專利名稱：一種胃蛋白酶原Ⅰ的光激發(fā)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種血清(血漿)中胃蛋白酶原I的快速、定量、均相檢測(cè)方法及試劑盒，屬于體外試劑診斷領(lǐng)域中血清(漿)抗原的光激發(fā)化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)分析方法，用于實(shí)施疾病診斷和治療方法的儀器或裝置，屬于光激發(fā)化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
胃蛋白酶原I (簡(jiǎn)稱PG I )是反映胃部狀態(tài)的功能性指標(biāo)——胃蛋白酶無活性前體，PG I由胃底腺的主細(xì)胞、頸黏液細(xì)胞分泌，大部分進(jìn)入胃腔，少量進(jìn)入血液循環(huán)，而胃是PG I的唯一來源，因此PG I水平的變化可以反映胃粘膜狀態(tài)和細(xì)胞數(shù)量的改變。國(guó)內(nèi)外臨床研究指出，PG I升聞，提不胃黏I旲破損可能性尚，患胃潰瘍、胃炎的風(fēng)險(xiǎn)增加；PG I降低，則患有萎縮性胃炎的可能性明顯增加，甚至有患胃癌的風(fēng)險(xiǎn)。測(cè)定PG I含量有助檢測(cè)出胃潰瘍、萎縮性胃炎、胃炎、胃癌等其他消化道疾病，供臨床檢測(cè)和體檢篩查需求。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)胃癌患者的血清PG變化作了大量研究指出胃癌患者的血清PG含量急劇降低，低分化癌患者PG I含量更低于分化較高的胃癌患者；有數(shù)據(jù)顯示，在被確診的胃癌患者中，檢測(cè)他們幾年前的血樣品可以發(fā)現(xiàn)，1/3的患者在當(dāng)時(shí)還健康的情況下血清PG水平已經(jīng)降低；PG I與PG I /PG II比值并聯(lián)使用靈敏度高，可有效應(yīng)用于胃癌高發(fā)區(qū)人群的初歩篩查。因此，PG檢測(cè)被稱為胃部的“血清學(xué)活檢”，作為非侵入性方法，降低患者痛苦，簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)，具有普查價(jià)值。在人群胃病篩查中，每個(gè)人做胃鏡是不現(xiàn)實(shí)的，可通過非侵入性血清PG檢測(cè)將淺表性胃炎、糜爛性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、胃癌等高危人群篩查出來，再進(jìn)行胃鏡檢查是ー種切實(shí)可行的方案。光激發(fā)化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)是以納米級(jí)高分子微粒為基礎(chǔ)的新一代化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)，該項(xiàng)技術(shù)前景廣闊，將被廣泛地應(yīng)用于研究生物分子的相互作用。又稱為AlphaLISA分析法，被譽(yù)為免洗的ELISA。其主要原理是由光激發(fā)產(chǎn)生的均相化學(xué)發(fā)光技術(shù)，它具有快速、均相(免洗)、高靈敏、量程寬和操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)。該試劑由含有感光化合物的感光微粒和含有發(fā)光化合物的發(fā)光微粒組成，微粒直徑約188nm，表面覆蓋多糖水凝膠。水凝膠能減少非特異性結(jié)合，同吋，增加微粒的懸浮性。微粒通過水凝膠表面的功能團(tuán)與生物分子共價(jià)連接。納米級(jí)微粒大大增加了反應(yīng)的表面積，每個(gè)微粒表面覆蓋著成百上千個(gè)生物分子，可捕獲目標(biāo)分子。該技術(shù)的核心原理是單線態(tài)氧的產(chǎn)生和傳遞。在受到紅色激光(680nm)照射后，感光微粒能使周圍環(huán)境中的氧轉(zhuǎn)化為單線態(tài)氧，單線態(tài)氧的生存時(shí)間僅為4微秒。短暫的生存時(shí)間決定了單線態(tài)氧的傳播直徑很小(約為200nm)。如果發(fā)光微粒在200nm范圍之內(nèi)就能接受單線態(tài)氧，并發(fā)出高能級(jí)的光(520nm-620nm)。反之，單線態(tài)氧就會(huì)回落到基態(tài)氧而沒有信號(hào)產(chǎn)生。這種依賴于兩種微粒相互接近的化學(xué)能量傳遞是均相反應(yīng)的基礎(chǔ)。通常在該反應(yīng)體系中，微粒的濃度是很低的。兩種微粒相互隨機(jī)碰撞的幾率很低，因此，反應(yīng)體系的本底非常微弱。如果包被在微粒表面的生物分子相互作用，拉近了兩個(gè)微粒的距離，例如形成免疫夾心或受體-配體復(fù)合物，這樣就能產(chǎn)生能量的有效傳遞并發(fā)出光信號(hào)。生物素-鏈霉親和素與免疫分析試劑偶聯(lián)起來，可大大提高免疫分析的測(cè)定靈敏度因?yàn)殒溍褂H和素與生物素之間極高的親和力，使反應(yīng)結(jié)合更牢固穩(wěn)定，而且特異性高；每個(gè)鏈霉親和素(親和素)可結(jié)合4個(gè)生物素，可使反應(yīng)明顯放大、減少反應(yīng)中的空間位阻。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供ー種新型的PG I光激發(fā)化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)分析方法及試劑盒，運(yùn)用生物素-鏈霉親和素(包括親和素)的放大效應(yīng)和先進(jìn)的光激發(fā)化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)技術(shù)，將雙抗夾心法的信號(hào)放大，達(dá)到高靈敏、特異性好、量程范圍寬、反應(yīng)時(shí)間短的目的。本發(fā)明的技術(shù)方案ー種血清胃蛋白酶原I光激發(fā)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法，基于光激發(fā)化學(xué)發(fā)光免疫分析法，將鏈霉親和素一生物素放大系統(tǒng)引入胃蛋白酶原I雙抗夾心體系中，在白色不透明微孔板中加入包被有抗胃蛋白酶原I的一株高效價(jià)單抗的發(fā)光微粒和連有生物素的抗胃蛋白酶原I的另ー株單克隆抗體溶液，及胃蛋白酶原I標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，避光反應(yīng)，隨后加入包被有鏈霉親和素的感光微粒，孵育后檢測(cè)。所述的胃蛋白酶原I光激發(fā)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法所用的試劑盒，由白色不透明微孔板(1)，胃蛋白酶原I標(biāo)準(zhǔn)品(2)，連有抗胃蛋白酶原I單克隆抗體的發(fā)光微粒(3)，生物素化抗胃蛋白酶原I單克隆抗體溶液(4)和包被有鏈霉親和素的感光微粒(5)組成，胃蛋白酶原I標(biāo)準(zhǔn)品濃度范圍0-300ng/mL。將ー株抗PG I抗體與發(fā)光微粒偶聯(lián)，另ー株抗PG I抗體與生物素連接，在均相體系中形成感光微粒-抗體-抗原-抗體-生物素的復(fù)合物。通過鏈霉親和素，感光微粒與雙抗夾心復(fù)合物免疫夾心，實(shí)現(xiàn)感光微粒與發(fā)光微粒的特異性接近，從而實(shí)現(xiàn)能量傳遞，發(fā)出熒光信號(hào)，并被儀器測(cè)量出來。本發(fā)明的有益效果一、靈敏度高，檢測(cè)至2. Ong/mL ;ニ、量程寬，血清(衆(zhòng))樣本不需要稀釋，樣品濃度值介于0-300ng/mL的都能準(zhǔn)確檢測(cè)；三、檢測(cè)時(shí)間短，從樣品孵育到檢測(cè),約0. 5小時(shí)完成；四，樣品需求量少,一次上樣只需20ML。


圖I :PG I光激發(fā)化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)分析試劑盒的組成示意 I、白色不透明微孔板，2、PG I標(biāo)準(zhǔn)品ー套，3、包被有PG I單抗的發(fā)光微粒，4、生物素化PG I單抗試劑，5、包被有鏈霉親和素的感光微粒。圖2 :PG I光激發(fā)化學(xué)發(fā)光免疫反應(yīng)原理示意圖。圖3 :PG I光激發(fā)化學(xué)發(fā)光免疫反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I
包被有PG I單抗的發(fā)光微粒制備
在離心管中加入Img發(fā)光微粒，加入12. 5 ML 1% Tween-20,0. 05 mg PG I單抗，IOML硼氫化氰鈉，用0. lM、pH 6. 0的2-(N-嗎啉)こ磺酸(MES)緩沖液將體積補(bǔ)充到200ML，37°C避光振蕩反應(yīng)48小吋。加入IOML 0.3 M pH 5. 0的羧甲氧基胺半鹽酸鹽(CMO)溶液封閉未結(jié)合位點(diǎn)，37°C避光孵育I小時(shí)后離心，分離得到已連接PG I單抗的發(fā)光微粒，稀釋后備用。PG I光激發(fā)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒的制備 試劑盒的組成*
(I)、白色不透明微孔板(12X8孔，可以拆分為單孔)。(2)、1X包被有PG I單抗的發(fā)光微粒(50Pg/mL) :2mL。(3)、6XPG I 標(biāo)準(zhǔn)品，0. 5mL/ 瓶，標(biāo)準(zhǔn)液濃度為:0，10，50，100，200，300ng/mL。(4)、I X 生物素化抗 PG I 單抗溶液(10Pg/mL)，2mL。(5)、I X包被有鏈霉親和素的感光微粒(20l^g/mL) :20mL。在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射。PG I光激發(fā)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)步驟
取包被有PG I單抗的發(fā)光微粒、PG I標(biāo)準(zhǔn)品或處理好的樣品、一定濃度的生物素化抗PG I單抗三種試劑，各20ML加到白色不透明微孔板，37°C孵育20分鐘；加入175ML包被有鏈霉親和素的感光微粒，37°C孵育10分鐘；在光激化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀上檢測(cè)光信號(hào)。結(jié)果處理根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度和對(duì)應(yīng)熒光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將樣品的熒光值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算得到樣品中PG I含量。表I :顯不PG I光激發(fā)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)結(jié)果,其中第一列代表PG I濃度,第二列代表熒光計(jì)數(shù)值(cps)，夾心法測(cè)試實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表所示。表I :PG I光激發(fā)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)結(jié)果_
權(quán)利要求
1.ー種血清胃蛋白酶原I光激發(fā)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法，其特征在于基于光激發(fā)化學(xué)發(fā)光免疫分析法，將鏈霉親和素一生物素放大系統(tǒng)引入胃蛋白酶原I雙抗夾心體系中，在白色不透明微孔板中加入包被有抗胃蛋白酶原I的一株高效價(jià)單抗的發(fā)光微粒和連有生物素的抗胃蛋白酶原I的另ー株單克隆抗體溶液，及胃蛋白酶原I標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，避光反應(yīng)，隨后加入包被有鏈霉親和素的感光微粒，孵育后檢測(cè)。
2.權(quán)利要求I所述的胃蛋白酶原I光激發(fā)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法所用的試劑盒，其特征在干由白色不透明微孔板(1)，胃蛋白酶原I標(biāo)準(zhǔn)品(2)，連有抗胃蛋白酶原I單克隆抗體的發(fā)光微粒(3)，生物素化抗胃蛋白酶原I單克隆抗體溶液(4)和包被有鏈霉親和素的感光微粒(5)組成，胃蛋白酶原I標(biāo)準(zhǔn)品濃度范圍0-300ng/mL。
全文摘要
一種胃蛋白酶原Ⅰ的光激發(fā)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法及試劑盒，屬于光激發(fā)化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明方法為微量的胃蛋白酶原Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)品或樣品、包被有抗胃蛋白酶原Ⅰ一株高效價(jià)單抗的發(fā)光微粒和生物素化抗胃蛋白酶原Ⅰ的另一株單克隆抗體，在微孔板中避光反應(yīng)，隨后加入包被有鏈霉親和素的感光微粒，孵育后檢測(cè)。本發(fā)明應(yīng)用光激發(fā)化學(xué)發(fā)光原理，在特定波長(zhǎng)激發(fā)下，通過單線態(tài)離子氧的產(chǎn)生和傳遞，將能量傳遞給發(fā)光微粒產(chǎn)生熒光，儀器檢測(cè)獲得數(shù)據(jù)。利用生物素-鏈霉親和素的放大效應(yīng)和高效價(jià)的單克隆抗體，及光激化學(xué)發(fā)光原理特性，達(dá)到反應(yīng)時(shí)間很短、上樣量少、靈敏度高、特異性好、測(cè)量范圍寬，操作簡(jiǎn)單，便于臨床使用，利于大規(guī)模推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)G01N33/577GK102654499SQ201210151530
公開日2012年9月5日 申請(qǐng)日期2012年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月16日
發(fā)明者周彬, 張玨, 張藝, 朱嵐, 王柯, 黃飚 申請(qǐng)人:無錫市江原實(shí)業(yè)技貿(mào)總公司, 江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所