專利名稱：川芎茶調(diào)顆粒制劑指紋圖譜的測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬中藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種川芎荼調(diào)顆粒制劑指紋圖譜的測(cè)定方法，具體地說(shuō)是用高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜鑒別方法來(lái)測(cè)定川芎茶調(diào)顆粒制劑中特征成分的方法。
背景技術(shù)：
川芎茶調(diào)顆粒原方出自于宋《太平惠民和劑局方》，具有疏風(fēng)止痛作用，用于風(fēng)邪頭痛，或有惡寒、發(fā)熱、鼻塞。此方主要由川芎、荊芥、防風(fēng)、細(xì)辛、白芷、憲活、薄荷、甘草組成 (參見(jiàn)，林曉蘭.川芎茶調(diào)顆粒臨床應(yīng)用情況分析[J].北京中醫(yī)，2004，23 (3) =190-192), 其療效確切。據(jù)信川芎茶調(diào)顆粒具有抗血小板凝聚，緩解小血管痙攣，改善心腦組織供血供氧，從而達(dá)到活血化瘀，活絡(luò)通脈，疏風(fēng)止痛之功效?？蛇m用于血管性、神經(jīng)性、緊張性、頸椎病等引起的各種頭痛及偏頭痛；適用于風(fēng)寒感冒、惡寒、發(fā)熱、鼻塞及鼻竇炎等病癥。預(yù)防腦溢血發(fā)作，腦血栓形成以及改善腦血管疾病后遺癥。中國(guó)藥典2010年版一部第472-274頁(yè)分別收錄了川芎茶調(diào)丸和川芎茶調(diào)散兩種中藥成方制劑，其配方為川芎120g、白芷60g、羌活60g、細(xì)辛30g、防風(fēng)45g、荊芥120g、薄荷 240g、甘草60g。川芎茶調(diào)丸是使各藥材粉碎成細(xì)粉后混勻，用水泛丸制成；川芎茶調(diào)散則是使各藥材粉碎成細(xì)粉后直接混勻即可。然而藥典收載的兩個(gè)制劑僅做TLC鑒別，并不作進(jìn)一步的質(zhì)量控制，例如并不作含量測(cè)定。CN1739612A(中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?200510032127. 2，
公開日:2006-03_01，發(fā)明名稱 疏風(fēng)止痛的中藥制劑及其制備方法和質(zhì)量控制方法)公開了用于疏風(fēng)止痛的主要組成成分為川芎、白芷、憲活、細(xì)辛、防風(fēng)、薄荷、荊芥、甘草的川芎荼調(diào)滴丸或微丸或微丸膠囊或膠囊或軟膠囊，這些制劑的質(zhì)量控制方法，包括用TLC法進(jìn)行鑒別，用HPLC法以阿魏酸為指標(biāo)進(jìn)行含量測(cè)定。其中TLC法條件包括用硅膠G薄層板，以氯仿-石油醚(60 90°C ) (8 9.5 0. 5 2)為展開劑，置紫外光燈(300-400nm)下檢視供試品色譜中的熒光斑點(diǎn)。HPLC 法的色譜條件是用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以冰乙酸-甲醇-水(0. 5 5 30
50 50 70)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為295 355nm，理論板數(shù)按阿魏酸峰計(jì)不低于2000，并以阿魏酸采用外標(biāo)法進(jìn)行定量。中藥指紋圖譜是指某種中藥材或中成藥中所共有的、具有特征性的某類或數(shù)類成分的色譜或光譜的圖譜。在現(xiàn)階段中藥的有效成分絕大多數(shù)沒(méi)有明確的情況下，中藥指紋圖譜對(duì)于有效控制中藥材或中成藥的質(zhì)量具有重要的意義。日本漢方藥主要生產(chǎn)企業(yè)在20 世紀(jì)80年代就已經(jīng)在企業(yè)內(nèi)部采用高效液相指紋圖譜控制質(zhì)量。德國(guó)、法國(guó)在對(duì)銀杏葉提取物聯(lián)合開發(fā)的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物的醫(yī)療作用是提取物所得物質(zhì)群的整體作用結(jié)果，而對(duì)這樣一個(gè)整體的質(zhì)量控制，亦采用高效液相指紋圖譜方法。美國(guó)FDA最近幾年制定的植物草藥指南中已經(jīng)明確把指紋圖譜作為混合物質(zhì)群的質(zhì)量控制方法(FDA. Guidance of Industv Botanical Drug(Draft) 2000August)。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)，作為中醫(yī)理論的實(shí)踐產(chǎn)物，中藥，尤其是復(fù)方中藥，其中所含的任一成分都不能代表其整體療效。人們逐漸認(rèn)識(shí)到，現(xiàn)行的參照西藥(合成藥)質(zhì)量控制模式的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不能恰當(dāng)?shù)胤从持兴巸?nèi)在的質(zhì)量。從現(xiàn)行單一指標(biāo)性成分的質(zhì)量控制模式向一種綜合的、宏觀的、可量化的質(zhì)量控制方法的轉(zhuǎn)化，已是發(fā)展的趨勢(shì)。中藥現(xiàn)行的定量評(píng)價(jià)方法利用光譜或色譜手段鑒別和測(cè)定某一種或幾種有效成分、活性成分或指標(biāo)成分，而大多數(shù)品種僅有一般的檢查項(xiàng)目。顯然，這些質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的設(shè)置是模仿了化學(xué)藥品的模式。其它國(guó)家如英國(guó)、印度、美國(guó)草藥典、日本藥局方中的漢藥及德國(guó)Commission E編輯的德國(guó)草藥專論等也采用了基本相同的內(nèi)容。對(duì)于化學(xué)藥品而言， 其藥效成分為結(jié)構(gòu)清晰的單一化合物，構(gòu)效關(guān)系明確，其有效成分含量和純度可直接表達(dá)其安全及有效性。然而，中醫(yī)用藥的特點(diǎn)是復(fù)方配伍，任何單一的有效(活性)成分或指標(biāo)成分的含量高低均不能表達(dá)其整體的療效。例如，黃芪所含的黃芪甲苷(aastraga Ioside IV)是當(dāng)前被選擇為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的鑒別和含量測(cè)定的最為常見(jiàn)的目標(biāo)，但并沒(méi)有依據(jù)證明黃芪甲苷與黃芪的功能主治的明確聯(lián)系。同樣，黃連、黃柏、三棵針均含小檗堿，一般都以它作為檢測(cè)的目標(biāo)，但是三者的功能主治卻截然不同。復(fù)方制劑的情況就更加復(fù)雜。中醫(yī)這種不是一對(duì)一的非線性的理論和實(shí)踐說(shuō)明中藥質(zhì)量應(yīng)該采用某種宏觀的綜合的質(zhì)量評(píng)價(jià)手段。川芎荼調(diào)顆粒是由川芎等8種藥材制成的顆粒劑，具有疏風(fēng)止痛作用，用于風(fēng)邪頭痛，或有惡寒、發(fā)熱、鼻塞，其治療效果已經(jīng)得到臨床的驗(yàn)證，然而是否能夠保證川芎茶調(diào)顆粒的質(zhì)量，是決定川芎茶調(diào)顆粒療效的基礎(chǔ)。如果僅用一、二種有效成分來(lái)說(shuō)明川芎茶調(diào)顆粒的內(nèi)在質(zhì)量，存在著中藥質(zhì)量控制的片面性，更不用說(shuō)以無(wú)藥效成分為質(zhì)量控制了。因此，要控制川芎茶調(diào)顆粒的質(zhì)量，只針對(duì)其一、二個(gè)化學(xué)成分進(jìn)行表征和控制是不夠的，必須對(duì)它的物質(zhì)群整體從宏觀上予以控制。所以，除了“微觀分析”外，還應(yīng)該用某種“宏觀分析”方法，從整體上有效地表征中藥質(zhì)量。指紋圖譜作為中草藥及其提取物質(zhì)量控制方法， 目前已經(jīng)得到國(guó)際公認(rèn)。現(xiàn)在，對(duì)該品中阿魏酸、甘草酸等的測(cè)定方法較多，但如何能夠從更宏觀的角度采用指紋圖譜鑒別方法，對(duì)川芎茶調(diào)顆粒中的各種化學(xué)組分進(jìn)行控制卻未見(jiàn)報(bào)道，也是本領(lǐng)域技術(shù)人員期待。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種川芎茶調(diào)制劑特征指紋圖譜的測(cè)定方法，通過(guò)此測(cè)定辦法，可控制川芎茶調(diào)制劑質(zhì)量。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)具有特定測(cè)定條件的測(cè)定方法可以有效的用于控制川芎茶調(diào)制劑質(zhì)量。為此，本發(fā)明第一方面提供了一種川芎茶調(diào)制劑特征指紋圖譜的測(cè)定方法，其是照高效液相色譜法測(cè)定，包括以下步驟(a)川芎茶調(diào)制劑供試品的制備精密稱取川芎茶調(diào)制劑適量，加溶劑回流提取， 提取液離心，上清液蒸發(fā)干燥，再用水溶解，然后用正丁醇萃取，收集正丁醇萃取液，蒸干， 用70%甲醇溶解，用微孔濾膜濾過(guò)，即為供試品；(b)色譜條件十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料的色譜柱；采用梯度洗脫，流動(dòng)相A 為乙腈；流動(dòng)相B為0. 01 0. 2%甲酸水溶液，檢測(cè)波長(zhǎng)230 280nm ；(c)測(cè)定精密吸取供試品溶液，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，得到川芎茶調(diào)制劑的特征指紋圖譜。在本發(fā)明中，所述“高效液相色譜法”的一般操作規(guī)范可以不作限定。在第一方面
6方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述的高效液相色譜法可以是記載于包括但不限于下列文件中的方法中華人民共和國(guó)藥典2010年版二部附錄VD、中華人民共和國(guó)藥典2010年版一部附錄VID、中華人民共和國(guó)藥典2005年版二部附錄VD、中華人民共和國(guó)藥典2005年版一部附錄VID等。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(a)中，回流提取所用溶劑是20 80%乙醇，優(yōu)選30 70%乙醇，例如40 60%乙醇，例如約50%乙醇。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(a)中，回流提取的時(shí)間為10 60分鐘， 例如20 40分鐘，例如約30分鐘。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(a)中，所述正丁醇是水飽和的正丁醇。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(a)為精密稱取樣品5g，研細(xì)，精密加入 25ml 50 %乙醇溶液，加熱回流30分鐘，放冷，補(bǔ)重，搖勻，離心(例如10分鐘，例如4000轉(zhuǎn)/ 分鐘)，吸取上清液IOml置蒸發(fā)皿中，蒸干，用5ml水溶解，分次用水飽和正丁醇萃取三次， 每次25ml，收集正丁醇萃取液，蒸干，用70 %甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5ml容量瓶中，用0. 45 y m微孔濾膜濾過(guò)，即為供試品。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(a)中，經(jīng)微孔濾膜濾過(guò)后，所得供試品可以任選地根據(jù)需要作進(jìn)一步的稀釋。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中在進(jìn)行步驟(a)操作時(shí)，還可以另外進(jìn)行對(duì)照品溶液的配制的操作。在一個(gè)實(shí)施方案中，包括阿魏酸對(duì)照品溶液的制備步驟精密稱取阿魏酸對(duì)照品適量，加70%甲醇制成每Iml含0. 5mg的對(duì)照品溶液，搖勻，即得。在一個(gè)實(shí)施方案中，包括甘草酸銨對(duì)照品溶液的制備步驟精密稱取甘草酸銨對(duì)照品適量，加70%甲醇制成每Iml含0. 5mg的對(duì)照品溶液，搖勻，即得。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(b)中，所述色譜柱的長(zhǎng)度為150mm 250mm,例如約 150mm、200mm、250mm。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(b)中，所述色譜柱的柱徑為4mm 5mm，例如約4. 6mmo根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(b)中，所述色譜柱填料的粒度為2
10u m,例如約5 u mo根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(b)中，所述流動(dòng)相B為0.02 0. 1%甲酸水溶液，優(yōu)選約0. 05%甲酸水溶液。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(b)中，所述檢測(cè)波長(zhǎng)240 270nm，優(yōu)選 250 260nm，優(yōu)選約 254nm。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(b)中，所述梯度洗脫程序?yàn)?br> 權(quán)利要求
1.川芎茶調(diào)制劑特征指紋圖譜的測(cè)定方法，其是照高效液相色譜法測(cè)定，包括以下步驟(a)川芎荼調(diào)制劑供試品的制備精密稱取川芎茶調(diào)制劑適量，加溶劑回流提取，提取液離心，離心上清液蒸發(fā)干燥，再用水溶解，然后用正丁醇萃取，收集正丁醇萃取液，蒸干， 用70%甲醇溶解，用微孔濾膜濾過(guò)，即為供試品；(b)色譜條件十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料的色譜柱；采用梯度洗脫，流動(dòng)相A為乙腈；流動(dòng)相B為O. 01 O. 2%甲酸水溶液，檢測(cè)波長(zhǎng)230 280nm ；(c)測(cè)定精密吸取供試品溶液，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，得到川芎茶調(diào)制劑的特征指紋圖譜。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其特征在于步驟(a)中回流提取所用溶劑是20 80%乙醇、回流提取的時(shí)間為10 60分鐘、和/或正丁醇是水飽和的正丁醇。
3.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中步驟(a)為精密稱取樣品5g，研細(xì)，精密加入25ml 50%乙醇溶液，加熱回流30分鐘，放冷，補(bǔ)重，搖勻，離心，吸取上清液IOml置蒸發(fā)皿中，蒸干，用5ml水溶解，分次用水飽和正丁醇萃取三次，每次25ml，收集正丁醇萃取液，蒸干，用 70%甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5ml容量瓶中，用O. 45 μ m微孔濾膜濾過(guò)，即為供試品。
4.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其特征在于步驟(b)中色譜柱的長(zhǎng)度為200mm 300mm、 色譜柱的柱徑為4mm 5mm、色譜柱填料的粒度為2 10 μ m、流動(dòng)相B為O. 02 O. I %甲酸水溶液、和/或檢測(cè)波長(zhǎng)240 270nm。
5.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中步驟(b)中，所述梯度洗脫程序?yàn)?br> 6.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中步驟(b)中，所述色譜條件為十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料的色譜柱，柱長(zhǎng)250mm，柱徑4. 6mm,填料粒度5 μ m ;采用梯度洗脫，流動(dòng)相A為乙腈； 流動(dòng)相B為O. 05%甲酸水溶液；檢測(cè)波長(zhǎng)254nm ;流速lml/min ;柱溫20°C。
7.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中以甘草酸銨的相對(duì)峰面積為100%計(jì)，相對(duì)峰面積大于 3%的峰有22個(gè)，以甘草酸銨峰的相對(duì)保留時(shí)間Rt = I. 00計(jì)，各峰相對(duì)保留時(shí)間分別約為峰IRt = O.11，峰12Rt ==O.65，峰2Rt ==O.17，峰13Rt ==O.72，峰3Rt ==O.23，峰14Rt ==O.74，峰 4Rt =O. 26，峰 15Rt ==O. 75，峰 5Rt =O. 30，峰 16Rt ==O. 79，峰 6Rt =O. 38，峰 17Rt ==O. 87，峰 7Rt =O. 46，峰 18Rt ==O. 94,峰 8Rt =O. 47，峰 19Rt ==O. 98,峰 9Rt =O. 49，峰 20Rt ==I. 00,峰 IORt ==O. 52，峰 21Rt=I. 01,峰 IlRt ==O. 58，峰 22Rt=I. 04。
8.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中以甘草酸銨的相對(duì)峰面積為100%計(jì)，相對(duì)峰面積大于;的峰至少有15個(gè)，以甘草酸銨峰的相對(duì)保留時(shí)間Rt = I. 00計(jì)，各峰相對(duì)保留時(shí)間分別約為峰 2Rt =O. 17,峰 12Rt =O. 65，峰 3Rt =O. 23，峰 13Rt =O. 72，峰 6Rt =O. 38，峰 16Rt =O. 79，峰 8Rt =O. 47，峰 18Rt =O. 94,峰 9Rt =O. 49,峰 19Rt =O. 98,峰 IORt ==O. 52，峰 20Rt =I. 00,峰 IlRt ==O. 58，峰 2IRt =I. 01，峰 22Rt ==I. 04。
9.根據(jù)權(quán)利要求I至8任一項(xiàng)的方法，其中所述川芎茶調(diào)制劑的原料藥材組成包括川芎120重量份，白芷45 - 75重量份，憲活45廣一 75重量份，甘草45 75重量份，防風(fēng)33- 56重量份，細(xì)辛22 38重量份，薄荷180 300重量份，荊芥90 150重量份。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述川芎茶調(diào)制劑是由包括以下步驟的方法制備的(1)取川芎、白芷、羌活、細(xì)辛、防風(fēng)、甘草，加水煎煮，煎液濾過(guò)，藥液備用；(2)薄荷、荊芥提取揮發(fā)油，備用；其水溶液濾過(guò)，濾液與步驟(I)所得藥液合并；(3)將步驟(2)所得合并藥液，濃縮，干燥，制成浸膏粉；(4)將步驟(2)所得揮發(fā)油均勻摻入到步驟(3)所得浸膏粉中，再任選地均勻摻入藥學(xué)可接受的輔料，制成制劑，即得。
11.一種川芎茶調(diào)制劑，該制劑的原料藥材組成包括川芎120重量份，白芷45 75重量份，憲活45 75重量份， 甘草45 75重量份，防風(fēng)33 56重量份， 細(xì)辛22 38重量份，薄荷180 300重量份，荊芥90 150重量份；并且該制劑按照權(quán)利要求I至8任一項(xiàng)的方法測(cè)試，具有以下特征的指紋圖譜以甘草酸銨的相對(duì)峰面積為100%計(jì)，相對(duì)峰面積大于3%的峰有22個(gè)，以甘草酸銨峰的相對(duì)保留時(shí)間Rt = I. 00計(jì)，各峰相對(duì)保留時(shí)間分別約為峰 IRt = 0.11，峰 12Rt = 0.65，峰2Rι = 0.17，峰13Rι =0.72，峰3Rι = 0.23，峰14Rι = 0.74，峰4Rt = 0.26，峰15Rt = 0.75，峰5Rι = 0.30，峰16Rι = 0.79，峰6Rι = 0.38，峰 17Rι = 0.87，峰7Rt = 0.46，峰18Rt = 0.94，峰8Rι = 0.47，峰19Rι = 0.98，峰9Rι = 0.49，峰20Rι = 1.00，峰10Rt = 0.52，峰21Rt = 1.01，峰11Rι = 0.58，峰22Rι = 1.04。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的川芎茶調(diào)制劑，其按照權(quán)利要求I至8任一項(xiàng)的方法測(cè)試，具有以下特征的指紋圖譜以甘草酸銨的相對(duì)峰面積為100%計(jì)，相對(duì)峰面積大于10%的峰至少有15個(gè)，以甘草酸銨峰的相對(duì)保留時(shí)間Rt =1.00計(jì)，各峰相對(duì)保留時(shí)間分別約為峰 2Rt =O. 17,峰 12Rt=O. 65，峰 3Rt =O. 23，峰 13Rt=O. 72，峰 6Rt =O. 38，峰 16Rt=O. 79，峰 8Rt =O. 47，峰 18Rt=O. 94，峰 9Rt =O. 49,峰 19Rt=O. 98，峰 IORt =O. 52， 峰 20Rt=I. 00，峰 IlRt =O. 58， 峰 2IRt=1. 01,峰 22Rt =I. 04。
13.根據(jù)權(quán)利要求11的川芎茶調(diào)制劑，其是由包括以下步驟的方法制備的(1)取川芎、白芷、羌活、細(xì)辛、防風(fēng)、甘草，加水煎煮，煎液濾過(guò)，藥液備用；(2)薄荷、荊芥提取揮發(fā)油，備用；其水溶液濾過(guò)，濾液與步驟(I)所得藥液合并；(3)將步驟(2)所得合并藥液，濃縮，干燥，制成浸膏粉；(4)將步驟(2)所得揮發(fā)油均勻摻入到步驟(3)所得浸膏粉中，再任選地均勻摻入藥學(xué)可接受的輔料，制成制劑，即得。
14.根據(jù)權(quán)利要求11至13任一項(xiàng)的川芎茶調(diào)制劑，其中所述制劑選自顆粒劑、片齊IJ、硬膠囊劑、軟膠囊劑、散劑等。
全文摘要
本發(fā)明涉及川芎茶調(diào)顆粒制劑特征指紋圖譜的測(cè)定方法，包括以下步驟(a)川芎茶調(diào)制劑供試品的制備精密稱取川芎茶調(diào)制劑適量，加溶劑回流提取，提取液離心，上清液蒸發(fā)干燥，再用水溶解，然后用正丁醇萃取，收集正丁醇萃取液，蒸干，用70％甲醇溶解，用微孔濾膜濾過(guò)，即為供試品；(b)色譜條件十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料的色譜柱；采用梯度洗脫，流動(dòng)相A為乙腈；流動(dòng)相B為0.01～0.2％甲酸水溶液，檢測(cè)波長(zhǎng)230～280nm；(c)測(cè)定精密吸取供試品溶液，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，得到川芎茶調(diào)制劑的特征指紋圖譜。本發(fā)明川芎荼調(diào)制劑例如顆粒劑的HPLC特征指紋圖譜分析方法操作簡(jiǎn)單，精密度高，重復(fù)性好，適用于川芎茶調(diào)制劑例如顆粒劑的質(zhì)量控制。
文檔編號(hào)G01N30/06GK102590423SQ20121004465
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月27日
發(fā)明者唐靖雯, 張麗艷, 李孟林, 梁斌, 梅基雄, 潘梅, 謝宇 申請(qǐng)人:貴州威門藥業(yè)股份有限公司