專利名稱：一種用于診斷肺癌的Tipe3免疫組織化學檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及ー種用于診斷肺癌的Tipe3免疫組織化學檢測試劑盒，屬于醫(yī)學和生物學檢測領域。
背景技術：
肺癌是最常見的肺原發(fā)性惡性腫瘤，近年來，世界各國特別是エ業(yè)發(fā)達國家，肺癌的發(fā)病率和病死率均呈上升趨勢，成為全球癌性死亡中的ー個重要因素，被 稱為“全球頭號癌癥殺手”。近年來，我國肺癌發(fā)病率快速上升，2000年新發(fā)病例180-200萬,死亡140-150萬，發(fā)病率36. 7/10萬，肺癌患者總數居世界第一。肺癌的高死亡率主要是由于肺癌起病隱匿且目前缺乏有效的篩查和早期診斷方法而延誤了最佳治療時機，患者出現癥狀時多為晚期，預后較差。肺癌患者的預后與病變的早晩有明顯的關系，即早期病變通過治療，大多可以獲得長期生存，因此開展肺癌的早期發(fā)現、早期診斷和早期治療成為改善肺癌治療效果的希望所在。近年來，在肺癌的輔助診斷方面，腫瘤標志物的研究十分活躍，目前應用于臨床的肺癌診斷標志物主要有CEA，SCC, CYFRA21 I等，而它們仍有許多局限性許多腫瘤細胞都能產生CEA，在ー些良性腫瘤及非腫瘤疾病中也可見到部分患者有ー時性的升高，吸煙者亦可出現假陽性，因其特異性較低，一般多與其他的腫瘤標志物聯(lián)合檢測才能提高對肺癌的確診率；SCC和CYFRA21 I都是肺鱗癌較特異的標志物，而在其他類型的肺癌陽性率極低。因此，急需尋找ー種對肺癌更敏感和特異性更高的新的腫瘤標志物。

發(fā)明內容
TIPE3是最新發(fā)現的TIPE家族基因，由于缺乏特異性抗體目前對于該基因的研究還未見報道，我們根據人類TIPE3晶體結構及TIPE家族同源性分析，并結合抗體設計篩查軟件，選擇人TIPE3蛋白特異的片段，制備了兔抗人TIPE3的多克隆抗體。我們利用該TIPE3抗體對肺癌進行免疫組織化學診斷，發(fā)現在肺癌的不同病理類型中TIPE3都呈高表達趨勢，而在相應癌旁組織中TIPE3表達降低或缺失。因此，本發(fā)明的目的是提供了ー種肺癌的 TIPE3 (肺癌蛋白標志物 TNFAIP8L3,即 tumor necrosis factor- a induced protein8，簡稱Tipe3)免疫組織化學診斷試劑盒，該試劑盒不僅具有高度的免疫反應特異性、敏感性，而且對多種病理類型的肺癌發(fā)生都能夠準確的檢測出來。本發(fā)明是通過以下技術方案實現的ー種用于診斷肺癌的Tipe3免疫組織化學檢測試劑盒，該試劑盒內容物中包括滅活人組織切片中內源性過氧化物酶和生物素的試劑，阻斷人組織切片中交叉蛋白反應非特異性染色的非特異性蛋白阻斷劑，與人體組織抗原結合的兔抗人的初始抗體以及抗體稀釋液，能與初始抗體連接的辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔單克隆連接抗體，能與辣根過氧化物酶反應并顯色的顯色試劑，能特異性對組織中細胞核染色的試劑；操作時依次加入各試劑，其用量的體積配比關系為內源性過氧化物酶和生物素滅活劑非特異性蛋白阻斷劑初始抗體抗體稀釋液連接抗體顯色試劑細胞核染色劑=5 10 5 10 O. 05 O. I 5 10 5 10 5 20 5 10?？筛鶕嶋H使用情況，按上述比例在每盒內分裝20人份、50人份、100人份等劑量的各試劑。所述滅活人組織切片中內源性過氧化物酶和生物素的試劑為質量濃度為3%的過氧化氫溶液。所述阻斷人組織切片中交叉蛋白反應非特異性染色的非特異性蛋白阻斷劑為山
羊血清。所述與人體組織抗原結合的兔抗人的初始抗體是針對人體肺癌組織中特異性TIPE3抗原所制備的兔抗人特異性TIPE3抗體(該抗體的制備方法為申請人根據人類TIPE3晶體結構及TIPE家族同源性分析，并結合抗體設計篩查軟件，選擇了人TIPE3蛋白特異的片段RPNLKRICEGINKLLDEKVL，如序列表中所示，通過常規(guī)方法制備了兔抗人TIPE3的 多克隆抗體)。所述抗體稀釋液為含O. 1%BSA的磷酸鹽緩沖液(質量體積比，單位g/ml)。所述用于特異性初始抗體與顯色試劑之間的連接橋梁的連接抗體是由連有辣根過氧化物酶的山羊抗兔抗體組成。所述能與辣根過氧化物酶反應并顯色的顯色試劑由雙蒸水，A:DAB底物儲存液，B :穩(wěn)定的過氧化物和C :增色溶液組成的，四者的體積配比關系為雙蒸水A : B : C=17 : I : I : I。可根據染色片子的數量按該比率配制。顯色試劑的調制使用顯色試劑前，將顯色緩沖液裝于另ー試管，再滴入A、B、C，輕輕上下翻轉數次，混合后備用。所述能特異性對組織中細胞核染色的試劑為蘇木素。所述試劑盒用于組織切片免疫組織化學染色診斷的使用方法，步驟如下 (I)制備待檢測的石蠟組織切片；(2)上述組織切片用蒸餾水洗凈后，加入滅活人組織切片中內源性過氧化物酶和生物素的試劑處理10分鐘，然后滴加阻斷人組織切片中交叉蛋白反應非特異性染色的非特異性蛋白阻斷劑，反應15分鐘，吸掉反應液后不沖洗，加入事先用抗體稀釋液稀釋好的與人體組織抗原結合的兔抗人的初始抗體，37°C反應I小時，然后滴加能與初始抗體連接的辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔單克隆連接抗體，反應30分鐘，然后加入配制好的能與辣根過氧化物酶反應并顯色的顯色試劑，反應3 10分鐘，然后加入蘇木素染核3 10分鐘；以上加入各試劑前均用PBS洗組織切片3次，毎次3分鐘，洗完后用干凈的濾紙擦凈組織切片周圍的PBS ;操作過程中每ー步都不能使組織干燥，務必保持組織的濕潤；蘇木素染核之后進行脫水，透明，封片，顯微鏡觀察；所有操作均在室溫下進行；
所述滅活人組織切片中內源性過氧化物酶和生物素的試劑為3%過氧化氫水溶液。所述試劑盒用于腫瘤穿刺脫落細胞檢查的使用方法，步驟如下(I)癌組織腫瘤穿刺細胞涂片染色或載玻片上細胞培養(yǎng)穿刺細胞均勻涂在載玻片上，待干燥后立即固定于10%中性福爾馬林溶液(質量體積比，単位g/ml)中10分鐘；蒸餾水洗凈后，直接進入染色步驟；(2)染色向載玻片上加入滅活人組織切片中內源性過氧化物酶和生物素的試劑處理30分鐘，然后滴加阻斷人組織切片中交叉蛋白反應非特異性染色的非特異性蛋白阻斷劑，反應15分鐘，吸掉反應液后不沖洗，加入事先用抗體稀釋液稀釋好的與人體組織抗原結合的兔抗人的初始抗體，37°C反應I小時，然后滴加能與初始抗體連接的辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔單克隆連接抗體，反應30分鐘，然后加入配制好的能與辣根過氧化物酶反應并顯色的顯色試劑,反應3 10分鐘，然后加入蘇木素染核3 10分鐘；以上加入各試劑前均用PBS洗組織切片3次，毎次3分鐘，洗完后用干凈的濾紙擦凈組織切片周圍的PBS ;操作過程中每ー步都不能使組織干燥，務必保持組織的濕潤；蘇木素染核之后進行脫水，透明，封片，顯微鏡觀察；所有操作均在室溫下進行；所述滅活人組織切片中內源性過氧化物酶和生物素的試劑為3%的過氧化氫溶液。由于本發(fā)明提供了新的肺癌標志物TIPE3特異性抗體，所以將其用于肺癌的免疫 組織化學的體外診斷，開辟了新的肺癌診斷學方法。這是ー種在細胞或組織中某部位存在的特殊蛋白同相應的抗體進行免疫學反應，然后進行顯微鏡觀察的診斷技木。由于TIPE3在各種病理類型肺癌中均呈陽性表達，且在腫瘤早期就能夠檢測發(fā)現且特異性強，敏感度高，因此能夠應用于肺癌的早期診斷，使患者能夠得到有效，及時的治療，減少患者不必要的醫(yī)療費用支出，提高患者的生存質量和延長生存時間，使發(fā)生肺癌的患者生存率増加。TIPE3表達的體外診斷檢測操作簡單，對腫瘤診斷準確，穩(wěn)定，有效。


圖I為應用例3中顯微鏡下TIPE3染色結果判定圖譜，其中，a為0+ ；b為1+ ;c為2+ ；d 為 3+ ;e 為 4+o圖2為應用例4中顯微鏡下TIPE3染色結果判定圖譜，其中，a為肺鱗癌，b為肺鱗癌癌旁；c為肺腺癌，d為肺腺癌癌旁；e為肺細支氣管肺泡癌，f為肺細支氣管肺泡癌癌旁；g為肺腺鱗癌，h為肺腺鱗癌癌旁；i為肺大細胞癌，j為肺大細胞癌癌旁。
具體實施例方式下面結合實施例對本發(fā)明作進ー步描述。下述實施例中無特別說明均為常規(guī)方法，所用試劑及藥品如無特別說明均為常規(guī)試劑。實施例I ー種用于診斷肺癌的Tipe3免疫組織化學檢測試劑盒該試劑盒內容物中包括源性過氧化物酶和生物素滅活劑，非特異性蛋白阻斷劑，兔抗人初始抗體以及抗體稀釋液，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔單克隆連接抗體，顯色試劑，細胞核染色劑，操作時要依次加入各試劑，其用量的體積比為內源性過氧化物酶和生物素滅活劑非特異性蛋白阻斷劑初始抗體抗體稀釋液連接抗體顯色試劑細胞核染色劑=100 100 O. 5 100 100 200 100?？筛鶕嶋H使用情況，按上述比例在每盒內分裝20人份、50人份、100人份等劑量的各試劑。下面是按每盒50人份制備肺癌TIPE3免疫組織化學診斷試劑盒的組成內源性過氧化物酶和生物素滅活劑是由3%過氧化氫水溶液組成。IOml/盒。 非特異性蛋白阻斷劑是由山羊血清組成，抽取羊正常血，分離血清后取得制備。其作用是非特異性阻斷人組織切片中交叉蛋白反應。IOml/盒。初始抗體是針對人體肺癌組織中特異性TIPE3抗原所制備的兔抗人的特異性多克隆抗體。O. 5-1 μ I/例，用抗體稀釋液稀釋后滴加到組織表面。50 μ I/盒。該抗體的制備方法為申請人根據人類ΤΙΡΕ3晶體結構及TIPE家族同源性分析，并結合抗體設計篩查軟件，選擇了人ΤΙΡΕ3蛋白特異的片段RPNLKRICEGINKLLDEKVL (如序列表中所示)，通過常規(guī)方法制備了兔抗人TIPE3的多克隆抗體。抗體稀釋液是由含O. 1%BSA的磷酸鹽緩沖液配制而成，用于稀釋抗體。IOml/盒。連接抗體是由辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔抗體組成，充當特異性初始抗體與顯色試劑之間的連接橋梁。IOml/盒。 顯色試劑是由雙蒸水，A =DAB底物儲存液，B :穩(wěn)定的過氧化物和C :增色溶液組成的DAB溶液。顯色劑的調制比為雙蒸水A : B : C=17 :1:1: 1，DAB是辣根過氧化物酶最敏感、最常用的顯色底物，反應產物為不溶于水、ニ甲苯和醇的棕色沉淀物。雙蒸水17ml/ 盒，A 液 Iml/ 盒，B 液 Iml/ 盒，C 液 Iml/ 盒。能特異性對組織中細胞核染色的試劑為蘇木素。IOml/盒。應用例I :本發(fā)明的試劑盒用于組織切片免疫組織化學染色診斷具體操作步驟如下( I)肺癌組織石蠟切片處理步驟肺癌組織石蠟切片取出后于60 75°C烘箱中烘烤I小時后，放入ニ甲苯脫蠟10分鐘(2 3次)，然后經梯度酒精水化后，放入O. 1M、PH6. 2的枸櫞酸鹽緩沖液中，經微波裝置加熱處理迅速達到100°C沸騰5分鐘后，降低照射力度保持90 98°C，10分鐘。然后取出容器，放至室溫20分鐘左右再染色，使其抗原性恢復，増加染色強度。(2)染色操作步驟(采用實施例I的試劑盒進行處理)上述組織切片用蒸餾水洗凈后，加入適量3%過氧化氫水溶液處理10分鐘，然后加入非特異性蛋白阻斷，反應15分鐘，吸掉反應液后不沖洗，根據組織的大小加入適量用抗體稀釋液稀釋好的初始抗體，37°C反應I小時后，然后加入連接抗體室溫孵育30分鐘，然后加入配制好的DAB顯色試劑，3-10分鐘，然后加入適量蘇木素染核3-10分鐘。以上加入各試劑前均用PBS洗組織切片3次，毎次3分鐘；洗完后，用干凈的濾紙擦凈組織周圍的PBS ；操作過程中每ー步都不能使組織干燥，務必保持組織的濕潤；蘇木素染核之后進行脫水，透明，封片，顯微鏡觀察；反應均在室溫下進行。本實驗可適用于人工和自動染色。本實驗可在配套的自動染色儀上自動操作。染色結果判定0+ :細胞膜為陰性或細胞膜染色陽性的癌細胞少于10%(單純細胞漿染色性時判斷為陰性)；I+:幾乎很少有完整細胞膜陽性或有完整細胞膜染色陽性的癌細胞少于或等于全部癌細胞的10% ；2+ :完整細胞膜弱-中度染色陽性的癌細胞大于或等于全部癌細胞的10% ；3-4+ :完整細胞膜強染色陽性的癌細胞大于或等于全部癌細胞的10%。結果判定0+、1+為陰性，2+、3_4+為陽性(詳見圖I)。應用例2 :
本發(fā)明的試劑盒還適用于腫瘤穿刺脫落細胞檢查。癌組織腫瘤穿刺細胞涂片染色或載玻片上細胞培養(yǎng)穿刺細胞均勻涂在載玻片上，待干燥后立即固定于10%中性福爾馬林溶液中10分鐘。載玻片上細胞培養(yǎng)因癌細胞附著于玻片上，可以直接放入固定液中10分鐘。蒸餾水洗凈后，直接進入染色步驟，染色步驟同應用例I。應用例3 本發(fā)明的試劑盒還可以用 于其他各種癌組織診斷TIPE3的表達情況的檢測，方法同應用例I。應用例4 :應用本發(fā)明的試劑盒對150例肺癌組織切片進行檢測實驗所用實驗材料人類肺鱗狀細胞癌及癌旁石蠟組織切片，人類肺腺癌及癌旁石蠟組織切片，人類細支氣管肺泡癌及癌旁石蠟組織切片，人類肺腺鱗癌及癌旁石蠟組織切片，人類肺大細胞癌及癌旁石蠟組織切片各30例。使用本發(fā)明的試劑盒(實施例I制備)進行TIPE3免疫組織化學染色，染色結果進行雙盲判定，對其陽性和陰性病例統(tǒng)計學處理。其結果顯示肺鱗癌標本中TIPE3陽性率為95%，癌旁組織陽性率1% ;肺腺癌標本中TIPE3陽性率為72. 8%，癌旁組織陽性率為3% ;肺細支氣管肺泡癌標本中TIPE3陽性率為100%，癌旁組織陽性率為O ;肺腺鱗癌標本中TIPE3陽性率為85. 7%，癌旁組織陽性率為O ;肺大細胞癌標本中TIPE3陽性率為66. 7%，癌旁組織陽性率為O (見圖2)。結論使用本發(fā)明的試劑盒進行免疫組織化學染色可以得到良好的染色效果，其組織陽性染色明確，清晰，幾乎無非特異性染色，且TIPE3在各種病理類型肺癌中表達率高，特異性好，可以容易獲得準確的判斷結果，是肺癌簡便有效的檢測方式。
權利要求
1.ー種用于診斷肺癌的Tipe3免疫組織化學檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒內容物中包括滅活人組織切片中內源性過氧化物酶和生物素的試劑，阻斷人組織切片中交叉蛋白反應非特異性染色的非特異性蛋白阻斷劑，與人體組織抗原結合的兔抗人的初始抗體以及抗體稀釋液，能與初始抗體連接的辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔單克隆連接抗體，能與辣根過氧化物酶反應并顯色的顯色試劑，能特異性對組織中細胞核染色的試劑；操作時依次加入各試劑，其用量的體積配比關系為內源性過氧化物酶和生物素滅活劑非特異性蛋白阻斷劑初始抗體抗體稀釋液連接抗體顯色試劑細胞核染色劑=5 10 5 10 : O. 05 O. I 5 10 : 5 10 : 5 20 5 10。
2.根據權利要求I所述的ー種用于診斷肺癌的Tipe3免疫組織化學檢測試劑盒，其特征在于所述滅活人組織切片中內源性過氧化物酶和生物素的試劑為質量濃度為3%的過氧化氫溶液。
3.根據權利要求I所述的ー種用于診斷肺癌的Tipe3免疫組織化學檢測試劑盒，其特征在于所述阻斷人組織切片中交叉蛋白反應非特異性染色的非特異性蛋白阻斷劑為山羊血清。
4.根據權利要求I所述的ー種用于診斷肺癌的Tipe3免疫組織化學檢測試劑盒，其特征在干所述與人體組織抗原結合的兔抗人的初始抗體是針對人體肺癌組織中特異性TIPE3抗原所制備的兔抗人特異性TIPE3抗體。
5.根據權利要求I所述的ー種用于診斷肺癌的Tipe3免疫組織化學檢測試劑盒，其特征在于所述抗體稀釋液為含O. 1%BSA的磷酸鹽緩沖液。
6.根據權利要求I所述的ー種用于診斷肺癌的Tipe3免疫組織化學檢測試劑盒，其特征在于所述能與辣根過氧化物酶反應并顯色的顯色試劑由顯色緩沖液，A =DAB底物儲存液，B :穩(wěn)定的過氧化物和C :增色溶液組成的，四者的體積配比關系為顯色緩沖液A : B : C=17 : I : I : I。
7.根據權利要求I所述的ー種用于診斷肺癌的Tipe3免疫組織化學檢測試劑盒，其特征在于所述能特異性對組織中細胞核染色的試劑為蘇木素。
8.權利要求I 7中任一項所述的ー種用于診斷肺癌的Tipe3免疫組織化學檢測試劑盒用于組織切片免疫組織化學染色診斷的使用方法，其特征在于步驟如下 (O制備待檢測的石蠟組織切片； (2)上述組織切片用蒸餾水洗凈后，加入滅活人組織切片中內源性過氧化物酶和生物素的試劑處理10分鐘，然后滴加阻斷人組織切片中交叉蛋白反應非特異性染色的非特異性蛋白阻斷劑，反應15分鐘，吸掉反應液后不沖洗，加入事先用抗體稀釋液稀釋好的與人體組織抗原結合的兔抗人的初始抗體，37°C反應I小時，然后滴加能與初始抗體連接的辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔單克隆連接抗體，反應30分鐘，然后加入配制好的能與辣根過氧化物酶反應并顯色的顯色試劑，反應3 10分鐘，然后加入蘇木素染核3 10分鐘；以上加入各試劑前均用PBS洗組織切片3次，毎次3分鐘，洗完后用干凈的濾紙擦凈組織切片周圍的PBS ;操作過程中每ー步都不能使組織干燥，務必保持組織的濕潤；蘇木素染核之后進行脫水，透明，封片，顯微鏡觀察；所有操作均在室溫下進行； 所述滅活人組織切片中內源性過氧化物酶和生物素的試劑為3%過氧化氫水溶液。
9.權利要求I 7中任一項所述的ー種用于診斷肺癌的Tipe3免疫組織化學檢測試劑盒用于腫瘤穿刺脫落細胞檢查的使用方法，其特征在于步驟如下 (1)癌組織腫瘤穿刺細胞涂片染色或載玻片上細胞培養(yǎng)穿刺細胞均勻涂在載玻片上，待干燥后立即固定于10%中性福爾馬林溶液中10分鐘；蒸餾水洗凈后，直接進入染色步驟； (2)染色向載玻片上加入滅活人組織切片中內源性過氧化物酶和生物素的試劑處理30分鐘，然后滴加阻斷人組織切片中交叉蛋白反應非特異性染色的非特異性蛋白阻斷劑，反應15分鐘，吸掉反應液后不沖洗，加入事先用抗體稀釋液稀釋好的與人體組織抗原結合的兔抗人的初始抗體，37°C反應I小時，然后滴加能與初始抗體連接的辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔單克隆連接抗體，反應30分鐘，然后加入配制好的能與辣根過氧化物酶反應并顯色的顯色試劑，反應3 10分鐘，然后加入蘇木素染核3 10分鐘；以上加入各試劑前均用PBS洗組織切片3次，毎次3分鐘， 洗完后用干凈的濾紙擦凈組織切片周圍的PBS ；操作過程中每ー步都不能使組織干燥，務必保持組織的濕潤；蘇木素染核之后進行脫水，透明，封片，顯微鏡觀察；所有操作均在室溫下進行； 所述滅活人組織切片中內源性過氧化物酶和生物素的試劑為3%的過氧化氫溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于診斷肺癌的Tipe3免疫組織化學檢測試劑盒，內容物中包括滅活人組織切片中內源性過氧化物酶和生物素的試劑，阻斷人組織切片中交叉蛋白反應非特異性染色的非特異性蛋白阻斷劑，與人體組織抗原結合的兔抗人的初始抗體以及抗體稀釋液，能與初始抗體連接的辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔單克隆連接抗體，能與辣根過氧化物酶反應并顯色的顯色試劑，能特異性對組織中細胞核染色的試劑。TIPE3在各種病理類型肺癌中均呈陽性表達，且在腫瘤早期就能夠檢測發(fā)現且特異性強，敏感度高，能夠應用于肺癌的早期診斷，使患者能夠得到有效，及時的治療，減少患者不必要的醫(yī)療費用支出，提高患者的生存質量和延長生存時間，使發(fā)生肺癌的患者生存率增加。
文檔編號G01N33/532GK102707058SQ20121017370
公開日2012年10月3日 申請日期2012年5月30日 優(yōu)先權日2012年5月30日
發(fā)明者劉香嵐, 張利寧, 朱法良, 王嘉寧, 王曉燕, 王群, 石永玉, 郭春 申請人:山東大學