專利名稱：養(yǎng)陰降糖中藥組合物及其制備方法和檢測方法
技術領域：
本發(fā)明屬于中藥學領域，涉及一種具有養(yǎng)陰益氣，清熱活血功能，用于氣陰不足、內(nèi)熱消渴、癥見煩熱口渴、多飲多食、倦怠乏力的2型糖尿病見上述癥狀的中藥組合物的制備方法和檢測方法，具體為養(yǎng)陰降糖中藥組合物及其制備方法和檢測方法。
背景技術：
糖尿病屬于中醫(yī)學消渴病范疇 ，以三多一少癥及尿中有甜味為其癥狀特征。病機主要表現(xiàn)為本虛標實，氣陰虛為本，燥熱、瘀血為標。近年來糖尿病的發(fā)病率呈快速增長趨勢，且并發(fā)癥嚴重，治療手段有限，是現(xiàn)代難治性疾病之一。國家知識產(chǎn)權局網(wǎng)在2010年9月29日授權公告了名稱為“一種治療糖尿病的藥物的質(zhì)量檢測方法”的專利，專利號CN200810018127. O,申請日2008. 05. 05，其具體公開了一種治療糖尿病的藥物的質(zhì)量檢測方法，該方法包括治療糖尿病的藥物的鑒別、檢查、浸出物以及含量測定等步驟。本發(fā)明通過薄層色譜法，實現(xiàn)了對黃芪甲苷、葛根素、菝葜皂苷元、西洋參和人參皂苷Rbl、Re和Rgl鑒別，同時采用雙波長掃描法對人參皂苷Re含量的準確測定，每粒含西洋參以人參皂苷Re(C48H82018)計，不得少于O. 10mg。國家知識產(chǎn)權局網(wǎng)在2011年12月14日授權公告了名稱為“治療糖尿病的藥物組合物”，專利號CN200810049804. 5申請日:2008.05. 19，其提出處方配比為黃芪129 516g、地黃129 516g、白芍86 344g、麥冬86 344g、葛根86 344g、丹參86 344g、水蛭5L 5 206g、黃芩64. 5 258g、黃連64. 5 258g、玄參86 344g、川芎64. 5 258g、川牛膝64. 5 258g的藥材組合與適宜的藥學可接受輔料；用適宜工藝制成，治療用途為II型糖尿病周圍神經(jīng)病變、心腦血管粥樣硬化、高血壓、高血脂癥。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種養(yǎng)陰降糖中藥組合物及其制備方法，該養(yǎng)陰降糖中藥組合物的有效成分種類及其含量被進一步優(yōu)化，質(zhì)量更穩(wěn)定且療效更確切，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明的另一個目的是提供一種制備該養(yǎng)陰降糖中藥組合物的檢測方法，從而能夠更加全面、有效地表征養(yǎng)陰降糖中藥組合物的有效成分種類及其含量，更有利用于監(jiān)控產(chǎn)品的質(zhì)量。本發(fā)明的上述目的是通過以下技術方案來實現(xiàn)的。一種養(yǎng)陰降糖中藥組合物，其特征是由以下重量配比范圍的原料藥制成黃芪460-540份，黨參180-240份，葛根240-300份，枸杞子180-240份，玄參240-300份，玉竹180-240份，地黃320-400份，知母180-240份，牡丹皮180-240份，川芎240-300份，虎杖320-400份，五味子100-160份，共十二味藥；優(yōu)選地，制成的中藥組合物每制劑單位含葛根以葛根素含量計不得少于I. 6mg且和黃芪甲苷的含量計不少于O. 48mg。所述的一種養(yǎng)陰降糖中藥組合物，其特征是由以下重量配比較佳范圍的原料藥制成黃芪495-505份，黨參215-225份，葛根285-295份，枸杞子215-225份，玄參285-295份，玉竹215-225份，地黃355-365份，知母215-225份，牡丹皮215-225份，川芎285-295份，虎杖355-365份，五味子135-145份，共十二味藥；優(yōu)選地，制成的中藥組合物每制劑單位含葛根以葛根素含量計不得少于I. 6mg且和黃芪甲苷的含量計不少于O. 48mg。所述的一種養(yǎng)陰降糖中藥組合物，其特征是由以下重量配比定值的原料藥制成黃芪500g，黨參220g，葛根290g，枸杞子220g，玄參290g，玉竹220g，地黃360g，知母220g，牡丹皮220g，川芎290g，虎杖360g，五味子140g ;優(yōu)選地，制成的中藥組合物每制劑單位含葛根以葛根素含量計不得少于I. 6mg且和黃芪甲苷的含量計不少于O. 48mg。根據(jù)上面所述的養(yǎng)陰降糖中藥組合物的制備方法，其特征在于，所述中藥組合物的劑型為片劑、丸劑或者膠囊劑固體制劑，優(yōu)選為片劑薄膜衣片；其制備方法為以下步驟知母，枸杞子，牡丹皮和五味子粉碎成細粉，黃芪，葛根粉碎成最粗粉，照中國藥典附錄流浸膏劑與浸膏劑項下的滲濾法(附錄10)，用70%的乙醇為溶劑進行滲濾，收集滲濾液；藥渣與其余黨參等六味加水煎煮2次，每次2小時，第一次加水10倍量，第二次加水8倍量，合并煎液，濾過，滲濾液回收乙醇后，與上述濾液合并，減壓濃縮成稠膏，干燥后粉碎成細粉，與上述細粉混合均勻，加輔料，選自適量填充劑淀粉、糊精、甘露醇、微晶纖維素、羧甲基淀粉鈉中的至少一種混合，如淀粉適量；混勻，用60%乙醇制軟材，過16目篩網(wǎng)制成濕顆粒，干燥，16目篩網(wǎng)整粒；取輔料，選適量自潤滑劑滑石粉、二氧化硅或硬脂酸鎂中的至少一種混合，如硬脂酸鎂適量加入干顆粒，混勻，壓制成1000片，包薄膜衣，O. 6g/片，即得。根據(jù)上面所述的養(yǎng)陰降糖中藥組合物制備方法制成的中藥組合物的檢測方法，其特征在于，所述檢測方法采用高效液相色譜法檢測中藥組合物中黃芪的含量，含黃芪甲苷的含量計不少于O. 48mg ;所述檢測中藥組合物中黃芪甲苷的含量的高效液相色譜條件為色譜柱BDSHYPERS IL C18 柱(250x4. 6mm, 5um);流動相乙腈-水(32 68);用蒸發(fā)光散射檢測器檢測，流速1. Oml/min ；在以上色譜條件下對照品黃芪甲苷與相鄰色譜峰分離度大于2. O，理論塔板數(shù)按黃芪甲苷峰記不低于3000;所述檢測中藥組合物中黃芪甲苷的含量還包括制備供試品溶液，所述制備供試品溶液步驟取本品10片，除去糖衣，研細，置具塞錐形瓶中，加80ml甲醇超聲提取30min第一次，倒出甲醇液，再加甲醇50ml超聲30min，合并提取液濃縮至干，殘渣加20ml水溶解，用水飽和正丁醇液萃取3次，每次20ml，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2次，每次20ml，棄去氨液，再用水飽和正丁醇洗滌2次，每次25ml，分取正丁醇層，置水浴鍋上蒸干，殘渣加甲醇溶解后轉(zhuǎn)移到5ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過O. 45um微孔濾膜，即得。所述檢測中藥組合物中黃芪甲苷的含量還包括制備對照品溶液，所述制備對照品溶液步驟精密稱定黃芪甲苷對照品5. Olmg，加甲醇溶解并定容至IOml容量瓶中，即得。根據(jù)上面所述的養(yǎng)陰降糖中藥組合物制備方法制成的中藥組合物的檢測方法，其特征在于所述檢測方法測得的中藥組合物每制劑單位含葛根素含量計不少于I. 6mg。根據(jù)上面所述的養(yǎng)陰降糖中藥組合物制備方法的中藥組合物的檢測方法，其特征在于所述檢測方法還包括以下步驟(1)采用薄層色譜法檢測知母；優(yōu)選地，采用薄層色譜法檢測知母包括以下步驟取本品10片，除去包衣，研碎，加乙醇50ml，加熱回流40分鐘，濾過，濾液加鹽酸3ml，加熱回流I小時，加水15ml，加氯仿25ml振搖提取，將氯仿提取液蒸干，殘渣加氯仿2ml使溶解，作為供試品溶液。取菝葜皂苷元對照品，加氯仿制成每ml含Img的溶液即得；陰性對照溶液的制備取不含知母的陰性樣品照供試品溶液的制備依法操作，制成陰性對照溶液；
分別吸取上述供試品溶液、對照溶液、陰性對照溶液各5μ 1，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-丙酮(9 I)為展開劑，層析缸另槽加氨水2ml，展開，晾干至無氨味，噴以5 %香草醛硫酸溶液，加熱至斑點顯色清晰，結(jié)果顯示，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照溶液無干擾。(2)采用薄層色譜法檢測黨參；優(yōu)選地，采用薄層色譜法檢測黨參包括以下步驟取本品10片，除去包衣，研碎，用乙醚超聲兩次(30，20ml)，IOmin/次，棄去乙醚液，殘渣揮盡乙醚，加水30ml，鹽酸3ml，置沸水浴中回流30min,冷卻,用氯仿萃取兩次(30,30ml),合并氯仿液,濃縮至Iml,作為供試液；取黨參對照藥材lg，加水適量煮沸30min，濾過，濾液濃縮至30ml，加鹽酸3ml，置沸水浴中回流30min,冷卻,用氯仿萃取兩次(30,30ml)合并氯仿液,濃縮至Iml.取不含黨參的陰性樣品照供試品溶液的制備依法操作，制成陰性對照溶液；分別吸取供試液，對照品和黨參空白對照液各5ul，點于同一硅膠G板，以體積比20 8 O. 5苯-醋酸乙酯-甲酸為展開劑，展開后晾干，噴以10%硫酸乙醇液，105°C烘至斑點清晰，結(jié)果在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照溶液無干擾；(3)采用薄層色譜法檢測川芎；優(yōu)選地，采用薄層色譜法檢測川芎包括以下步驟取本品5片，除去包衣，研細，力口乙醚20ml，超聲提取30min濾過，濾液蒸干，殘渣加乙酸乙酯Iml使溶解，作為供試液；取川芎對照藥材lg，加乙醚20ml，超聲提取20min濾過，濾液蒸干，殘渣加乙酸乙酯Iml使溶解，作為對照藥材溶液，取不含川芎的陰性樣品照供試品溶液的制備依法操作，制成陰性對照溶液；照薄層色譜法(中國藥典2010版一部附錄VI B)試驗，吸取上述三種溶液各5ul，分別點于同一硅膠G薄層板上，以體積比9 I環(huán)己烷-乙酸乙酯為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365nm)下檢視，結(jié)果在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照溶液無干擾；(4)采用薄層色譜法檢測牡丹皮；優(yōu)選地，采用薄層色譜法檢測牡丹皮包括以下步驟取本品10片，除去糖衣，研細，加乙醚30ml,超聲提取20min,濾過,合并乙醚液,藥洛揮盡乙醚,加甲醇150ml,超聲提取20min，濾過，濾液置水浴上蒸干，殘渣加水30ml使溶解，再加用水飽和的正丁醇80ml，分2次提取(50，30ml)，合并正丁醇液，加2倍量氨試液洗滌，棄去氨溶液，正丁醇液置水浴上蒸干，殘渣加80%甲醇3ml，轉(zhuǎn)移至已處理好的中性氧化鋁柱(內(nèi)徑約lcm，層析用中性氧化鋁100 200目，5g)上，用80%的甲醇50ml洗脫，洗脫液置水浴上蒸干，殘渣加醋酸乙酯Iml使溶解，作為供試品溶液；取芍藥苷對照品，加醋酸乙酯制成每毫升Img的溶液，作為對照品溶液，取不含牡丹皮的陰性樣品照供試品溶液的制備依法操作，制成陰性對照溶液；
照薄層色譜法(中國藥典2010版一部附錄VI B)試驗，吸取上述溶液各IOul，分別點于同一羧甲基纖維素鈉為粘合劑的硅膠G薄層板上，以體積比40 10 5 0.2氯仿-甲醇-醋酸乙酯-甲酸為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%的香草醛硫酸溶液，在105°C烘至斑點清晰，結(jié)果在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照溶液無干擾；(5)采用薄層色譜法檢測葛根優(yōu)選地，采用薄層色譜法檢測葛根包括以下步驟取養(yǎng)陰降糖片10片，除去糖衣，研細，加醋酸乙酯20ml，超聲處理20min，濾過，濾液蒸干，加甲醇Iml溶解，作為葛根供試液；取葛根素對照品，加乙醇制成每ml含I mg的溶液即得，取不含葛根的陰性樣品照供試品溶液的制備依法操作，制成陰性對照溶液；分別吸取供試液，對照品和葛根空白對照液各5ul，點于同一硅膠G薄層板上，以體積比7 2.5 O. 25氯仿-甲醇-水為展開劑，取出后晾干，置氨蒸氣中熏5 lOmin，紫外燈365nm下檢視，結(jié)果與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照溶液無干擾。本發(fā)明的優(yōu)點和效果為了更充分地保障養(yǎng)陰降糖中藥組合物的療效和品質(zhì)，本發(fā)明申請人經(jīng)過大量實驗和研究，最終明確了影響?zhàn)B陰降糖中藥組合物的療效和品質(zhì)的主要有效成分種類，即葛根素以及黃芪甲苷的含量，同時還確定了其它影響療效和品質(zhì)的有效成分種類，其中包括虎杖、枸杞子、黨參、川芎、牡丹皮、葛根、知母等其他成分。基于上述有效成分種類及其含量的研究成果獲得的養(yǎng)陰降糖中藥組合物品質(zhì)更加穩(wěn)定、療效更加確切。此外，為了進一步全面、準確和有效地的監(jiān)控養(yǎng)陰降糖中藥組合物的上述有效成分，本發(fā)明還提供了行之有效的檢測方法，與現(xiàn)有養(yǎng)陰降糖中藥組合物的檢測方法相比，其中除了以高效液相色譜法檢測葛根素的含量外，還在相同的高效液相色譜條件下實現(xiàn)了黃芪甲苷的含量檢測。此外，本發(fā)明還確定了黃芪甲苷含量的高效液相色譜最適檢測條件，進一步反映了來自黃芪的有效成分的含量，以及確定了采用薄層色譜法定性檢測其他有效成分的適宜條件。實驗數(shù)據(jù)表明，相對于現(xiàn)有技術的常規(guī)檢測方法而言，由于檢測步驟和檢測條件的優(yōu)化，使得本發(fā)明提供的檢測方法更加簡便、穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，能夠全面、有效地表征養(yǎng)陰降糖中藥組合物的有效成分含量，更有利于監(jiān)控產(chǎn)品的質(zhì)量。為實現(xiàn)工業(yè)化大規(guī)模的生產(chǎn)打下有力的條件和基礎。


以下，結(jié)合附圖來詳細說明本發(fā)明的實施方案，其中圖I為實施例2獲得的檢測黃芪甲苷對照及養(yǎng)陰降糖片中黃芪甲苷含量的高效液相-蒸發(fā)光散射圖譜。圖2為實施例3獲得的檢測知母的薄層色譜圖，1，4為樣品120201，2，5為菝葜皂苷元對照品，3，6為陰性對照。圖3為實施例4獲得的檢測黨參的薄層色譜圖，1，4為樣品120201，2，5為黨參對照藥材，3，6為陰性對照。圖4為實施例5獲得的檢測川芎的薄層色譜圖，1，4為樣品120201，2，5為川芎對照藥材，3，6為陰性對照。圖5為實施例6獲得的檢測牡丹皮的薄層色譜圖，1，4為樣品120201，2，5為芍藥苷對照品，3，6為陰性對照。圖6為實施例7獲得的檢測葛根素的薄層色譜圖，1，4為樣品120201，2，5為葛根素對照品，3，6為陰性對照。
具體實施例方式以下參照具體的實施例來詳細說明本發(fā)明。本領域技術人員能夠理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，其不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。特別說明的是工藝流程和檢測方法中的溫度和壓力參數(shù)在沒有特別說明的情況下，均指在常溫常壓下的條件下操作。實施例I :養(yǎng)陰降糖片的制備I、處方和制法如下由以下重量配比定值的原料藥制成黃芪500g，黨參220g，葛根290g，枸杞子220g，玄參290g,玉竹220g,地黃360g,知母220g,牡丹皮220g，川芎290g,虎杖360g,五味子140g ;共十二味藥。知母，枸杞子，牡丹皮和五味子粉碎成細粉，黃芪，葛根粉碎成最粗粉，照中國藥典附錄流浸膏劑與浸膏劑項下的滲濾法(附錄I 0)，用70%的乙醇為溶劑進行滲濾，收集滲濾液；藥渣與其余黨參等六味加水煎煮2次，每次2小時，第一次加水10倍量，第二次加水8倍量，合并煎液，濾過，滲濾液回收乙醇后，與上述濾液合并，減壓濃縮成稠膏，干燥后粉碎成細粉，與上述細粉混合均勻，加適量淀粉，用60%乙醇制軟材，過16目篩網(wǎng)制成濕顆粒，干燥，16目篩網(wǎng)整粒；取硬脂酸鎂適量加入干顆粒，混勻，壓制成1000片，包薄膜衣，即得。2、處方和制法如下此處方排除上面的定值處方外，與上相比只是擴大了取值范圍，制法同上。取黃芪460-540份之間任意自然數(shù)值均可，如取十組，如460、470、480、490、495、505、515、525、535、540 份；黨參180-240份之間任意自然數(shù)值均可，如取十組，如240、230、225、210、220、215、200、205、190、180 份；葛根240-300份之間任意自然數(shù)值均可，如取十組，如240、250、270、280、285、290、295、300、260、265 份；枸杞子180-240份，之間任意自然數(shù)值均可，如取十組，如240、230、215、225、220、180、190、195、200、210 份；玄參240-300份，之間任意自然數(shù)值均可，如取十組，如240、300、285、295、290、250、260、270、255、275 份；玉竹180-240份，之間任意自然數(shù)值均可，如取十組，如240、230、215、225、220、180、190、195、200、210 份；地黃320-400份，之間任意自然數(shù)值均可，如取十組，如320、355、400、385、360、340、370、350、330、365 份；知母180-240份，之間任意自然數(shù)值均可，如取十組，如210、180、195、225、220、230、190、215、200、240 份
牡丹皮180-240份，之間任意自然數(shù)值均可，如取十組，如200、210、190、180、220、225、240、195、215、230 份；川芎240-300份，之間任意自然數(shù)值均可，如取十組，如275、300、285、295、255、250、260、270、290、240 份；虎杖320-400份，之間任意自然數(shù)值均可，如取十組，如375、300、400、385、330、340、370、350、360、320 份；五味子100-160份，之間任意自然數(shù)值 均可，如取十組，如160、100、150、110、135、145、140、115、120、130 份；上述共十二味藥，分成十組分別制作，本發(fā)明為治療糖尿病的藥物，為膠囊劑、片齊U、丸劑、顆粒劑中的一種。實施例2 :養(yǎng)陰降糖片中黃芪甲苷含量的檢測本實施例通過高效液相色譜法檢測了實施例I制備的養(yǎng)陰降糖片中黃芪甲苷的含量。儀器高效液相色譜儀，DIONEX,型號Ultimate 3000，蒸發(fā)光散射檢測器。試劑乙腈為色譜純試劑；水為超純水；其余試劑為分析純。對照品黃芪甲苷購自中國藥品生物制品檢定研究院。下文各實施例中涉及的相應儀器、試劑和對照品相同。I、色譜條件色譜柱BDSHYPERS IL C18 柱(250x4. 6mm, 5um);流動相:乙腈-水 32 68 ;用蒸發(fā)光散射檢測器檢測。流速1. Oml/min ；在以上色譜條件下對照品黃芪甲苷與相鄰色譜峰分離度大于2. O，理論塔板數(shù)按黃芪甲苷峰記不低于3000。2、對照品溶液的制備精密稱定黃芪甲苷對照品5. Olmg，加甲醇溶解并定容至IOml容量瓶中即得。3、供試品溶液的制備取本品10片，除去糖衣，研細，置具塞錐形瓶中，加80ml甲醇超聲提取30min第一次，倒出甲醇液，再加甲醇50ml超聲30min，合并提取液濃縮至干，殘渣加20ml水溶解，用水飽和正丁醇液萃取3次，每次20ml，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2次，每次20ml，棄去氨液，再用水飽和正丁醇洗滌2次，每次25ml，分取正丁醇層，置水浴鍋上蒸干，殘渣加甲醇溶解后轉(zhuǎn)移到5ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過O. 45um微孔濾膜，即得。4、測定法設定對照品溶液與供試品溶液進樣體積10μ 1，進行測定，即得。高效液相-蒸發(fā)光散射圖譜見圖I。將供試品圖譜與對照品圖譜比較，根據(jù)《中華人民共和國藥典》2010版附錄V D “高效液相色譜法”計算，測得每制劑單位含黃芪甲苷為O. 60mg，符合黃芪甲苷的含量計不少于O. 48mg的要求。實施例3 :采用薄層色譜法檢測知母；優(yōu)選地，采用薄層色譜法檢測知母包括以下步驟取本品10片，除去包衣，研碎，加乙醇50ml，加熱回流40分鐘，濾過，濾液加鹽酸3ml，加熱回流I小時，加水15ml，加氯仿25ml振搖提取，將氯仿提取液蒸干，殘渣加氯仿2ml使溶解，作為供試品溶液。
取菝葜皂苷元對照品，加氯仿制成每ml含Img的溶液即得。陰性對照溶液的制備取不含知母的陰性樣品照供試品溶液的制備依法操作，制成陰性對照溶液。
分別吸取上述供試品溶液、對照溶液、陰性對照溶液各5μ 1，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-丙酮(9 I)為展開劑，層析缸另槽加氨水2ml，展開，晾干至無氨味，噴以5%香草醛硫酸溶液，加熱至斑點顯色清晰。結(jié)果顯示，圖2為實施例3獲得的檢測知母的薄層色譜圖，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照溶液無干擾。實施例4 :采用薄層色譜法檢測黨參；優(yōu)選地，采用薄層色譜法檢測黨參包括以下步驟取本品10片，除去包衣，研碎，用乙醚超聲兩次(30，20ml)，IOmin/次，棄去乙醚液，殘渣揮盡乙醚，加水30ml，鹽酸3ml，置沸水浴中回流30min,冷卻,用氯仿萃取兩次(30,30ml),合并氯仿液,濃縮至Iml,作為供試液。取黨參對照藥材lg，加水適量煮沸30min，濾過，濾液濃縮至30ml，加鹽酸3ml，置沸水浴中回流30min,冷卻,用氯仿萃取兩次(30,30ml)合并氯仿液,濃縮至lml。取不含黨參的陰性樣品照供試品溶液的制備依法操作，制成陰性對照溶液。分別吸取供試液，對照品和黨參空白對照液各5ul，點于同一硅膠G板，以苯-醋酸乙酯-甲酸20 8 O. 5為展開劑，展開后晾干，噴以10%硫酸乙醇液，105°C烘至斑點清晰。結(jié)果在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照溶液無干擾；參看圖3為實施例4獲得的檢測黨參的薄層色譜圖。實施例5 :采用薄層色譜法檢測川芎；優(yōu)選地，采用薄層色譜法檢測川芎包括以下步驟取本品10片，除去包衣，研細，加乙醚20ml，超聲提取30min濾過，濾液蒸干，殘渣加乙酸乙酯Iml使溶解，作為供試液。取川芎對照藥材lg，加乙醚20ml，超聲提取20min濾過，濾液蒸干，殘渣加乙酸乙酯Iml使溶解，作為對照藥材溶液。取不含川芎的陰性樣品照供試品溶液的制備依法操作，制成陰性對照溶液。照薄層色譜法(中國藥典2010版一部附錄VI B)試驗，吸取上述三種溶液各5ul，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯(9 I)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365nm)下檢視。結(jié)果在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照溶液無干擾；圖4為實施例5獲得的檢測川芎的薄層色譜圖。實施例6 :采用薄層色譜法檢測牡丹皮；優(yōu)選地，采用薄層色譜法檢測牡丹皮包括以下步驟取本品10片，除去糖衣，研細，加乙醚30ml,超聲提取20min,濾過,合并乙醚液。藥洛揮盡乙醚,加甲醇150ml,超聲提取20min，濾過。濾液置水浴上蒸干，殘渣加水30ml使溶解，再加用水飽和的正丁醇80ml，分2次提取(50，30ml)。合并正丁醇液，加2倍量氨試液洗滌，棄去氨溶液，正丁醇液置水浴上蒸干。殘渣加80%甲醇3ml，轉(zhuǎn)移至已處理好的中性氧化鋁柱(內(nèi)徑約1cm，層析用中性氧化鋁100 200目，5g)上，用80%的甲醇50ml洗脫，洗脫液置水浴上蒸干，殘渣加醋酸乙酯Iml使溶解，作為供試品溶液。取芍藥苷對照品，加醋酸乙酯制成每毫升Img的溶液，作為對照品溶液。取不含牡丹皮的陰性樣品照供試品溶液的制備依法操作，制成陰性對照溶液。照薄層色譜法(中國藥典2010版一部附錄VI B)試驗，吸取上述溶液各10ul，分別點于同一羧甲基纖維素鈉為粘合劑的硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇-醋酸乙酯-甲酸40 10 5 O. 2為展開劑，展開，取出，晾干。噴以5%的香草醛硫酸溶液，在105°C烘至斑點清晰。結(jié)果在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照溶液無干擾；圖5為實施例6獲得的檢測牡丹皮的薄層色譜圖。實施例7采用薄層色譜法檢測葛根優(yōu)選地，采用薄層色譜法檢測葛根包括以下步驟取養(yǎng)陰降糖片10片，除去糖衣，研細，加醋酸乙酯20ml，超聲處理20min，濾過，濾液蒸干，加甲醇Iml溶解，作為葛根供試液。取葛根素對照品，加乙醇制成每ml含Img的溶液即得。取不含葛根的陰性樣品照供試品溶液的制備依法操作，制成陰性對照溶液。分別吸取供試液，對照品和葛根空白對照液各5ul，點于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇-水(7 2.5 O. 25)為展開劑，取出后晾干，置氨蒸氣中熏5 lOmin，紫外燈365nm下檢視。結(jié)果與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照溶液無干擾。圖6為實施例7獲得的檢測葛根素的薄層色譜圖。實施例8為進一步驗證其安全性和有效性，本發(fā)明在臨床應用中共總結(jié)480例，其中試驗組360例，對照組120例，收到了顯著的臨床療效，未發(fā)現(xiàn)任何毒副作用，現(xiàn)總結(jié)如下I.試驗設計類型、原則I. I試驗設計類型多中心、隨機、平行、陽性對照設計I. 2試驗設計原則(I)病例數(shù)按3: I對照原則，考慮不超過20%的退出率，總的例數(shù)確定為480例。(2)隨機分組法多中心、隨機、平行、陽性對照臨床觀察方法。借助SPSS12. 0(醫(yī)藥統(tǒng)計軟件名稱)統(tǒng)計分析系統(tǒng)產(chǎn)生480例受試者所接受處理(試驗藥和對照藥)的隨機安排，即列出流水號為OOl 480所對應的治療分配。本試驗由中國人民解放軍第三醫(yī)院、商洛市中醫(yī)醫(yī)院和蒲城縣醫(yī)院協(xié)同完成。隨機指定試驗中心號；中國人民解放軍第三醫(yī)院01、商洛市中醫(yī)醫(yī)院02、蒲城縣醫(yī)院03。對應藥物隨機編號為中國人民解放軍第三醫(yī)院001-120、商洛市中醫(yī)醫(yī)院121-300、蒲城縣醫(yī)院 301-480。(3)對照對照藥選用(產(chǎn)地吉林通化)降糖膠囊。理由降糖膠囊功能是清熱生津，滋陰潤燥。用于消渴癥，多飲，多尿，多食，消瘦，體倦無力及全身綜合癥。該藥功用主治與試驗藥物相近，是目前國內(nèi)療效較為肯定的同類藥物，療效肯定，符合公認有效、可比原則。2.治療方案2. I試驗用藥名稱和規(guī)格(I)試驗藥養(yǎng)陰降糖片，由地黃、玄參、枸杞子、玉竹、葛根、知母等中藥制成的片齊U。由陜西方舟制藥有限公司生 產(chǎn)，每一藥物隨機編號對應全部療程(8周用量)，用藥為8周±3天備用藥量，(2)對照藥降糖膠囊，由人參、知母、三顆針、五味子、干姜、人參莖葉皂苷制成的膠囊。由通化東日藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，每一藥物隨機編號對應全部療程(8周用量)，用藥為8周±3天備用藥量，國藥準字Z22022668。2. 2用藥方法(I)試驗組養(yǎng)陰降糖，一次8片，一日3次，口服。(2)對照組降糖膠囊，一次4 6粒，一日3次，口服。2. 3合并用藥在試驗期間，所有病例除以上治療以外，不得使用其他同類治療糖尿病的中西藥。醫(yī)生應要求患者在隨訪時必須將正在服用的所有藥物帶來，以檢查患者的合并用藥。合并疾病所必須繼續(xù)服用的藥物，或其他治療必須在格 式病案記錄藥名(或其他療法名)、用量、使用次數(shù)和時間等，以便總結(jié)時加以分析和報告。2.觀察指標2. I人口學資料年齡、身高、體重、職業(yè)、生育情況、既往史、合并疾病、合并用藥等。2. 2—般體格檢查呼吸、心率、血壓、體溫。2. 3安全性觀測(I)血、尿、便常規(guī)檢查(2)心、肝、腎功能檢查。(3)可能出現(xiàn)的不良反應及其相關檢測指標。詳細記錄不良反應發(fā)生時間、臨床癥狀、持續(xù)時間、處理措施及消失時間。2. 4療效性觀測(I)相關癥狀主癥、兼癥及舌脈變化。(2)相關體征一般情況如體溫的變化。(3)空腹及餐后2小時血糖檢測。3.療效評定標準3. I綜合療效評定標準(I)顯效治療后癥狀基本消失，空腹血糖< 7. 2mmol/L(130mg/dl)餐后2小時血糖< 8. 3mmol/L (150mg/dl)。(2)有效治療后癥狀基本消失，空腹血糖< 8. 3mmol/L(150mg/dl)餐后2小時血糖< 10. Ommol/L (180mg/dl)。(3)無效達不到以上標準者。3. 2主要指標(局部體征)療效評定標準(I)顯效治療后體征明顯減輕，積分值減少彡70%，< 95%，或降低I個級別。(2)有效治療后體征有所減輕，積分值減少30%，< 70%，或降低不足I級別。(3)無效達不大以上標準者。3. 3癥候療效評定標準(I)顯效治療后各癥狀明顯減輕，癥候積分值減少彡70%, < 95%。(2)有效治療后各癥狀有所減輕，癥候積分值減少30%，< 70%。
(3)無效達不到以上標準者。4.統(tǒng)計學4. I統(tǒng)計分析人群FAS集(full analysis set),全分析集,包括所有隨機化入組的病例。而且至少服過一次藥物，并有至少一次的療效隨訪記錄。PPS (per protocol set),符合方案集,這是FAS總體的子集合,符合方案中入選排除標準，依從性好，試驗期間未服用禁用藥物 、完成CRF表。4. 2統(tǒng)計分析方法統(tǒng)計分析將采用SPSS12. O統(tǒng)計分析軟件，采用雙側(cè)檢驗，P值小于或等于O. 05將被認為所檢驗差別有統(tǒng)計學意義。5試驗結(jié)果兩組病例分布情況；本試驗受試者入組總數(shù)為480例，其中試驗組360例，對照組120例，試驗組脫落數(shù)24例，脫落率6. 67%，剔除率5例，剔除率I. 39%，完成病例數(shù)111例，兩組脫落，剔除率的比較無顯著性差異。
權利要求
1.一種養(yǎng)陰降糖中藥組合物，其特征是由以下重量配比范圍的原料藥制成黃芪460-540份，黨參180-240份，葛根240-300份，枸杞子180-240份，玄參240-300份，玉竹180-240份，地黃320-400份，知母180-240份，牡丹皮180-240份，川芎240-300份，虎杖320-400份，五味子100-160份，共十二味藥；優(yōu)選地，制成的中藥組合物每制劑單位含葛根以葛根素含量計不得少于I. 6mg且和黃芪甲苷的含量計不少于O. 48mg。
2.根據(jù)權利要求I所述的一種養(yǎng)陰降糖中藥組合物，其特征是由以下重量配比較佳范圍的原料藥制成黃芪495-505份，黨參215-225份，葛根285-295份，枸杞子215-225份，玄參285-295份，玉竹215-225份，地黃355-365份，知母215-225份，牡丹皮215-225份，川芎285-295份，虎杖355-365份，五味子135-145份，共十二味藥；優(yōu)選地，制成的中藥組合物每制劑單位含葛根以葛根素含量計不得少于I. 6mg且和黃芪甲苷的含量計不少于O. 48mg。
3.根據(jù)權利要求I所述的一種養(yǎng)陰降糖中藥組合物，其特征是由以下重量配比定值的原料藥制成黃芪500g，黨參220g，葛根290g，枸杞子220g，玄參290g，玉竹220g，地黃360g，知母220g，牡丹皮220g，川芎290g，虎杖360g，五味子140g ;優(yōu)選地，制成的中藥組合物每制劑單位含葛根以葛根素含量計不得少于I. 6mg且和黃芪甲苷的含量計不少于O.48mg。
4.根據(jù)權利要求I或2或3所述的養(yǎng)陰降糖中藥組合物的制備方法，其特征在于，所述中藥組合物的劑型為片劑、丸劑或者膠囊劑固體制劑，優(yōu)選為片劑薄膜衣片；其制備方法為以下步驟知母，枸杞子，牡丹皮和五味子粉碎成細粉，黃芪，葛根粉碎成最粗粉，照中國藥典附錄流浸膏劑與浸膏劑項下的滲濾法(附錄I 0)，用70%的乙醇為溶劑進行滲濾，收集滲濾液；藥渣與其余黨參等六味加水煎煮2次，每次2小時，第一次加水10倍量，第二次加水8倍量，合并煎液，濾過，滲濾液回收乙醇后，與上述濾液合并，減壓濃縮成稠膏，干燥后粉碎成細粉，與上述細粉混合均勻，加輔料，選自適量填充劑淀粉、糊精、甘露醇、微晶纖維素、羧甲基淀粉鈉中的至少一種混合，如淀粉適量，混勻，用60%乙醇制軟材，過16目篩網(wǎng)制成濕顆粒，干燥，16目篩網(wǎng)整粒；取輔料，選適量自潤滑劑滑石粉、二氧化硅或硬脂酸鎂中的至少一種混合，如硬脂酸鎂適量加入干顆粒，混勻，壓制成1000片，包薄膜衣，O. 6g/片，即得。
5.根據(jù)權利要求4所述的養(yǎng)陰降糖中藥組合物制備方法制成的中藥組合物的檢測方法，其特征在于，所述檢測方法采用高效液相色譜法檢測中藥組合物中黃芪的含量，含黃芪甲苷的含量計不少于O. 48mg ;所述檢測中藥組合物中黃芪甲苷的含量的高效液相色譜條件為 色譜柱BDS HYPERSIL C18 柱(250x4. 6mm, 5um);流動相乙腈-水(32 68);用蒸發(fā)光散射檢測器檢測，流速1. Oml/min ； 在以上色譜條件下對照品黃芪甲苷與相鄰色譜峰分離度大于2. 0，理論塔板數(shù)按黃芪甲苷峰記不低于3000 ； 所述檢測中藥組合物中黃芪甲苷的含量還包括制備供試品溶液，所述制備供試品溶液步驟取本品10片，除去糖衣，研細，置具塞錐形瓶中，加80ml甲醇超聲提取30min第一次，倒出甲醇液，再加甲醇50ml超聲30min,合并提取液濃縮至干,殘洛加20ml水溶解,用水飽和正丁醇液萃取3次，每次20ml，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2次，每次20ml，棄去氨液，再用水飽和正丁醇洗滌2次，每次25ml，分取正丁醇層，置水浴鍋上蒸干，殘渣加甲醇溶解后轉(zhuǎn)移到5ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過O. 45um微孔濾膜，即得。
所述檢測中藥組合物中黃芪甲苷的含量還包括制備對照品溶液，所述制備對照品溶液步驟精密稱定黃芪甲苷對照品5. Olmg，加甲醇溶解并定容至IOml容量瓶中，即得。
6.根據(jù)權利要求4所述的養(yǎng)陰降糖中藥組合物制備方法制成的中藥組合物的檢測方法，其特征在于所述檢測方法測得的中藥組合物每制劑單位含葛根素含量計不少于I.6mg。
7.根據(jù)權利要求4所述的養(yǎng)陰降糖中藥組合物制備方法的中藥組合物的檢測方法，其特征在于所述檢測方法還包括以下步驟 (1)采用薄層色譜法檢測知母； 優(yōu)選地，采用薄層色譜法檢測知母包括以下步驟取本品10片，除去包衣，研碎，加乙醇50ml，加熱回流40分鐘，濾過，濾液加鹽酸3ml，加熱回流I小時，加水15ml，加氯仿25ml振搖提取，將氯仿提取液蒸干，殘渣加氯仿2ml使溶解，作為供試品溶液。
取菝葜皂苷元對照品，加氯仿制成每ml含Img的溶液即得；陰性對照溶液的制備取不含知母的陰性樣品照供試品溶液的制備依法操作，制成陰性對照溶液； 分別吸取上述供試品溶液、對照溶液、陰性對照溶液各5 μ 1，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-丙酮(9 I)為展開劑，層析缸另槽加氨水2ml，展開，晾干至無氨味，噴以5%香草醛硫酸溶液，加熱至斑點顯色清晰，結(jié)果顯示，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照溶液無干擾。
(2)采用薄層色譜法檢測覺皇； 優(yōu)選地，采用薄層色譜法檢測黨參包括以下步驟取本品10片，除去包衣，研碎，用乙醚超聲兩次(30，20ml)，IOmin/次，棄去乙醚液，殘渣揮盡乙醚，加水30ml，鹽酸3ml，置沸水浴中回流30min,冷卻,用氯仿萃取兩次(30, 30ml),合并氯仿液,濃縮Iml,作為供試液； 取黨參對照藥材lg，加水適量煮沸30min，濾過，濾液濃縮至30ml，加鹽酸3ml，置沸水浴中回流30min,冷卻,用氯仿萃取兩次(30,30ml)合并氯仿液,濃縮至lml。取不含黨參的陰性樣品照供試品溶液的制備依法操作，制成陰性對照溶液； 分別吸取供試液，對照品和黨參空白對照液各5ul，點于同一硅膠G板，以體積比.20 8 O. 5苯-醋酸乙酯-甲酸為展開劑，展開后晾干，噴以10%硫酸乙醇液，105°C烘至斑點清晰，結(jié)果在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照溶液無干擾； (3)采用薄層色譜法檢測in直； 優(yōu)選地，采用薄層色譜法檢測川芎包括以下步驟取本品5片，除去包衣，研細，加乙醚20ml，超聲提取30min濾過，濾液蒸干，殘渣加乙酸乙酯Iml使溶解，作為供試液； 取川芎對照藥材lg，加乙醚20ml，超聲提取20min濾過，濾液蒸干，殘渣加乙酸乙酯Iml使溶解，作為對照藥材溶液，取不含川芎的陰性樣品照供試品溶液的制備依法操作，制成陰性對照溶液； 照薄層色譜法(中國藥典2010版一部附錄VI B)試驗，吸取上述三種溶液各5ul，分別點于同一硅膠G薄層板上，以體積比9 I環(huán)己烷-乙酸乙酯為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365nm)下檢視，結(jié)果在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照溶液無干擾；(4)采用薄層色譜法檢測牡丹皮; 優(yōu)選地，采用薄層色譜法檢測牡丹皮包括以下步驟取本品10片，除去糖衣，研細，力口乙醚30ml,超聲提取20min,濾過,合并乙醚液,藥洛揮盡乙醚，加甲醇150ml,超聲提20min,濾過，濾液置水浴上蒸干，殘洛加水30ml使溶解,再用水飽和的正丁醇液80ml，分2次提取(50，30ml)，合并正丁醇液，加2倍量氨試液洗滌，棄去氨溶液，正丁醇液置水浴上蒸干，殘渣加80%甲醇3ml，轉(zhuǎn)移至已處理好的中性氧化鋁柱(內(nèi)徑約1cm，層析用中性氧化鋁100 200目，5g)上，用80%的甲醇50ml洗脫 ，洗脫液置水浴上蒸干，殘渣加醋酸乙酯Iml使溶解，作為供試品溶液； 取芍藥苷對照品，加醋酸乙酯制成每毫升Img的溶液，作為對照品溶液，取不含牡丹皮的陰性樣品照供試品溶液的制備依法操作，制成陰性對照溶液； 照薄層色譜法(中國藥典2010版一部附錄VI B)試驗，吸取上述溶液各10ul，分別點于同一羧甲基纖維素鈉為粘合劑的硅膠G薄層板上，以體積比40 10 5 O. 2氯仿-甲醇-醋酸乙酯-甲酸為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%的香草醛硫酸溶液，在105°C烘至斑點清晰，結(jié)果在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照溶液無干擾； (5)采用薄層色譜法檢測葛顯 優(yōu)選地，采用薄層色譜法檢測葛根包括以下步驟取養(yǎng)陰降糖片10片，除去糖衣，研細，加醋酸乙酯20ml，超聲處理20min，濾過，濾液蒸干，加甲醇Iml溶解，作為葛根供試液；取葛根素對照品，加乙醇制成每ml含Img的溶液即得，取不含葛根的陰性樣品照供試品溶液的制備依法操作，制成陰性對照溶液； 分別吸取供試液，對照品和葛根空白對照液各5ul，點于同一硅膠G薄層板上，以體積比7 : 2.5 : O. 25氯仿-甲醇-水為展開劑，取出后晾干，置氨蒸氣中熏5 lOmin，紫外燈365nm下檢視，結(jié)果與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照溶液無干擾。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種具有養(yǎng)陰益氣，清熱活血功能的中藥組合物及其制備方法和檢測方法。該中藥組合物由黃芪、黨參、葛根、枸杞子、玄參、玉竹、地黃、知母、牡丹皮、川芎、虎杖、五味子等十二味藥組成，制成片劑，包薄膜衣，0.6g/片，其每制劑單位含葛根以葛根素含量計不得少于1.6mg且和黃芪甲苷的含量計不少于0.48mg。優(yōu)點和效果其品質(zhì)更加穩(wěn)定、療效更加確切，該檢測方法包括采用高效液相色譜法檢測中藥組合物中葛根素的含量和黃芪甲苷的含量，該方法更加簡便、穩(wěn)定，精密度高、重現(xiàn)性好，能夠全面、有效地表征養(yǎng)陰降糖中藥組合物的有效成分含量，有利用于監(jiān)控產(chǎn)品的質(zhì)量。
文檔編號G01N30/88GK102614378SQ20121012683
公開日2012年8月1日 申請日期2012年4月26日 優(yōu)先權日2012年4月26日
發(fā)明者杜小英, 王宇 申請人:陜西方舟制藥有限公司