專利名稱：一種快速定量檢測(cè)肌鈣蛋白i的免疫熒光試紙條組件、及其制成的檢測(cè)卡組件和制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所需的免疫熒光試紙條技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及ー種快速定量檢測(cè)肌鈣蛋白I的免疫熒光試紙條組件及其制備方法，和由免疫熒光試紙條組件支撐的檢測(cè)卡組件及其制備方法。
背景技術(shù)：
冠心病已成為影響人群健康的主要疾病，其中急性心肌梗死則是造成冠心病人死亡的主要原因。所以，如何及時(shí)地發(fā)現(xiàn)急性心肌梗死病人并給予及時(shí)的治療是挽救病人生命的關(guān)鍵所在。對(duì)此，傳統(tǒng)的診斷主要是根據(jù)典型的臨床表現(xiàn)、心電圖的改變及實(shí)驗(yàn)室酶學(xué)檢查等手段進(jìn)行。但是由于相當(dāng)一部分心肌梗死病人臨床表現(xiàn)不明顯，且早期心電圖無(wú)明顯改變，導(dǎo)致了診斷的困難，而在這種情況下，心肌組織損傷特異性標(biāo)志物的應(yīng)用對(duì)心肌梗死癥狀的早期確診就起到了關(guān)鍵的作用，其中，肌I丐蛋白I (Cardiac troponin I, cTnl)是ー種重要的心肌組織損傷特異性標(biāo)識(shí)物，越來(lái)越多的開(kāi)始臨床用于急性心肌梗死及其它心肌損傷性疾病的診斷。具體的，肌鈣蛋白復(fù)合體是由3個(gè)亞基組成，3個(gè)亞基分別是肌鈣蛋白T、肌鈣蛋白I及肌鈣蛋白C。鈣蛋白T是原球蛋白結(jié)合亞基，主要調(diào)節(jié)肌鈣蛋白復(fù)合體與細(xì)肌絲間的相互作用；肌鈣蛋白I是肌原纖維AFP酶的抑制性亞單位；肌鈣蛋白C是鈣離子結(jié)合部分，主要調(diào)節(jié)鈣離子依賴型的肌肉收縮。肌鈣蛋白I的基因長(zhǎng)約6. 2Kb，可以編碼205個(gè)氨基酸。其中，肌鈣蛋白I非常特異地僅存在心肌中，在肌肉及其它組織中從沒(méi)有發(fā)現(xiàn)肌鈣蛋白I。肌鈣蛋白I以不同形式存在于心肌細(xì)胞中，其中胞漿內(nèi)游離的肌鈣蛋白I只占4.1%,為可溶性，大部分肌鈣蛋白I則與肌鈣蛋白T及C亞單位結(jié)合在一起，以復(fù)合體的形式存在。當(dāng)心肌損傷時(shí)，外周血中的肌鈣蛋白I主要與TNC形成的ニ聚體(1C)，此外肌鈣蛋白I還有可能以氧化型、還原型、磷酸化、去磷酸化、蛋白降解形式釋放。因?yàn)榧♀}蛋白I分子質(zhì)量較CK-MB小，對(duì)心肌損傷很敏感，對(duì)微型心肌損傷肌鈣蛋白I即可出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，而此時(shí)CK-MB未增高或處正常高限。當(dāng)心肌細(xì)胞膜的完整性受破壞，肌鈣蛋白I會(huì)先從胞漿內(nèi)釋放，因此血清水平很快升高，而結(jié)合的肌鈣蛋白I由于相對(duì)分子質(zhì)量大，從心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白緩慢持續(xù)的釋放，心肌損傷后4 6h釋放入血，可以達(dá)到診斷決定值。另外，心肌缺血癥狀發(fā)作后14 36h出現(xiàn)高峰，高峰出現(xiàn)時(shí)間與血中CK、CK-MB相似，持續(xù)3 7天，部分病例14天時(shí)仍可測(cè)到。此外，最近文獻(xiàn)指出，測(cè)定血清肌鈣蛋白I診斷AMI的敏感性為97%，特異性為98%，預(yù)測(cè)值為99. 8%，所以，肌鈣蛋白I增高對(duì)于心肌損傷的診斷往往很有價(jià)值。在90年代以來(lái)，對(duì)肌鈣蛋白的大量臨床研究表明，肌鈣蛋白具有心肌損傷的高度的特異性和敏感性。美國(guó)臨床化學(xué)學(xué)會(huì)(NACB)及國(guó)際檢測(cè)醫(yī)學(xué)聯(lián)合會(huì)(TFCC)建議心肌肌鈣蛋白是檢測(cè)心肌損傷的新的標(biāo)志物；中國(guó)檢驗(yàn)學(xué)會(huì)也推薦由心肌肌鈣蛋白逐步取代CK-MB成為檢出心肌損傷的新標(biāo)準(zhǔn)。
實(shí)際應(yīng)用中，肌鈣蛋白I的具體測(cè)定始于20世紀(jì)80年代中期，多采用雙抗體競(jìng)爭(zhēng)放射免疫法和競(jìng)爭(zhēng)性ELISA測(cè)定法。有研究者將金標(biāo)記或硒標(biāo)記單克隆抗體與免疫層析技術(shù)相結(jié)合，用紙條法半定量床邊檢測(cè)肌鈣蛋白I濃度，最低檢測(cè)值為0. g/L。而發(fā)展到現(xiàn)在，肌鈣蛋白I的檢測(cè)多采用化學(xué)發(fā)光法，用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記后作為檢測(cè)抗體，大大提高了其測(cè)定的精確性和敏感性，現(xiàn)在所通用的肌鈣蛋白I測(cè)定方法因?yàn)樯袩o(wú)標(biāo)準(zhǔn)化，不同的方法采用不同的抗體識(shí)別位點(diǎn)，所以在使用商品肌鈣蛋白I試劑盒時(shí)，必須研究商品試劑的特性。而目前的床旁檢測(cè)方法-肢體金試紙法，不能滿足臨床診斷準(zhǔn)確定量的要求，也無(wú)法對(duì)AMI的病程起到很好的療效監(jiān)測(cè)作用。因此，建立ー種檢測(cè)時(shí)間盡量縮短，并且檢測(cè)除了能在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行外還能夠進(jìn)行床旁檢測(cè)，同時(shí)還可以定量測(cè)定肌鈣蛋白I的檢測(cè)方法，從而為臨床提供準(zhǔn)確的診斷依據(jù)，是十分必要的。 其中，申請(qǐng)?zhí)枮?00720140929的中國(guó)專利提供了ー種利用快速免疫層析法，定型地檢測(cè)臨床標(biāo)本(全血/血清/血漿)中心肌鈣蛋白I的診斷試紙，具備一定的特異性、靈敏度和易儲(chǔ)存性，不需要專門的技術(shù)人員和儀器設(shè)備，結(jié)果也易讀，但是，該專利也同樣的無(wú)法良好滿足檢測(cè)時(shí)間短、適用性強(qiáng)等需求，存在一定缺陷。

發(fā)明內(nèi)容
為解決上述的現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明根據(jù)免疫熒光技術(shù)特點(diǎn)和cTnl抗原抗體系統(tǒng)的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)了新的原材料、試劑和エ藝流程的組合。本發(fā)明的反應(yīng)原理為固相雙抗體夾心法的免疫熒光層析法。待測(cè)樣品與適當(dāng)比例的鉬卟啉標(biāo)記特異抗體在液相均質(zhì)介質(zhì)中充分混和均勻，在此過(guò)程中樣品中的肌鈣蛋白I(cTnl)能專ー性地與鉬卟啉標(biāo)記的抗肌鈣蛋白I(cTnl)抗體充分結(jié)合，然后再轉(zhuǎn)加到試紙條上，流經(jīng)檢測(cè)卡中的包被分析膜時(shí)，其中所含的、已反應(yīng)結(jié)合在一起的cTnl-抗cTnl熒光抗體復(fù)合物能為包被分析膜上的檢測(cè)線上固定的抗cTnl的另ー個(gè)抗體特異性捕獲，所發(fā)出的熒光可用專用儀器定量測(cè)定，熒光強(qiáng)度與樣品中cTnl濃度成正比。具體的，本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)ー種快速定量檢測(cè)肌鈣蛋白I的免疫熒光試紙條組件，包括試紙條和與試紙條配合使用且獨(dú)立包裝的鉬卟啉標(biāo)記特異抗體；其中試紙條是由底和設(shè)在底襯上的依次接合的吸水墊、包被分析膜、樣品墊組成；所述包被分析膜上設(shè)有檢測(cè)線和質(zhì)控線；所述檢測(cè)線包被特異抗體為抗肌鈣蛋白I單克隆抗體，所述質(zhì)控線包被特異抗體為兔IgG抗體；所述鉬卟啉標(biāo)記特異抗體為抗肌鈣蛋白I單克隆抗體和抗兔IgG抗體。優(yōu)選地，所述底襯表面涂覆有黏膠或雙面膠，用于固定所述的吸水墊、包被分析膜和樣品墊，所述包被分析膜粘附在所述底襯的中間，同時(shí)包被分析膜兩端分別與所述吸水墊和所述樣品墊連接。
優(yōu)選的，所述吸水墊為濾紙，為吸水紙或?yàn)V油紙；所述吸水墊粘附在所述底襯上，同時(shí)所述吸水墊與所述包被分析膜的連接處重疊l_2mm。進(jìn)ー步地，所述包被分析膜由硝酸纖維素膜組成，所述包被分析膜上噴涂抗肌鈣蛋白I單克隆抗體和抗兔IgG抗體。優(yōu)選地，所述樣品墊為磷酸鹽緩沖液緩浸泡過(guò)的玻璃纖維膜，所述樣品墊粘附在所述底襯上，其中所述樣品墊與所述包被分析膜的連接處重疊1_2_。優(yōu)選地，所述鉬卟啉標(biāo)記特異抗體為抗肌鈣蛋白I單克隆抗體和抗兔IgG抗體，并分別用含如下組分的0. 02M磷酸鹽緩沖液稀釋后用塑料瓶密封而得0. 01%-0. 5%聚こニ醇、1% -5%牛血清白蛋白、5% -20%甘油和0. 01% -0. 05%表面活性剤。其中，所述鉬卩卜啉標(biāo)記的激發(fā)光光源波長(zhǎng)范圍為390_420nm,發(fā)射光波長(zhǎng)范圍為600_700nm。一種制備上述快速定量檢測(cè)肌鈣蛋白I的免疫熒光試紙條組件的方法，包括以下步驟I)抗體的制備選用純化的基因工程表達(dá)的抗肌鈣蛋白I單克隆抗體、抗兔IgG抗體和純化的兔IgG抗體； 2)包被分析膜的制備采用噴膜機(jī)分別在ー硝酸纖維膜上劃?rùn)z測(cè)線和質(zhì)控線，劃線細(xì)致均勻，檢測(cè)線與質(zhì)控線間隔5mm ；用檢測(cè)線包被緩沖液稀釋抗肌鈣蛋白I單克隆抗體至濃度為10-20ug/ml，采用噴膜機(jī)將抗肌鈣蛋白I單克隆抗體噴印在硝酸纖維膜的檢測(cè)線上；用質(zhì)控線包被緩沖液稀釋純化的兔IgG抗體至濃度為10_20ug/ml，采用噴膜機(jī)將純化的兔IgG抗體噴印在硝酸纖維膜的質(zhì)控線上；將噴膜后的硝酸纖維膜放入25_50°C的真空干燥箱內(nèi)，干燥后取出密封備用；3)鉬卟啉標(biāo)記抗體的制備用0. IM碳酸氫鈉溶液分別將抗肌鈣蛋白I單克隆抗體和抗兔IgG抗體的濃度稀釋至lmg/ml,各取5ml抗體溶液,再分別加入30_50mg鉬卟啉標(biāo)記特異抗體并攪勻,在室溫下孵育I小時(shí)，其中在孵育過(guò)程中每隔15分鐘分別混勻一次，孵育完成后，用規(guī)格型號(hào)為G25的凝膠柱分別進(jìn)行過(guò)柱分離純化，再分別收集標(biāo)記好鉬卟啉標(biāo)記特異抗體的抗肌鈣蛋白I單克隆抗體和抗兔IgG抗體，各自用按含0. 01%-0. 5%聚こニ醇、I % -5%牛血清白蛋白、5%-20%甘油和0. 01%-0. 05%表面活性劑的0. 02M磷酸鹽緩沖液稀釋混勻后，分別用塑料瓶密封包裝，于4°C環(huán)境下保存；4)樣品墊的制備用包含0. 01% -0. 5%聚こニ醇、1% -5%牛血清白蛋白和0. 01% -0. 05%表面活性劑的0. 04M、PH值為7. 2的磷酸鹽緩沖液浸泡樣品墊玻璃纖維膜，浸泡處理后，放入30-50°C的真空干燥箱內(nèi)進(jìn)行干燥，待干燥完成后取出并密封備用；5)免疫熒光試紙條的制備先將包被分析膜粘附在所述底襯中間位置上，在所述包被分析膜一端粘附吸水墊，所述包被分析膜和所述吸水墊的連接處重疊l_2mm ;在所述包被分析膜另一端粘附所述樣品墊，所述包被分析膜和所述樣品墊的連接處重疊l_2mm ;再將黏貼好所述包被分析膜、所述吸水墊和所述樣品墊的所述底襯裁切成4_寬的細(xì)條；6)獨(dú)立包裝的鉬卟啉標(biāo)記特異抗體工作液的制備確定適量濃度的鉬卟啉標(biāo)記的抗肌鈣蛋白I單克隆抗體和抗兔IgG抗體，采用按含0. 01% 0. 5%聚こニ醇、1% 5%牛血清白蛋白、5% -20%甘油和0. 01% -0. 05%表面活性劑的0. 02M磷酸鹽緩沖液一井稀釋，分裝在塑料試劑瓶中并密封瓶蓋。ー種由上述的快速定量檢測(cè)肌鈣蛋白I的免疫熒光試紙條組件制成的檢測(cè)卡組件，包括試紙條組件以及由聚苯こ烯或聚氯こ烯制成的蓋板和聚苯こ烯或聚氯こ烯制成的背板組成的卡盒；其中，所述背板包括放置所述試紙條組件的卡槽和用干與所述蓋板結(jié)合的卡齒，所述蓋板包括可觀測(cè)檢測(cè)結(jié)果的檢測(cè)窗、可滴加樣品的加樣孔和用干與所述背板的卡齒結(jié)合的固定孔；所述試紙條組件通過(guò)所述卡齒與所述固定孔結(jié)合而嵌合在所述背板和所述蓋板之間；特別的，所述包被分析膜正對(duì)所述檢測(cè)窗，所述樣品墊正對(duì)所述加樣孔。另外，獨(dú)立包裝的鉬卟啉標(biāo)記特異抗體分裝在塑料試劑瓶中并密封瓶蓋。制備上述的快速定量檢測(cè)肌鈣蛋白I的免疫熒光試紙條組件制成的檢測(cè)卡組件的方法，包括以下步驟
I)制成背板和蓋板用聚苯こ烯或聚氯こ烯制成背板和蓋板，所述背板包括放置所述試紙條組件的卡槽和用干與所述蓋板結(jié)合的卡齒，所述蓋板包括可測(cè)結(jié)果的檢測(cè)窗、可滴加樣品的加樣孔以及用干與所述背板的卡齒結(jié)合的固定孔；2)組裝將試紙條組件放在所述背板的所述卡槽內(nèi)，通過(guò)所述背板的卡齒與所述蓋板的固定孔結(jié)合，將試紙條組件嵌合在背板和蓋板之間，其中，包被分析膜正對(duì)所述檢測(cè)窗，樣品墊正對(duì)所述加樣孔；另外，獨(dú)立包裝的鉬卟啉標(biāo)記特異抗體分裝在塑料試劑瓶中并密封瓶
至Jhl o3)包裝將I人份的試紙條、卡盒和一包干燥劑封裝在鋁箔塑料袋內(nèi)，并將多組所述鋁箔塑料袋和對(duì)應(yīng)的多組所述獨(dú)立包裝的鉬卟啉標(biāo)記特異抗體裝入ー個(gè)包裝盒，在2°C -8°C環(huán)境下避光不凍存的進(jìn)行保存。本發(fā)明具有以下有益之處本發(fā)明采用免疫熒光快速檢測(cè)技術(shù)，利用熒光的高靈敏特點(diǎn)，在樣品與熒光標(biāo)記抗體在試劑瓶?jī)?nèi)反應(yīng)后再加入檢測(cè)卡，由于樣品與熒光標(biāo)記抗體在液相中全面接觸，反應(yīng)充分，因此可大幅度提高反應(yīng)靈敏度，同時(shí)增加了樣品的稀釋倍數(shù)，去除了樣品的基質(zhì)效應(yīng)，令定量結(jié)果有很好的可重復(fù)性，而且本發(fā)明省略了直接加樣步驟，提高了定量結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確度，可滿足同時(shí)檢測(cè)高值和低值的臨床診斷要求，，并且性價(jià)比高，適用于臨床快速檢測(cè)。此外，應(yīng)用本發(fā)明提供的試紙條檢測(cè)人體內(nèi)cTnl水平，成本相對(duì)低廉，操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏，且特異性好，只需要配套常規(guī)的專用熒光檢測(cè)儀即可，因此可廣泛應(yīng)用于各級(jí)醫(yī)療檢驗(yàn)場(chǎng)所，尤其是基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)，包括鄉(xiāng)鎮(zhèn)衛(wèi)生院等均可開(kāi)展，所以推展了其應(yīng)用性，對(duì)于心腦血管事件發(fā)生的預(yù)防有極為重要的意義。


圖I是本發(fā)明試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2是本發(fā)明檢測(cè)卡的分解結(jié)構(gòu)示意圖。圖3是鉬卟啉發(fā)光材料的發(fā)射光譜曲線。
圖4為本發(fā)明的反應(yīng)方式示意圖。圖5為本發(fā)明的檢測(cè)結(jié)果示意圖。其中，a :檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性；b :檢測(cè)結(jié)果為陰性；c :檢測(cè)結(jié)果無(wú)效。圖6為本發(fā)明的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例僅用于闡述本發(fā)明，而本發(fā)明的保護(hù)范圍并非僅僅局限于以下實(shí)施例。所述技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員依據(jù)以上本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容和各項(xiàng)參數(shù)所取范圍，均可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。實(shí)施例I如附圖I所示，ー種快速定量檢測(cè)肌鈣蛋白I的免疫熒光試紙條組件，包括試紙條和與試紙條配合使用且獨(dú)立包裝的鉬卟啉標(biāo)記特異抗體；其中試紙條是由底襯I和設(shè)在底襯I上的依次接合的吸水墊2、包被分析膜3、樣品墊6組成；所述包被分析膜3上設(shè)有檢測(cè)線4和質(zhì)控線5 ;所述檢測(cè)線4包被特異抗體為抗肌鈣蛋白I單克隆抗體，質(zhì)控線5包被特異抗體為抗兔IgG抗體；其中，底襯I表面涂覆有黏膠或雙面膠，用于固定所述的吸水墊2、包被分析膜3和樣品墊6，具體的，包被分析膜3粘附在所述底襯I的中間，同時(shí)包被分析膜3兩端分別與所述吸水墊2和所述樣品墊6連接。包被分析膜3由硝酸纖維素膜組成，包被分析膜3上噴涂抗肌鈣蛋白I單克隆抗體和抗兔IgG抗體。樣品墊6為磷酸鹽緩沖液緩浸泡過(guò)的玻璃纖維膜，樣品墊6粘附在底襯I上，其中，樣品墊6與包被分析膜3的連接處重疊l_2mm。吸水墊2為濾紙，具體的為吸水紙或?yàn)V油紙；吸水墊2粘附在底襯I上，同時(shí)吸水墊2與包被分析膜3的連接處重疊l_2mm。鉬卟啉標(biāo)記特異抗體為抗肌鈣蛋白I單克隆抗體和抗兔IgG抗體，分別用按含
0.01%-0. 5%聚こニ醇、1%-5%牛血清白蛋白、5%-20%甘油和0. 01%-0. 05%表面活性劑的0. 02M磷酸鹽緩沖液稀釋，用塑料試劑瓶密封包裝。上述快速定量檢測(cè)肌鈣蛋白I的免疫熒光試紙條組件的制備方法，步驟為I、抗體的制備選用純化的基因工程表達(dá)的抗肌鈣蛋白I單克隆抗體、抗兔IgG抗體和純化的兔IgG抗體。2、包被分析膜3的制備采用噴膜機(jī)分別在ー硝酸纖維膜上劃?rùn)z測(cè)線(4)和質(zhì)控線(5)，劃線細(xì)致均勻，檢測(cè)線4與質(zhì)控線5間隔5mm ；用檢測(cè)線包被緩沖液稀釋抗肌鈣蛋白I單克隆抗體至濃度為10-20ug/ml，采用噴膜機(jī)將抗肌鈣蛋白I單克隆抗體噴印在硝酸纖維膜的檢測(cè)線上；用質(zhì)控線包被緩沖液稀釋純化的兔IgG抗體至濃度為10_20ug/ml，采用噴膜機(jī)將純化的兔IgG抗體噴印在硝酸纖維膜的質(zhì)控線上；將噴膜后的硝酸纖維膜放入25_50°C的真空干燥箱內(nèi)，干燥后取出密封備用；
具體的，檢測(cè)線4包被緩沖液的制備方法用50mM、pH值7. 6的磷酸鹽緩沖液，此磷酸鹽緩沖液按含1%海藻糖、0. 5%牛血清白蛋白和lmg/ml的19C7抗體。質(zhì)控線5包被緩沖液的制備方法用50mM的pH值7. 6的磷酸鹽緩沖液，此磷酸鹽緩沖液按含1%甲醇、0. 8%牛血清白蛋白和0. 5mg/ml的兔IgG。 包被分析膜3的制備調(diào)試噴膜機(jī)，使其膜液量為20ul/40cm，機(jī)器劃線令檢測(cè)線4與質(zhì)控線5間隔保持5_，劃線細(xì)致均勻，將噴膜后的包被分析膜3放置在30-50°C真空干燥箱內(nèi)處理20-30分鐘，之后取出真空裝袋以密封備用。3、樣品墊6的制備 用包含0. 01% -0. 5%聚こニ醇、1% -5%牛血清白蛋白和0. 01% -0. 05%表面活性劑的0. 04M、PH值為7. 2的磷酸鹽緩沖液浸泡樣品墊玻璃纖維膜，浸泡處理后，放入30-50°C的真空干燥箱內(nèi)進(jìn)行干燥，待干燥完成后取出并密封備用。4、免疫熒光試紙條的制備先將包被分析膜3粘附在底襯I中間位置上，在包被分析膜3 —端粘附吸水墊2，包被分析膜3和吸水墊2的連接處重疊l_2mm ;在包被分析膜3另一端粘附樣品墊6，包被分析膜3和樣品墊6的連接處重疊l_2mm ;再將黏貼好包被分析膜3、吸水墊2和樣品墊6的底襯I裁切成4mm寬的細(xì)條。參閱圖I所示，包被分析膜3上設(shè)有通過(guò)噴膜機(jī)噴印形成的檢測(cè)線4和質(zhì)控線5。5、鉬卟啉標(biāo)記抗體的制備用0. IM碳酸氫鈉溶液分別將抗肌鈣蛋白I單克隆抗體和抗兔IgG抗體的濃度稀釋至lmg/ml,各取5ml抗體溶液,再分別加入30mg鉬卟啉標(biāo)記特異抗體并攪勻，在室溫下孵育I小時(shí)，其中在孵育過(guò)程中每隔15分鐘分別混勻一次，孵育完成后，用規(guī)格型號(hào)為G25的凝膠柱分別進(jìn)行過(guò)柱分離純化，再分別收集標(biāo)記好鉬卟啉標(biāo)記特異抗體的抗肌鈣蛋白I單克隆抗體和抗兔IgG抗體，各自用按含0.01% -0. 5%聚こニ醇、I % -5%牛血清白蛋白、5% -20%甘油和0. 01% -0. 05%表面活性劑的0. 02M磷酸鹽緩沖液稀釋混勻后，分別用塑料瓶密封包裝，于4°C環(huán)境下保存。6、獨(dú)立包裝的鉬卟啉標(biāo)記特異抗體工作液的制備確定適量濃度的鉬卟啉標(biāo)記的抗肌鈣蛋白I單克隆抗體和抗兔IgG抗體，采用按含0. 01% 0. 5%聚こニ醇、1% 5%牛血清白蛋白、5% -20%甘油和0. 01% -0. 05%表面活性劑的0. 02M磷酸鹽緩沖液一井稀釋，分裝在塑料試劑瓶中并密封瓶蓋。參閱圖2所示，ー種由快速定量檢測(cè)抗肌鈣蛋白I的免疫熒光試紙條組件制成的檢測(cè)卡組件，其包括試紙條、由用聚苯こ烯或聚氯こ烯制成的蓋板11和用聚苯こ烯或聚氯こ烯制成的背板13組成的卡盒以及獨(dú)立包裝的鉬卟啉標(biāo)記特異抗體15。所述背板13包括放置試紙條的卡槽12和用干與蓋板結(jié)合的卡齒14 ;所述蓋板11包括可觀測(cè)檢測(cè)結(jié)果的檢測(cè)窗8、可滴加樣品的加樣孔7和用干與背板13的卡齒14結(jié)合的固定孔10。所述試紙條通過(guò)所述卡齒14與所述固定孔10結(jié)合而嵌合在所述背板13和所述蓋板11之間，即形成了檢測(cè)卡。其中，所述包被分析膜3正對(duì)所述檢測(cè)窗8，所述樣品墊6正對(duì)所述加樣孔7 ;另夕卜，獨(dú)立包裝的鉬卟啉標(biāo)記特異抗體15分裝在塑料試劑瓶中并密封瓶蓋。本發(fā)明提供一種制備快速定量檢測(cè)抗肌鈣蛋白I的免疫熒光試紙條組件制成的檢測(cè)卡組件的方法，其包括以下步驟
I)制成背板13和蓋板11用聚苯こ烯或聚氯こ烯制成背板13和蓋板11，所述背板13包括放置所述試紙條組件的卡槽12和用干與所述蓋板11結(jié)合的卡齒14，所述蓋板11包括可測(cè)結(jié)果的檢測(cè)窗
8、可滴加樣品的加樣孔7以及用干與所述背板的卡齒14結(jié)合的固定孔10。2)組裝將試紙條組件放在所述背板13的所述卡槽內(nèi)12，通過(guò)所述背板13的卡齒14與所述蓋板11的固定孔10結(jié)合，將試紙條組件嵌合在背板13和蓋板11之間，其中，包被分析 膜3正對(duì)所述檢測(cè)窗8，樣品墊6正對(duì)所述加樣孔7。另外，獨(dú)立包裝的鉬卟啉標(biāo)記特異抗體分裝在塑料試劑瓶中并密封瓶蓋。3)包裝將I人份的試紙條、卡盒和一包干燥劑封裝在鋁箔塑料袋內(nèi)，并將25人份的所述鋁箔塑料袋和對(duì)應(yīng)的25瓶所述獨(dú)立包裝的鉬卟啉標(biāo)記特異抗體裝入ー個(gè)包裝盒，在2V _8°C環(huán)境下避光不凍存的進(jìn)行保存。本發(fā)明的檢測(cè)原理參閱圖3所示，鉬卟啉發(fā)光材料的發(fā)射光譜曲線進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)鉬卟啉所具有的特征光譜的激發(fā)光光源范圍為390-420nm，發(fā)射光波長(zhǎng)范圍為600_700nm。由于鉬卟啉發(fā)光標(biāo)記物的特點(diǎn)，使得以其作為標(biāo)記物的免疫熒光試紙條可與儀器結(jié)合，使得基于鉬卟啉發(fā)光技術(shù)的免疫層析試紙條可進(jìn)行靈敏度極高的多重分析、且對(duì)目標(biāo)被檢測(cè)物進(jìn)行靈敏度極高的精確定量檢測(cè)。本發(fā)明采用免疫熒光快速檢測(cè)技術(shù)，利用熒光的高靈敏特點(diǎn)，待測(cè)樣品與鉬卟啉標(biāo)記先在試劑瓶?jī)?nèi)反應(yīng)，由于待測(cè)樣品與鉬卟啉標(biāo)記在液相中全面接觸，反應(yīng)充分，因此可大幅度提高反應(yīng)靈敏度，同時(shí)增加了待測(cè)樣品的稀釋倍數(shù)，去除了待測(cè)樣品的基質(zhì)效應(yīng)，使定量結(jié)果有很好的可重復(fù)性，而且此方法省略了直接加樣步驟，提高了定量結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確度，可滿足同時(shí)檢測(cè)高值和低值的臨床診斷要求，參照附圖4，鉬卟啉標(biāo)記特異抗體與待測(cè)樣品中充分結(jié)合形成一復(fù)合物；然后復(fù)合物轉(zhuǎn)加到檢測(cè)卡上，在吸水墊2的吸力下流經(jīng)到檢測(cè)卡中的包被分析膜3上，如果該復(fù)合物具有肌鈣蛋白I，其能被檢測(cè)線4上的肌鈣蛋白I單克隆抗體捕獲17，在緑色光照射下以紅外光光信號(hào)的形式表現(xiàn)出來(lái)，所發(fā)出的熒光可用專用儀器定量測(cè)定，熒光強(qiáng)度與樣品中心肌鈣蛋白I的濃度成正比；如果復(fù)合物中肌鈣蛋白I低于最低檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，則檢測(cè)線4不會(huì)發(fā)出熒光；試紙條有效的情況下，質(zhì)控線5上的兔IgG抗體18均會(huì)與復(fù)合物反應(yīng)發(fā)出熒光。請(qǐng)參閱圖5中的a、b、c所示，即檢測(cè)線4與質(zhì)控線5均發(fā)光，試紙條檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性；只有質(zhì)控線5發(fā)光，試紙條檢測(cè)結(jié)果呈陰性；兩條線均未發(fā)光，試紙條檢測(cè)結(jié)果無(wú)效。本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制首先，將提純的肌鈣蛋白I標(biāo)準(zhǔn)品用I : 10稀釋的正常人血清(采用pH7. 2 0. 02MPB緩沖液稀釋)作為稀釋液配制系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品，濃度為Ong/ml、IOng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml的6份樣品。其次,姆個(gè)樣品分別用10個(gè)肌I丐蛋白I試紙條檢測(cè)10次，10次檢測(cè)儀器判讀的樣品檢測(cè)T值和對(duì)照C值分別取平均值，最終根據(jù)二者的比值得出每個(gè)濃度對(duì)應(yīng)的T/C結(jié)果，列于表I。
權(quán)利要求
1.ー種快速定量檢測(cè)肌鈣蛋白I的免疫熒光試紙條組件，其特征在于包括試紙條和與試紙條配合使用且獨(dú)立包裝的鉬卟啉標(biāo)記特異抗體；其中試紙條是由底襯(I)和設(shè)在底襯(I)上的依次接合的吸水墊(2)、包被分析膜(3)、樣品墊(6)組成；所述包被分析膜(3)上設(shè)有檢測(cè)線(4)和質(zhì)控線(5);所述檢測(cè)線(4)包被特異抗體為抗肌鈣蛋白I單克隆抗體，所述質(zhì)控線(5)包被特異抗體為兔IgG抗體；所述鉬卟啉標(biāo)記特異抗體為抗肌鈣蛋白I單克隆抗體和抗兔IgG抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的快速定量檢測(cè)肌鈣蛋白I的免疫熒光試紙條組件，其中，所述試紙條的底襯(I)表面涂覆有黏膠或雙面膠，用于固定所述的吸水墊(2)、包被分析膜(3)和樣品墊出)，包被分析膜(3)粘附在所述底襯(I)的中間，同時(shí)包被分析膜(3)兩側(cè)分別與所述吸水墊(2)和所述樣品墊(6)連接。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的快速定量檢測(cè)肌鈣蛋白I的免疫熒光試紙條組件，其特征在于所述吸水墊(2)為濾紙，為吸水紙或?yàn)V油紙；所述吸水墊(2)粘附在所述底襯(I)上，同時(shí)所述吸水墊(2)與所述包被分析膜(3)的連接處重疊l_2mm。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的快速定量檢測(cè)肌鈣蛋白I的免疫熒光試紙條組件，其特征在于所述包被分析膜(3)由硝酸纖維素膜組成，所述包被分析膜(3)上噴涂抗肌鈣蛋白I單克隆抗體和兔IgG抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的快速定量檢測(cè)肌鈣蛋白I的免疫熒光試紙條組件，其特征在于所述樣品墊(6)為磷酸鹽緩沖液緩浸泡過(guò)的玻璃纖維膜，所述樣品墊(6)粘附在所述底襯(I)上，其中所述樣品墊(6)與所述包被分析膜(3)的連接處重疊l_2mm。
6.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的快速定量檢測(cè)肌鈣蛋白I的免疫熒光試紙條組件，其特征在于所述鉬卟啉標(biāo)記特異抗體為抗肌鈣蛋白I單克隆抗體和抗兔IgG抗體，并分別用含如下組分的0. 02M磷酸鹽緩沖液稀釋后用塑料瓶密封而得0. 01% -0. 5%聚こニ醇、1% -5%牛血清白蛋白、5% -20%甘油和0. 01% -0. 05%表面活性剤。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的快速定量檢測(cè)檢測(cè)肌鈣蛋白I的免疫熒光試紙條組件，其特征在于所述鉬卟啉標(biāo)記的激發(fā)光光源波長(zhǎng)范圍為390-420nm，發(fā)射光波長(zhǎng)范圍為600_700nmo
8.ー種制備權(quán)利要求I所述的快速定量檢測(cè)肌鈣蛋白I的免疫熒光試紙條組件的方法，其特征在于包括以下步驟 1)抗體的制備 選用純化的基因工程表達(dá)的抗肌鈣蛋白I單克隆抗體、抗兔IgG抗體和純化的兔IgG ； 2)包被分析膜(3)的制備 采用噴膜機(jī)分別在ー硝酸纖維膜上劃?rùn)z測(cè)線(4)和質(zhì)控線(5)，劃線細(xì)致均勻，檢測(cè)線(4)與質(zhì)控線(5)間隔5mm ； 用檢測(cè)線包被緩沖液稀釋抗肌鈣蛋白I單克隆抗體至濃度為10-20ug/ml，采用噴膜機(jī)將抗肌鈣蛋白I單克隆抗體噴印在硝酸纖維膜的檢測(cè)線上； 用質(zhì)控線包被緩沖液稀釋純化的兔IgG抗體至濃度為10-20ug/ml，采用噴膜機(jī)將純化的兔IgG抗體噴印在硝酸纖維膜的質(zhì)控線上； 將噴膜后的硝酸纖維膜放入25-50°C的真空干燥箱內(nèi)，干燥后取出密封備用； 3)樣品墊(6)的制備用包含0.01% -0.5%聚こニ醇、1% -5%牛血清白蛋白和0.01% -0. 05%表面活性劑的0. 04M、PH值為7. 2的磷酸鹽緩沖液浸泡樣品墊玻璃纖維膜，浸泡處理后，放入30-50°C的真空干燥箱內(nèi)進(jìn)行干燥，待干燥完成后取出并密封備用； 4)免疫熒光試紙條的制備 先將包被分析膜(3)粘附在底襯(I)中間位置上，在包被分析膜(3) —端粘附吸水墊(2)，包被分析膜(3)和吸水墊(2)的連接處重疊1-2_;在包被分析膜(3)另一端粘附樣品墊出)，包被分析膜(3)和樣品墊￠)的連接處重疊l_2mm ;再將黏貼好包被分析膜(3)、吸水墊⑵和樣品墊(6)的底襯⑴裁切成4mm寬的細(xì)條； 5)鉬卟啉標(biāo)記抗體的制備 用0. IM碳酸氫鈉溶液分別將抗肌鈣蛋白I單克隆抗體和抗兔IgG抗體的濃度稀釋至lmg/ml,各取5ml抗體溶液,再分別加入30_50mg鉬卟啉標(biāo)記特異抗體并攪勻,在室溫下孵育I小時(shí)，其中在孵育過(guò)程中每隔15分鐘分別混勻一次，孵育完成后，用規(guī)格型號(hào)為G25的凝膠柱分別進(jìn)行過(guò)柱分離純化，再分別收集標(biāo)記好鉬卟啉標(biāo)記特異抗體的抗肌鈣蛋白I單克隆抗體和抗兔IgG抗體，各自用按含0.01% -0.5%聚こニ醇、I % -5%牛血清白蛋白、5% -20%甘油和0. 01% -0. 05%表面活性劑的0. 02M磷酸鹽緩沖液稀釋混勻后，分別用塑料瓶密封包裝，于4°C環(huán)境下保存； 6)獨(dú)立包裝的鉬卟啉標(biāo)記特異抗體工作液的制備 確定適量濃度的鉬卟啉標(biāo)記的抗肌鈣蛋白I單克隆抗體和抗兔IgG抗體，采用按含0.01% 0. 5%聚こニ醇、1% 5%牛血清白蛋白、5%-20%甘油和0. 01%-0. 05%表面活性劑的0. 02M磷酸鹽緩沖液一井稀釋，分裝在塑料試劑瓶中并密封瓶蓋。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備快速定量檢測(cè)肌鈣蛋白I的免疫熒光試紙條組件的方法，其特征在于所述步驟2)中，檢測(cè)線包被緩沖液的制備方法用50mM、pH值7. 6的磷酸鹽緩沖液，此磷酸鹽緩沖液含1%海藻糖、0. 5%牛血清白蛋白和lmg/ml的抗肌鈣蛋白I單克隆抗體；質(zhì)控線(5)包被緩沖液的制備方法用50mM的pH值7. 6的磷酸鹽緩沖液，此磷酸鹽緩沖液含1%甲醇、0. 8%牛血清白蛋白和0. 5mg/ml的兔IgG抗體；包被分析膜(3)的制備調(diào)試噴膜機(jī)，使其膜液量為20ul/40cm，機(jī)器劃線令檢測(cè)線(4)與質(zhì)控線(5)間隔保持5mm,劃線細(xì)致均勻，將噴膜后的包被分析膜(3)放置在30_50°C真空干燥箱內(nèi)處理20-30分鐘，之后取出真空裝袋以密封備用。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備快速定量檢測(cè)肌鈣蛋白I的免疫熒光試紙條組件的方法，其特征在于所述的步驟2)中，檢測(cè)線包被緩沖液的制備方法用50mM、pH值7. 6的Tris緩沖液,此Tris緩沖液包含0. 8%甲醇、0. 6%牛血清白蛋白和lmg/ml的抗肌鈣蛋白I單克隆抗體。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備快速定量檢測(cè)肌鈣蛋白I的免疫熒光試紙條組件的方法，其特征在于所述的步驟2)中，質(zhì)控線包被緩沖液的制備方法用50mM的pH值7. 6的磷酸鹽緩沖液，此磷酸鹽緩沖液包含0. 7%甲醇、0. 5%牛血清白蛋白和0. 5mg/ml的兔IgG抗體。
12.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備快速定量檢測(cè)肌鈣蛋白I的免疫熒光試紙條組件的方法，其特征在于所述的步驟5)中，用0. IM碳酸氫鈉溶液將抗肌鈣蛋白I單克隆抗體和抗兔IgG抗體的濃度分別稀釋至lmg/ml,各取5ml抗體溶液,分別加入30_50mg突光素鉬卩卜啉溶解液并攪勻，在室溫下孵育2小時(shí)，孵育過(guò)程中每隔15分鐘混勻一次。
13.根據(jù)權(quán)利要求8)所述的制備快速定量檢測(cè)肌鈣蛋白I的免疫熒光試紙條組件的方法，其特征在于所述的步驟3中，采用含0. 4%聚こニ醇、3. 5%牛血清白蛋白和0. 02%表面活性劑的0. 04M磷酸鹽緩沖液，通過(guò)噴膜機(jī)將磷酸鹽緩沖液噴印在樣品墊(6)上，將噴印后的樣品墊(6)放入30°C _50°C的真空干燥箱內(nèi)進(jìn)行干燥，待干燥4小時(shí)后取出密封備用。
14.一種由權(quán)利要求I所述的快速定量檢測(cè)肌鈣蛋白I的免疫熒光試紙條組件制成的檢測(cè)卡組件，其特征在于所述檢測(cè)卡組件包括試紙條組件以及由聚苯こ烯或聚氯こ烯制成的蓋板(11)和聚苯こ烯或聚氯こ烯制成的背板(13)組成的卡盒；其中，所述背板(13)包括放置所述試紙條組件的卡槽(12)和用干與所述蓋板(11)結(jié)合的卡齒(14)，所述蓋板(11)包括可觀測(cè)檢測(cè)結(jié)果的檢測(cè)窗(8)、可滴加樣品的加樣孔(7)和用干與所述背板的卡齒(14)結(jié)合的固定孔(10);所述試紙條組件通過(guò)所述卡齒(14)與所述固定孔(10)結(jié)合而嵌合在所述背板(13)和所述蓋板(11)之間；特別的，所述包被分析膜(3)正對(duì)所述檢測(cè)窗(8)，所述樣品墊(6)正對(duì)所述加樣孔(7)，另外，獨(dú)立包裝的鉬卟啉標(biāo)記特異抗體分裝在塑料試劑瓶中并密封瓶蓋。
15.ー種制備權(quán)利要求14所述的快速定量檢測(cè)肌鈣蛋白I的免疫熒光試紙條組件制成的檢測(cè)卡組件的方法，其特征在于包括以下步驟 1)制成背板(13)和蓋板(11) 用聚苯こ烯或聚氯こ烯制成背板(13)和蓋板(11)，所述背板(13)包括放置所述試紙條組件的卡槽(12)和用干與所述蓋板(11)結(jié)合的卡齒(14)，所述蓋板(11)包括可測(cè)結(jié)果的檢測(cè)窗(8)、可滴加樣品的加樣孔(7)以及用干與所述背板的卡齒(14)結(jié)合的固定孔(10)； 2)組裝 將試紙條組件放在所述背板(13)的所述卡槽內(nèi)(12)，通過(guò)所述背板(13)的卡齒(14)與所述蓋板(11)的固定孔(10)結(jié)合，將試紙條組件嵌合在背板(13)和蓋板(11)之間，其中，包被分析膜⑶正對(duì)所述檢測(cè)窗(8)，樣品墊(6)正對(duì)所述加樣孔(7);另外，獨(dú)立包裝的鉬卟啉標(biāo)記特異抗體分裝在塑料試劑瓶中并密封瓶蓋。
3)包裝 將I人份的試紙條、卡盒和一包干燥劑封裝在鋁箔塑料袋內(nèi)，并將多組所述鋁箔塑料袋和對(duì)應(yīng)的多組所述獨(dú)立包裝的鉬卟啉標(biāo)記特異抗體裝入ー個(gè)包裝盒，在2°C -8°C環(huán)境下避光不凍存的進(jìn)行保存。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種快速定量檢測(cè)肌鈣蛋白I的免疫熒光試紙條組件、及其制成的檢測(cè)卡組件和制備方法，試紙條組件包括試紙條和獨(dú)立包裝的鉑卟啉標(biāo)記特異抗體，試紙條包括底襯、吸水墊、包被分析膜及樣品墊，該包被分析膜上設(shè)有檢測(cè)線和質(zhì)控線，檢測(cè)線包被的特異抗體為抗肌鈣蛋白I單克隆抗體，質(zhì)控線包被的特異抗體為兔IgG抗體；檢測(cè)卡組件包括試紙條、由蓋板和背板組成的卡盒以及獨(dú)立包裝的鉑卟啉標(biāo)記特異抗體；本發(fā)明采用免疫熒光快速檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)人體內(nèi)肌鈣蛋白I水平，成本相對(duì)低廉，操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏，且特異性好，對(duì)于心腦血管事件發(fā)生的預(yù)防有極為重要的意義。
文檔編號(hào)G01N33/558GK102662055SQ20121013380
公開(kāi)日2012年9月12日 申請(qǐng)日期2012年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月28日
發(fā)明者李必松, 梁萬(wàn)興, 羅琪, 謝愛(ài)武 申請(qǐng)人:廣州鴻琪光學(xué)儀器科技有限公司