專(zhuān)利名稱(chēng)：骨質(zhì)疏松相關(guān)骨密度基因位點(diǎn)檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
[0001]本實(shí)用新型涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及檢測(cè)骨質(zhì)疏松相關(guān)骨密度基因位點(diǎn)是否發(fā)生突變的試劑盒，通過(guò)同時(shí)檢測(cè)與骨質(zhì)疏松密切相關(guān)的低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5 (LRP5)和Jagged I蛋白(JAGl)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型來(lái)評(píng)估個(gè)體患骨質(zhì)疏松癥的風(fēng)險(xiǎn)。
背景技術(shù)：
骨骼是一直處于降解和重建的動(dòng)態(tài)過(guò)程的器官，即由成骨細(xì)胞引起的骨化和破骨細(xì)胞引起的骨吸收相伴行。骨密度和骨結(jié)構(gòu)的異常會(huì)導(dǎo)致如骨質(zhì)疏松癥、骨硬化、硬化性狹窄等。眾多研究表明骨密度的變化很大程度上受遺傳因素的影響。低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5 (LRP5)基因近來(lái)被確認(rèn)是影響骨密度的幾個(gè)候選基因之一，LRP5基因的異常可導(dǎo)致骨密度的異常降低或升高。LRP5基因定位于染色體llql3上。LRP5基因有23個(gè)外顯子，長(zhǎng)度超過(guò)lOOkb，其cDNA是一段長(zhǎng)約4. 9kb的開(kāi)放閱讀框。許多研究將高骨密度(HBM)候選基因定位于染色體llql3上，如LRP5。Little等發(fā)現(xiàn)常染色體顯性高骨密度家族有LRP5突變，外顯子3上ー堿基G — T，導(dǎo)致LRP5 171位的甘氨酸變?yōu)槔i氨酸(G171V)，從而導(dǎo)致第一個(gè)P -螺旋結(jié)構(gòu)的變化，改變了該蛋白胞外疏水性。Boyden等也有相同的發(fā)現(xiàn)。Van Wesenbeeck篩查一組患以高骨密度為特征的(骨硬化、骨內(nèi)膜骨化、Van Buchen病)患者LRP5基因，發(fā)現(xiàn)該基因外顯子2、3、4存在6個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，分別為Dll 1Y、G171R、A214T、A214V、A242T、A252I，均位于LRP5分子第一個(gè)表皮生長(zhǎng)因子樣區(qū)域。TakeShi Mizuguchi等對(duì)481名普通日本婦女進(jìn)行基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)LRP5與骨密度關(guān)聯(lián)顯著c2220C > T的CC型的校正骨密度明顯高于那些CT或TT型的(P=O. 022)。同時(shí)IV S17_30G > A的GG型、c3989C > T的CC型的校正骨密度均明顯高于其他基因型。MP Akhter建立了 G171V突變的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，發(fā)現(xiàn)該組小鼠與G171V突變的人類(lèi)的骨骼表形非常相似。其骨生物力學(xué)特征結(jié)構(gòu)強(qiáng)度、骨灰度值、骨硬度均顯著高于對(duì)照組。以低骨密度為特征的疾病除了骨質(zhì)疏松，常見(jiàn)的還有假神經(jīng)膠質(zhì)瘤(0PPG)，它常表現(xiàn)為低骨密度以及因兒童時(shí)期頻發(fā)骨折引起的骨骼畸形、眼球血管形成障礙所致的不同程度視覺(jué)障礙。Gong等將LRP5基因確認(rèn)為OPPG的致病基因，發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞上有LRP5的表達(dá)。Kato等成功地建立了 LRP5突變的小鼠模型并發(fā)展為不同程度的0PPG。許多研究運(yùn)用基因分析方法發(fā)現(xiàn)LRP5基因某些位點(diǎn)多態(tài)性或突變與低骨密度顯著相關(guān)。ToMoHzkoUrano等對(duì)308名絕經(jīng)后日本婦女研究發(fā)現(xiàn)在IVS17_1677C > A的CA、AA型的全身骨密度Z值顯著低于CC型(全身骨Z值(0. 08±1. 09) VS (0. 50±1.03)，P=O. 0022 ;腰椎骨(-0. 42±1. 43) VS (-0. 02±1. 42)，P=O. 013)。Kato 等發(fā)現(xiàn) LRP5-/-小鼠的骨密度顯著低于同齡野生型對(duì)照組，其骨形成率相對(duì)對(duì)照組約下降25%，単位面積成骨細(xì)胞數(shù)量明顯降低并伴有功能缺陷，而破骨細(xì)胞相關(guān)參數(shù)無(wú)明顯差異。Jaggedl (JAGl)是ー種I型跨膜蛋白分子，是哺乳動(dòng)物細(xì)胞Notch受體的配體，完整的Jaggedl基因應(yīng)包含膜外區(qū)、跨膜區(qū)和胞漿區(qū)。人Jaggedl位于染色體20pll_12，它的ORF區(qū)全長(zhǎng)為3. 6kb。膜外區(qū)包括信號(hào)肽，16個(gè)EGF樣重復(fù)序列，DSL結(jié)構(gòu)域及一個(gè)半光氨酸的富集區(qū)。胞內(nèi)段很短約為300bp，其中EGF樣重復(fù)序列與DSL結(jié)構(gòu)域在與Notch的相互作用中起重要作用。Jagged在人和鼠的許多組織中均有廣泛的分布，Northern分析表明，Jaggedl mRNA在心臟、胎盤(pán)、腎臟表達(dá)水平高，而在肺、肌肉、胰腺中的表達(dá)量較低。在正常人的骨髓及HS_27a等多種骨髓基質(zhì)細(xì)胞系中均可克隆出Jaggedl的基因，提示Jaggedl在骨髓微環(huán)境中發(fā)揮重要的作用。HS_27a可以維持造血干/祖細(xì)胞的增長(zhǎng)活性及自我更新能力，在骨髓的長(zhǎng)期培養(yǎng)中能增加鵝卵石樣增殖區(qū)(CSAs)的數(shù)量，HS-27a的這一作用依賴(lài)于Jaggedl-Notch信號(hào)途徑。HS_27a及純化的Jaggedl可以抑制G-CSF誘導(dǎo)的表達(dá)有Notchl的32D細(xì)胞的分化,而促進(jìn)其增埴。Varnum-Finney發(fā)現(xiàn)，以Jaggedl培養(yǎng)鼠的
lin+sca一1+kit+骨髓細(xì)胞，HPP-mix集落數(shù)可得到2-3倍的增長(zhǎng)，Jones等也發(fā)現(xiàn)同
樣的結(jié)果，他們以表達(dá)有Jaggedl的基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)鼠的⑶34+c-kit AGM和胎肝造血組細(xì)胞 發(fā)現(xiàn)，HPP-mix集落數(shù)得到4倍或更多的增長(zhǎng)。Jaggedl可以用于體外造血干/祖細(xì)胞的擴(kuò)
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發(fā)明內(nèi)容本實(shí)用新型針對(duì)目的是提供ー種采用熒光定量PCR技術(shù)同時(shí)檢測(cè)兩個(gè)骨質(zhì)疏松相關(guān)骨密度基因SNP位點(diǎn)的試劑盒。該試劑盒由包裝盒體、襯墊、裝有檢測(cè)兩個(gè)SNP位點(diǎn)的熒光定量PCR反應(yīng)液的兩個(gè)試管、裝有陽(yáng)性對(duì)照品的ー個(gè)試管、裝有陰性對(duì)照品的ー個(gè)試管組成，襯墊上設(shè)有容器孔，分別放置兩管熒光定量PCR反應(yīng)液、陽(yáng)性對(duì)照品和陰性對(duì)照品。其中熒光定量PCR反應(yīng)液的成分包含PCR緩沖液、MgC12、dNTPs、SNP位點(diǎn)檢測(cè)用上游引物、SNP位點(diǎn)檢測(cè)用下游引物、SNP位點(diǎn)基因型ー熒光探針、SNP位點(diǎn)基因型ニ熒光探針、Taq DNA聚合酶。其中，低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5 (LRP5)上的SNP位點(diǎn)檢測(cè)引物和探針為上游引物序列5’- GACTGTCAGGACCGCTC -3’下游引物序列5’- GGGGAGGGCCTCACCGT -3’基因型ー熒光探針序列5’-FAM - AGACGAGGcGGACTGT - TAMRA -3’基因型ニ熒光探針序列5’-VIC- AGACGAGGtGGACTGT - TAMRA -3’Jaggedl蛋白(JAGl)上的SNP位點(diǎn)檢測(cè)引物和探針為上游引物序列5’- ACCCAGAGACAACCTGT -3’下游引物序列5’- AGACGAGGtGGACTGT -3’基因型ー熒光探針序列5’-FAM - ACCACTTaTTTACC - TAMRA -3’基因型ニ熒光探針序列5’-VIC- ACCACTTgTTTACC - TAMRA -3’對(duì)照品分為陽(yáng)性對(duì)照品和陰性對(duì)照品，陰性對(duì)照品為無(wú)菌雙蒸水樣品，陽(yáng)性對(duì)照品為ロ腔粘膜細(xì)胞DNA樣品。本試劑盒保存于-20°C，盡量減少反復(fù)凍融。毎次檢測(cè)均應(yīng)設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。[0023]擴(kuò)增檢測(cè)在熒光定量PCR儀上進(jìn)行，分為6個(gè)反應(yīng)管，每ー個(gè)SNP位點(diǎn)檢測(cè)使用3個(gè)反應(yīng)管，其中I個(gè)反應(yīng)管為被檢測(cè)樣品，陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照各使用I個(gè)反應(yīng)管，每管中總體積10 iil，其中Siil PCR反應(yīng)液，2 檢測(cè)樣品(基因組DNA、陽(yáng)性對(duì)照或陰性對(duì)照)。反應(yīng)條件為50°C、2分鐘，95°C、10分鐘，再進(jìn)行60個(gè)循環(huán)的95°C、30秒，60°C、I分鐘。反應(yīng)完成后在熒光定量PCR儀上進(jìn)行終點(diǎn)熒光讀取，根據(jù)得到的ニ維熒光圖和實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線讀取被檢測(cè)樣品的SNP位點(diǎn)基因型。本實(shí)用新型提供的該試劑盒主要用于檢測(cè)骨質(zhì)疏松相關(guān)骨密度基因SNP位點(diǎn)，從而告知被檢者患病風(fēng)險(xiǎn)數(shù)值，提前預(yù)防和控制，指導(dǎo)醫(yī)師選擇正確的臨床治療方案，有利于患者進(jìn)行針對(duì)性治療。本實(shí)用新型的特點(diǎn)是該試劑盒運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了同時(shí)檢測(cè)兩個(gè)骨質(zhì)疏松相關(guān)骨密度基因SNP位點(diǎn)基因型的目的，相對(duì)于現(xiàn)有的熒光定量PCR試劑盒只檢測(cè)ー個(gè)SNP位點(diǎn)，本實(shí)用新型試劑盒將同一疾病的所有SNP位點(diǎn)檢測(cè)整合在ー個(gè)試劑盒內(nèi)，使用更方便而且成本更低，對(duì)個(gè)體還骨質(zhì)疏松癥風(fēng)險(xiǎn)性的評(píng)估也更便捷。

圖I為本實(shí)用新型的結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施方式
本實(shí)用新型結(jié)合附圖和具體實(shí)施例作進(jìn)ー步說(shuō)明。應(yīng)該理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明目的，而不用于限制本實(shí)用新型范圍。實(shí)施例I參見(jiàn)圖1，本實(shí)用新型試劑盒由包裝盒體I、襯墊2、裝有檢測(cè)兩個(gè)SNP位點(diǎn)的熒光定量PCR反應(yīng)液的兩個(gè)試管3、裝有陽(yáng)性對(duì)照品的一個(gè)試管4、裝有陰性對(duì)照品的一個(gè)試管5組成，襯墊上設(shè)有容器孔、分別放置兩管熒光定量PCR反應(yīng)液3、陽(yáng)性對(duì)照品4和陰性對(duì)照品5。其中熒光定量PCR反應(yīng)液的成分包含PCR緩沖液、MgC12、dNTPs、SNP位點(diǎn)檢測(cè)用上游引物、SNP位點(diǎn)檢測(cè)用下游引物、SNP位點(diǎn)基因型ー熒光探針、SNP位點(diǎn)基因型ニ熒光探針、Taq DNA聚合酶。本試劑盒保存于-20°C，盡量減少反復(fù)凍融。實(shí)施例2I.材料血樣總DNA提取試劑盒購(gòu)于美國(guó)Qiagen公司，Taq DNA聚合酶、dNTPs等PCR相關(guān)試劑購(gòu)于美國(guó)Promega公司，7900型熒光定量PCR儀為美國(guó)ABI公司產(chǎn)品。2.引物及探針低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5 (LRP5)上的SNP位點(diǎn)檢測(cè)引物和探針為上游引物序列5’- GACTGTCAGGACCGCTC -3’下游引物序列5’- GGGGAGGGCCTCACCGT -3’基因型ー熒光探針序列5’-FAM - AGACGAGGcGGACTGT - TAMRA -3’基因型ニ熒光探針序列5，-VIC-AGACGAGGtGGACTGT - TAMRA -3’[0041]Jaggedl蛋白(JAGl)上的SNP位點(diǎn)檢測(cè)引物和探針為上游引物序列5’- ACCCAGAGACAACCTGT -3’下游引物序列5，-AGACGAGGtGGACTGT -3’基因型ー熒光探針序列5’-FAM - ACCACTTaTTTACC - TAMRA _3’基因型ニ熒光探針序列5’-VIC- ACCACTTgTTTACC - TAMRA -3’3.樣本檢測(cè)選取30例血液樣本，其中已確定患骨質(zhì)疏松癥的為18例。樣本用血樣總DNA提取試劑盒提取總DNA。每一例檢測(cè)為12個(gè)反應(yīng)管，每管中總體積lOiil，其中8iU PCR反應(yīng)液，姆ー個(gè)SNP位點(diǎn)檢測(cè)使用3個(gè)反應(yīng)管，I個(gè)反應(yīng)管中加入2 u I被檢測(cè)DNA,另外2個(gè)反應(yīng)管中加入2 u I陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，在ABI7900熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件為50°C、2分鐘，95°C、10分鐘，再進(jìn)行60個(gè)循環(huán)的95で、30秒，60°C、1分鐘。反應(yīng)完成后在熒光定量PCR儀上進(jìn)行終點(diǎn)熒光讀取。
權(quán)利要求1.ー種骨質(zhì)疏松相關(guān)骨密度基因位點(diǎn)檢測(cè)試劑盒，其特征是由包裝盒體(I)、襯墊(2 )、裝有檢測(cè)兩個(gè)SNP位點(diǎn)的熒光定量PCR反應(yīng)液的兩個(gè)試管(3 )、裝有陽(yáng)性對(duì)照品的ー個(gè)試管(4)、裝有陰性對(duì)照品的一個(gè)試管(5)組成，襯墊(2)上設(shè)有容器孔，分別放置兩管熒光定量PCR反應(yīng)液(3 )、陽(yáng)性對(duì)照品(4 )和陰性對(duì)照品(5 )。
專(zhuān)利摘要本實(shí)用新型提供了一種檢測(cè)骨質(zhì)疏松相關(guān)骨密度基因位點(diǎn)是否發(fā)生突變從而評(píng)估個(gè)體患骨質(zhì)疏松癥風(fēng)險(xiǎn)性的試劑盒，由包裝盒體1、襯墊2、裝有檢測(cè)兩個(gè)SNP位點(diǎn)的熒光定量PCR反應(yīng)液的兩個(gè)試管3、裝有陽(yáng)性對(duì)照品的一個(gè)試管4、裝有陰性對(duì)照品的一個(gè)試管5組成，襯墊上設(shè)有容器孔，分別放置兩管熒光定量PCR反應(yīng)液3、陽(yáng)性對(duì)照品4和陰性對(duì)照品5。本實(shí)用新型試劑盒運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了同時(shí)檢測(cè)兩個(gè)骨質(zhì)疏松相關(guān)骨密度基因SNP位點(diǎn)基因型的目的，相對(duì)于現(xiàn)有的熒光定量PCR試劑盒只檢測(cè)一個(gè)SNP位點(diǎn)，本實(shí)用新型試劑盒將與同一疾病的兩個(gè)SNP位點(diǎn)檢測(cè)整合在一個(gè)試劑盒內(nèi)，使用更方便而且成本更低，對(duì)個(gè)體患骨質(zhì)疏松癥風(fēng)險(xiǎn)性的評(píng)估也更便捷。
文檔編號(hào)G01N21/64GK202401073SQ201120569489
公開(kāi)日2012年8月29日 申請(qǐng)日期2011年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月31日
發(fā)明者任峻, 張華忠 申請(qǐng)人:浙江愛(ài)易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司