專利名稱：氨基甲酸乙酯檢測試紙的制備及其檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種食品尤其是發(fā)酵食品中的氨基甲酸乙酯的快速定性和半定量的檢測試紙的制備和檢測方法。
背景技術：
氨基甲酸乙酯(EC)的分子式是C3H7NO2,不僅是煙草的天然成分，也存在于發(fā)酵食品(酸牛奶，醬油等)和酒精飲料(黃酒，清酒，葡萄酒等)中。人體攝取EC的主要途徑是飲用酒精飲料。研究表明氨基甲酸乙酯在生物體內(nèi)約有O. 5%被細胞色素P450氧化為乙?；被姿嵋阴?，再進一步形成乙?；被姿嵋阴キh(huán)氧化物，通過這種途徑形成的環(huán)氧化物能夠在生物體內(nèi)形成DNA加聚物，導致DNA結(jié)構(gòu)的雙鏈損壞，進而導致細胞的癌變；另有O. 1%左右的氨基甲酸乙酯被細胞色素P450氧化為N-羥基氨基甲酸乙酯，這種物質(zhì)能夠誘導由二價銅離子(Cu2+)調(diào)控的DNA的損傷，引起癌變。氨基甲酸乙酯對人的危害主要由人飲入酒精飲料引起的，在酒精飲料中氨基甲酸乙酯的形成途徑主要有以下三點I、焦碳酸二乙酯和氨反應生成氨基甲酸乙酯O (CO2C2H5) 2+NH3 — H2NC02C2H5+C02+C2H50H2、氨甲酰磷酸和乙醇反應生成氨基甲酸乙酯h2nco2po3h2+c2h5oh — h2nco2c2h5+h3po43、尿素和乙醇反應生成氨基甲酸乙酯h2nconh2+c2h5oh — h2nco2c2h5+nh3現(xiàn)在對氨基甲酸乙酯的檢測技術主要有以下幾種方法(I) 二氯甲烷提取-氣質(zhì)聯(lián)用技術將已知酒精濃度的待測樣品加水稀釋后，用正己烷洗滌，然后用二氯甲烷進行提取、濃縮、定容，再用氣相色譜-質(zhì)譜檢測器測定，外標法進行定量，其檢出限為10μ g · kg-1，此方法的回收率較低，色素等雜質(zhì)較多。(2)固相萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術采用固相萃取技術對酒精飲料中氨基甲酸乙酯進行提取和凈化處理，后用GC/MS進行定性、定量分析的方法精度和效率都有了很大程度的提高，但萃取柱在每次使用時都需要清洗，給測定帶來了一定的困難。該方法能夠檢測出最低濃度為2. O μ g · kg—1，回收率達到了 90. 0% 101. 3%。(3) 二維或多維-氣質(zhì)聯(lián)用技術(MDGC/MS):采用二維色譜技術可以直接測定白酒中的氨基甲酸乙酯的含量，因二維色譜技術分離能力較強，可以避免復雜的化學前處理，力口快了測定的速度。但是，此方法有一定的局限性，只適合高濃度EC的酒類，并且偏差較大。(4)高效液相色譜結(jié)合熒光檢測器此方法的原理是氨基甲酸乙酯和9-羥基咕噸在酸性條件下生成產(chǎn)生熒光的物質(zhì)，利用熒光檢測器可對氨基甲酸乙酯進行定性和定量分析。研究表明，此方法測定的準確性無法與氣質(zhì)聯(lián)用法相比。上述氨基甲酸乙酯的定性或定量檢測的共同不足是涉及到大量儀器及繁瑣的前處理步驟，檢測周期過長，易引入分析測定誤差，不適合快速檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的第一個技術問題在于提供一種氨基甲酸乙酯檢測試紙的制備方法。本發(fā)明要解決的第二個技術問題在于提供一種氨基甲酸乙酯檢測試紙的檢測方法。解決上述問題所用的技術方案是本氨基甲酸乙酯試紙的制備方法按如下步驟進行(I)備料活性彡220u/g的乙酰膽堿酯酶，純度為99%的氨基甲酸乙酯，試紙的紙基為吸水性好的中速定性濾紙，底物為Ig · L—1的2，6_ 二氯靛酚乙酸酯；(2)酶溶液的配制乙酰膽堿酯酶的用量10u，體積比為5%的戊二醛2 μ L，質(zhì)量比為1%的BSA IOyL,配成70yL的酶溶液；(3)試紙的制備將上述的酶溶液與定性濾紙在3°C的條件下常規(guī)固定化8h，得到氨基甲酸乙酯檢測試紙。本氨基甲酸乙酯試紙進行檢測的方法按如下步驟進行(I)標準檢測溶液的制備用純度為99%以上的氨基甲酸乙酯配制成濃度分別為0、0· Img · L'O. 2mg · L'O. 3mg · L'O. 4mg · L-1 的五種水溶液,水為去離子水；(2)標準比色卡的制作將上述五種氨基甲酸乙酯濃度的標準水溶液用制備的酶片試紙依次檢測，試紙上會呈現(xiàn)五種不同的顏色，以相應濃度的標準溶液的檢測情況所呈現(xiàn)的不同顏色制作成標準色卡；濃度為零時，試紙呈現(xiàn)深藍色；濃度為0. Img · Γ1時，試紙呈現(xiàn)的淡藍色；濃度為0. 2mg · Γ1時，藍色更淡，幾乎分辨不清；濃度為0. 3mg · Γ1時，試紙呈現(xiàn)淡淡的橙紅色；濃度為0. 4mg · Γ1時，試紙呈現(xiàn)橙紅色；(3)試紙有效性的確認在對待測樣品進行檢測之前，首先對試紙的有效性進行 確認，對于同批次制作的試紙至少進行一次確認；隨機抽取一張制作好的試紙，滴加半滴到一滴上述氨基甲酸乙酯濃度的標準溶液，再向試紙上滴加半滴到一滴底物溶液，觀察顏色變化并與標準比色卡上的氨基甲酸乙酯濃度的顏色對比，若試紙變色達到標準程度，試紙檢測效果良好，可用于檢測；若顏色比標準色度變淡或不變色，則試紙失效，應廢棄不用；(4)比色與含量的框定將待測樣品進行檢測，以試紙所呈現(xiàn)的顏色與標準比色卡對照，即得出所測樣品中氨基甲酸乙酯的大致含量。本發(fā)明的有益效果是與以往氨基甲酸乙酯的檢測方法相比，試紙體積小可隨身攜帶，檢測方法簡單迅速，只需進行目測加以辨別，簡化了檢測程序。生產(chǎn)和應用本檢測試紙對環(huán)境和人不會造成污染和危害。檢測試紙應用面廣，可以提供食品安全監(jiān)管部門用于基本的氨基甲酸乙酯的定性和半定量檢測，還可以推廣入戶，自行檢測和防范，也可以推廣到食品、飲料的生產(chǎn)和銷售等行業(yè)應用。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明作進一步詳述本氨基甲酸乙酯試紙的制備方法按如下步驟進行(I)備料活性彡220u/g的乙酰膽堿酯酶，純度為99%的氨基甲酸乙酯，試紙的紙基為吸水性好的中速定性濾紙，底物為Ig · L—1的2，6_ 二氯靛酚乙酸酯；(2)酶溶液的配制乙酰膽堿酯酶的用量10u，體積比為5%的戊二醛2 μ L，質(zhì)量比為1%的BSA IOyL,配成70yL的酶溶液；(3)試紙的制備將上述的酶溶液與定性濾紙在3°C的條件下常規(guī)固定化8h，得到氨基甲酸乙酯檢測試紙。本氨基甲酸乙酯試紙進行檢測的方法按如下步驟進行(I)標準檢測溶液的制備用純度為99%以上的氨基甲酸乙酯配制成濃度分別為0、0· Img · L'O. 2mg · L'O. 3mg · L'O. 4mg · L-1 的五種水溶液,水為去離子水；(2)標準比色卡的制作將上述五種氨基甲酸乙酯濃度的標準水溶液用制備的酶片試紙依次檢測，試紙上會呈現(xiàn)五種不同的顏色，以相應濃度的標準溶液的檢測情況所呈 現(xiàn)的不同顏色制作成標準色卡；濃度為零時，試紙呈現(xiàn)深藍色；濃度為0. Img · Γ1時，試紙呈現(xiàn)的淡藍色；濃度為0. 2mg · Γ1時，藍色更淡，幾乎分辨不清；濃度為0. 3mg · Γ1時，試紙呈現(xiàn)淡淡的橙紅色；濃度為0. 4mg · Γ1時，試紙呈現(xiàn)橙紅色；(3)試紙有效性的確認在對待測樣品進行檢測之前，首先對試紙的有效性進行確認，對于同批次制作的試紙至少進行一次確認；隨機抽取一張制作好的試紙，滴加半滴到一滴上述氨基甲酸乙酯濃度的標準溶液，再向試紙上滴加半滴到一滴底物溶液，觀察顏色變化并與標準比色卡上的氨基甲酸乙酯濃度的顏色對比，若試紙變色達到標準程度，試紙檢測效果良好，可用于檢測；若顏色比標準色度變淡或不變色，則試紙失效，應廢棄不用；(4)比色與含量的框定將待測樣品進行檢測，以試紙所呈現(xiàn)的顏色與標準比色卡對照，即得出所測樣品中氨基甲酸乙酯的大致含量。用氨基甲酸乙酯試紙檢測的化學原理
權(quán)利要求
1.一種氨基甲酸こ酯試紙的制備方法，其特征是按如下步驟進行 (1)備料活性>220u/g的こ酰膽堿酯酶，純度為99%的氨基甲酸こ酷，試紙的紙基為吸水性好的中速定性濾紙，底物為Ig ·じ1的2，6_ ニ氯靛酚こ酸酯； (2)酶溶液的配制こ酰膽堿酯酶的用量10u，體積比為5%的戊ニ醛2yL，質(zhì)量比為I %的BSA 10 μ L，配成70 μ L的酶溶液； (3)試紙的制備將上述的酶溶液與定性濾紙在:TC的條件下常規(guī)固定化8h，得到氨基甲酸こ酯檢測試紙。
2.用權(quán)利要求書I所述的氨基甲酸こ酯試紙制備方法制得的試紙，其特征是檢測方法按如下步驟進行 (1)標準檢測溶液的制備用純度為99%以上的氨基甲酸こ酯配制成濃度分別為O、O. Img ·じ1、O. 2mg ·じ1、O. 3mg ·じ1、O. 4mg ·じ1的五種水溶液,水為去離子水； (2)標準比色卡的制作將上述五種氨基甲酸こ酯濃度的標準水溶液用制備的酶片試紙依次檢測，試紙上會呈現(xiàn)五種不同的顔色，以相應濃度的標準溶液的檢測情況所呈現(xiàn)的不同顔色制作成標準色卡；濃度為零時，試紙呈現(xiàn)深藍色；濃度為O. Img ·じ1時，試紙呈現(xiàn)的淡藍色；濃度為O. 2mg ·じ1吋，藍色更淡，幾乎分辨不清；濃度為O. 3mg ·じ1吋，試紙呈現(xiàn)淡淡的橙紅色；濃度為O. 4mg ·じ1吋，試紙呈現(xiàn)橙紅色； (3)試紙有效性的確認在對待測樣品進行檢測之前，首先對試紙的有效性進行確認，對于同批次制作的試紙至少進行一次確認；隨機抽取ー張制作好的試紙，滴加半滴到一滴上述氨基甲酸こ酯濃度的標準溶液，再向試紙上滴加半滴到一滴底物溶液，觀察顏色變化并與標準比色卡上的氨基甲酸こ酯濃度的顏色對比，若試紙變色達到標準程度，試紙檢測效果良好，可用于檢測；若顔色比標準色度變淡或不變色，則試紙失效，應廢棄不用； (4)比色與含量的框定將待測樣品進行檢測，以試紙所呈現(xiàn)的顔色與標準比色卡對照，即得出所測樣品中氨基甲酸こ酯的大致含量。
全文摘要
一種氨基甲酸乙酯試紙的制備方法，按如下三個步驟進行一是備料，購得活性≥220u/g的乙酰膽堿酯酶、純度為99％的氨基甲酸乙酯、吸水性好的中速定性濾紙和2，6-二氯靛酚乙酸酯；二是酯酶溶液的配制；三是試紙的固定化制備。用本方法制得的試紙進行檢測的方法按四個步驟進行一是標準檢測溶液的制備；二是標準比色卡的制作；三是試紙有效性的確認；四是比色與含量的框定。用本試紙對酒精飲料和發(fā)酵等食品中的氨基甲酸乙酯有害物進行檢測與去除，具有快速、方便、只需目測即可判斷的優(yōu)點，不但適于食品檢測部門應用，食品生產(chǎn)企業(yè)、銷售部門、用戶均可自行檢測，應用推廣面廣。
文檔編號G01N33/52GK102735830SQ20121023767
公開日2012年10月17日 申請日期2012年7月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月4日
發(fā)明者嚴鋒, 敬嬌, 李博斌, 梁東軍, 郭明 申請人:浙江農(nóng)林大學