酸及兩種雙肽的含量，考察穩(wěn)定性樣品中十七種主藥含量的變化。本發(fā)明涉及一種復(fù)方氨基酸(15)雙肽(2)注射液中十五種氨基酸及兩種雙肽的含量測定方法，其特征是采用柱前衍生高效液相色譜檢測，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的反相色譜柱，以異硫氰酸苯酯作為柱前衍生試劑，采用紫外檢測器檢測，檢測波長為244^264nm,流動相由乙腈和W組成，W是通過酸、堿、鹽或緩沖溶液調(diào)節(jié)的pH5. 5^7. 5水溶液，梯度洗脫，采用的梯度淋洗程序包含下面的過程
權(quán)利要求
1.一種復(fù)方氨基酸(15)雙肽(2)注射液中十五種氨基酸及兩種雙肽的含量測定方法，其特征是采用柱前衍生高效液相色譜檢測，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的反相色譜柱，以異硫氰酸苯酯作為柱前衍生試劑，采用紫外檢測器檢測，檢測波長為24r264nm，流動相由乙腈和W組成，W是通過酸、堿、鹽或緩沖溶液調(diào)節(jié)的pH5. 5 7. 5水溶液，梯度洗脫，采用的梯度淋洗程序包含下面的過程
2.如權(quán)利要求I所述的測定方法，其特征是所述梯度淋洗程序包含下面的過程時間/min乙腈占流動相的體積比％ —
3.如權(quán)利要求r2任一所述的含量測定方法，其特征是所用的檢測波長優(yōu)選252 256nm。
4.如權(quán)利要求1-3任一所述的含量測定方法，其特征是W為pH5.5^7. 5的醋酸鹽緩沖溶液，磷酸鹽緩沖溶液，Tris-鹽酸緩沖溶液或檸檬酸鹽緩沖溶液。
5.如權(quán)利要求4所述的含量測定方法，其特征是W為pH為6.5的醋酸鹽緩沖溶液。
6.如權(quán)利要求4-5任一所述的含量測定方法，其特征是所述緩沖溶液的濃度為.0. 05mol/L^0. 2mol/L。
7.如權(quán)利要求1-6任一所述的含量測定方法，其特征是色譜柱溫度在25°C飛0°C之間。
8.如權(quán)利要求I所述的含量測定方法，其特征是釆用以下條件釆用異硫氰酸苯酯作為柱前衍生試劑；釆用紫外檢測器檢測，檢測波長為254mn ；檢測溫度為40°C ；流動相流動相由流動相A相和流動相B相組成，A相乙腈B 相:W，W 是 pH6. 5±0. 05 的 CH3COONa-CH3COOH 緩沖溶液；釆用梯度淋洗程序包含下面的過程
9.如權(quán)利要求I所述的含量測定方法，其特征是釆用以下條件釆用異硫氰酸苯酯作為柱前衍生試劑；釆用紫外檢測器檢測，檢測波長為254mn ；檢測溫度為40°C ；流動相流動相由流動相A相和流動相B相組成，A相:乙腈-水(80 :20，體積比)，B 相W-乙腈(93 :7，體積比)，W 是 pH6. 5±0. 05 的 CH3COONa-CH3COOH 緩沖溶液；釆用梯度淋洗程序包含下面的過程
10.如權(quán)利要求I所述的含量測定方法，其特征是優(yōu)選采用以下條件采用異硫氰酸苯酯作為柱前衍生試劑；釆用紫外檢測器檢測，檢測波長為254mn ； 檢測溫度為40°C ； 流動相流動相由流動相A相和流動相B相組成， A相:乙腈-水(80 :20，體積比)， B 相W-乙腈(93 :7，體積比)，W 是 0.1 mo I/L pH6. 5 ±0. 05 的 CH3COONa-CH3COOH 緩沖溶液； 釆用梯度淋洗程序包含下面的過程
全文摘要
一種復(fù)方氨基酸(15)雙肽(2)注射液的分析方法，采用柱前衍生高效液相色譜檢測，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的反相色譜柱，以異硫氰酸苯酯作為柱前衍生試劑，采用紫外檢測器檢測，檢測波長為244~264nm，流動相由乙腈和W組成，W是水或通過酸、堿、鹽或緩沖溶液調(diào)節(jié)的pH5.5~7.5水溶液，通過梯度洗脫進行檢測。
文檔編號G01N30/02GK102749397SQ201210250589
公開日2012年10月24日 申請日期2012年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月19日
發(fā)明者李靜, 郭志強, 陳立營 申請人:天津金耀集團有限公司