專利名稱：一種比色傳感器的制備方法、由該方法制備的產(chǎn)品及其產(chǎn)品的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于化學(xué)生物傳感器技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種比色傳感器的制備方法、由該方法制備的產(chǎn)品及其產(chǎn)品的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
神經(jīng)遞質(zhì)是神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生的化學(xué)信號，在高等動物通訊中占有非常重要的地位， 腦內(nèi)多巴胺是關(guān)鍵的神經(jīng)遞質(zhì)和調(diào)質(zhì)，是多種認(rèn)知功能和精神活動的有力調(diào)節(jié)者。因此對腦內(nèi)多巴胺快速靈敏的選擇性檢測對帕金森、抑郁癥等疾病的治療顯得尤為重要。多巴胺的傳統(tǒng)檢測有電化學(xué)方法、高效液相色譜電化學(xué)方法、毛細(xì)管電泳電化學(xué)檢測(CE-ECD) 法。但這些方法檢測過程復(fù)雜，又易受抗壞血酸、尿酸等與多巴胺電位相近物質(zhì)的干擾。所以迫切的需要開發(fā)一種簡單方便準(zhǔn)確迅速的檢測方法對多巴胺進(jìn)行選擇性檢測。納米技術(shù)與化學(xué)、生物學(xué)、物理學(xué)和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的結(jié)合對分析科學(xué)和生命科學(xué)領(lǐng)域的超靈敏檢測和成像方法的發(fā)展起著越來越重要的作用(M. C. Daniel，D. Astruc, Chem. Rev.，2004，104,293-346. ；N. L. Rosi, C. A. Mirkin, Chem.Rev.，2005，105，1547—1562 ； Z. Wang, L. Ma, Coord. Chem. Rev.，2009，253，1607-1618.)。由于 AuNPs 具有獨特的光學(xué)性質(zhì) (表面等離子體吸收和共振光散射)、易進(jìn)行表面修飾以及良好的生物相容性(通常認(rèn)為裸 AuNPs是無生物毒性的，而修飾后的AuNPs的生物毒性由其配體決定)，因此功能化AuNPs 的應(yīng)用領(lǐng)域不斷被拓寬，特別是其在生物分析和生物醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用引起了人們廣泛關(guān) ^ (M. C. Daniel, D. Astruc, Chem. Rev. ,2004,104,293 ~ 346 ；Ε. Katz, I. Willner, Angew. Chem. Int. Ed.，2004，43,6042 6108.)。1996年美國西北大學(xué)納米技術(shù)研究所納米裝配和分子自組裝中心C. A. Mirkin教授領(lǐng)導(dǎo)的研究小組(R. Elghanian, J. J. Storhoff, R. C. Mucic, R. L. Letsinger, C. A. Mirkin, Science, 1997，277，1078-1081.)，基于金納米粒子間耦合等離子共振效應(yīng)，通過寡聚核苷酸修飾金納米粒子，開發(fā)了一種DNA傳感器在納米金微粒來識別DNA方面進(jìn)行了開創(chuàng)性的工作。以此為契機，開始了金納米粒子比色傳感的新紀(jì)元。國內(nèi)外研究人員基于此技術(shù)分別開發(fā)了核酸、蛋白質(zhì)、金屬離子及其他小分子比色傳感器。近年來，基于AuNPs的比色法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于有毒重金屬離子(Pb2+、Cd2+和Hg2+等)的檢測(H. K. Kim, I. Rasnik, J. W. Liu, T. J. Ha, Y. Lu, Nat. Chem. Biol.，2007，3,763 ~ 768. ；Z. Wang, J. H. Lee, Y. Lu, Adv. Mater. ,2008,20,3263 3沈7.)，化學(xué)小分子檢測，DNA檢測，蛋白質(zhì)分析，細(xì)胞分析等領(lǐng)域。特別是Lu等發(fā)明了一種基于DNAzyme修飾的AuNPs比色傳感器，可以快速、簡單、實時及線性范圍可調(diào)的檢測重金屬離子此2+，這種傳感器對1 2+的檢出限達(dá)到3nM，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于美國環(huán)境保護(hù)局(EPA)對飲用水中1 2+濃度的檢出限值。Willner等發(fā)明了另一種基于DNA 修飾的AuNPs探針檢測Hg2+的比色方法，這種方法靈敏度更高，檢出限可達(dá)InM(0. 2ppb) (D. Li,A. ffieckowska,I. ffillner,Angew. Chem. Int. Ed.，2008，47，3927 3931.)。2007 年科學(xué)家發(fā)展了基于適配子修飾的AuNPs比色法并應(yīng)用于小分子(腺苷、可卡因等)檢測也引起了人們的廣泛關(guān)注(J. Liu, Y. Lu, J. Am. Chem. Soc.，2007，129，86；34 8643. ；W. Zhao, W. Chiuman, J. C. F. Lam, S. A. McManus，Chen W.，Cui Y.，J. Am. Chem. Soc.，2008，130，3610 3618.)，如Siou等人用適配子修飾的AuNPs設(shè)計了一種“preudo”夾心反應(yīng)，能夠通過SI3R 光譜檢測小分子腺苷(J. Wang, H. S. Zhou, Anal. Chem.，2008，80，7174 7178.)。AuNPs 與蛋白質(zhì)結(jié)合獲得用于電子顯微鏡的AuNPs探針，在電子顯微鏡甚至光學(xué)顯微鏡水平上對抗原、抗體進(jìn)行定位、定性直至定量研究，是AuNPs應(yīng)用于免疫細(xì)胞和組織化學(xué)的重要里程碑(S. Gupta, S. Huda, P. K. Kilpatrick, 0. D. Velev, Anal. Chem.，2007，79，3810 3820.； I. Maier, M. R. A. Morgan, W. Lindner, F. Pittner, Anal. Chem.，2008，80，2694 2703.)。盡管目前國內(nèi)外研究人員對金納米粒子的分子識別比色傳感器有過諸多研究，但能夠?qū)τ谏窠?jīng)遞質(zhì)的進(jìn)行選擇性可視化的檢測的傳感器的研究還很少，并將其用于對神經(jīng)遞質(zhì)的檢測還未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)的問題，本發(fā)明的目的是提供一種比色傳感器的制備方法，由該方法制備的比色傳感器可應(yīng)用于腦多巴胺的檢測中。本發(fā)明的另一個目的是提供一種由上述制備方法制備的比色傳感器。本發(fā)明的第三個目的是提供一種將上述比色傳感器用于腦多巴胺檢測的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案如下本發(fā)明提供了一種比色傳感器的制備方法，該方法包括以下步驟(1)在單口瓶中，將水合氯金酸加熱至沸騰，加入檸檬酸三鈉，水合氯金酸與檸檬酸三鈉的摩爾比為1 1 1 8，繼續(xù)加熱10 50min，停止反應(yīng)；(2)將步驟(1)所得的金納米粒子與對巰基苯硼酸(MBA)和3，3' -二硫代二丙酸二(N-羥基丁二酰亞胺酯)(DSP)混合超聲1 50min，對巰基苯硼酸(MBA)與3，3 ‘ -二硫代二丙酸二(N-羥基丁二酰亞胺酯)(DSP)的體積比為20 1 1 20，得到比色傳感器(MBA-DSP-AuNPs)。本發(fā)明還提供了一種由上述制備方法制備得到的比色傳感器，該比色傳感器是通過對巰基苯硼酸(MBA)和3，3 ‘ - 二硫代二丙酸二(N-羥基丁二酰亞胺酯)(DSP)雙分子修飾的金納米粒子。所述的金納米粒子大小為10 15nm，呈均一單分散球狀。本發(fā)明還提供了將上述比色傳感器用于腦多巴胺檢測的方法，該方法包括以下步驟將含有腦多巴胺的樣品進(jìn)行微透析濾膜過濾，去除大分子蛋白物質(zhì)；對所得樣品取樣進(jìn)行保存；對所保存樣品進(jìn)行在線透析檢測。所述的保存是將透析液樣本存放在一個即時分析冰浴或冷凍瓶中備用。所述的在線透析檢測是將透析液樣本5 μ L加入MBA-DSP-AuNPs比色傳感器中，在室溫下培育5分鐘，用紫外可見光譜進(jìn)行實時觀測。本發(fā)明同現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點和有益效果1、本發(fā)明實現(xiàn)活體檢測首次對含多巴胺的透析取樣樣品進(jìn)行微量實時可視化選擇性檢測，實現(xiàn)鼠腦微透析樣品迅速靈敏的可視化檢測。2、本發(fā)明實現(xiàn)了雙重識別所述的修飾探針比色傳感器為雙分子或者多分子修飾，具有多重識別功能，提高了對檢測物質(zhì)的選擇性，保證了結(jié)果的準(zhǔn)確性；即本發(fā)明金納米粒子MBA-DSP-AuNPs比色傳感器具有多重識別功能。3、本發(fā)明的選擇性好超聲條件下選擇性的進(jìn)行雙分子修飾，與傳統(tǒng)的單分子修飾相比，具有多重識別功能，提高對檢測物質(zhì)的選擇性，保證結(jié)果的準(zhǔn)確性；即本發(fā)明金納米粒子MBA-DSP-AuNPs比色傳感器具有多重識別功能；所述的MBA-DSP-AuNPs比色傳感器具有多重識別功能，進(jìn)而提高了探針的選擇性，保證了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。4、本發(fā)明的檢出限低、靈敏度高進(jìn)一步，通過對巰基苯硼酸 4-Mercaptophenyl-boronic acid(MBA)和 3，3' -二硫代二丙酸二(N-羥基丁二酰亞胺酯)dithiobis[succinimidylpropionate] (DSP)雙分子修飾貴金屬金納米粒子使金納米探針具有雙重識別功能，進(jìn)而提高了探針的選擇性。進(jìn)一步，通過探針優(yōu)化降低檢測限，為應(yīng)用于臨床研究提供可能；同時，所述MBA-DSP-AuNPs比色傳感器基于金納米粒子間耦合等離子共振效應(yīng)，與傳統(tǒng)的有機發(fā)色團(tuán)相比具有極高的消光系數(shù)，因而提高檢測的靈敏度， 進(jìn)一步擴大了檢測的應(yīng)用范圍。5、本發(fā)明實現(xiàn)了可視化直觀檢測所述MBA-DSP-AuNPs比色傳感器是基于金納米粒子間耦合等離子共振效應(yīng)，根據(jù)待檢測物質(zhì)的濃度呈現(xiàn)出不同的顏色變化為可視化檢測提供了可能，可視化檢測無需借助大型儀器。6、本發(fā)明實現(xiàn)了簡便快速檢測所述MBA-DSP-AuNPs比色傳感器簡化了神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺的檢測程序，縮短了神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺的檢測時間。7、本發(fā)明構(gòu)建了能夠簡單方便、靈敏、快速檢測的傳感器，金納米粒子間耦合等離子共振效應(yīng)用于神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺的檢測，提高檢測的靈敏度；金納米粒子等離子共振效應(yīng)呈現(xiàn)出不同的顏色變化為可視化檢測提供了可能，這種可視化檢測無需借助大型儀器，簡化了神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺的檢測程序，縮短了神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺的檢測時間。8、本發(fā)明微量MBA-DSP-AuNPs比色傳感器探針的應(yīng)用極大的降低了神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺的成本；通過MBA-DSP雙分子修飾貴金屬金納米粒子使金納米探針具有雙重識別功能，進(jìn)而提高了探針的選擇性；金納米粒子間耦合等離子共振效應(yīng)用于神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺的檢測提高檢測的靈敏度；金納米粒子等離子共振效應(yīng)呈現(xiàn)出不同的顏色變化為可視化檢測提供了可能，可視化檢測無需借助大型儀器，簡化了神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺的檢測程序和縮短了神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺的檢測時間，本研究能夠為帕金森等重大疾病的診斷提供幫助；并且本發(fā)明的雙重比色傳感器從設(shè)計、合成、優(yōu)化，尤其通過微透析方法對活體的檢測方法有望推廣到對其它物質(zhì)的檢測，并且有望應(yīng)用于重大疾病的臨床研究，具有廣闊的市場應(yīng)用前景。


圖1是實施例1中制備的金納米粒子AuNPs相應(yīng)的高清透射電子顯微鏡HR-TEM 圖。圖2是實施例1的MBA-DSP-AuNPs比色傳感器與濃度為150nM的多巴胺(DA)相應(yīng)的高清透射電子顯微鏡HR-TEM圖。圖3是圖1所示MBA-DSP-AuNPs比色傳感器表面修飾前后S元素的XPS圖譜(X 射線光電子能譜)。圖4是圖1所示MBA-DSP-AuNPs比色傳感器表面修飾前后N元素的XPS圖譜(X射線光電子能譜)。圖5是圖1所示MBA-DSP-AuNPs比色傳感器表面修飾前后B元素的XPS圖譜(X 射線光電子能譜)。圖6是圖1所示MBA-DSP-AuNPs比色傳感器中在不同濃度多巴胺的紫外可見光譜數(shù)據(jù)。圖7是圖1所示MBA-DSP-AuNPs比色傳感器對小白鼠微透析樣品中多巴胺的紫外可見光譜數(shù)據(jù)。
具體實施例方式以下結(jié)合附圖所示實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。水合氯金酸，檸檬酸三鈉，對巰基苯硼酸(MBA)和3，3' -二硫代二丙酸二 (N-羥基丁二酰亞胺酯)(DSP)購買于西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司，高純水 (18. 2M Qcm-I)制備于Milli-Q超純水系統(tǒng)美國Millipore公司。實施例1比色傳感器制備根據(jù)本發(fā)明方法制備的MBA-DSP-AuNPs多重識別比色傳感器， 包括以下步驟①制備過程中所使用到的所有玻璃儀器均用王水(HCl HNO3 = 3 1)清洗，然后用高純?nèi)ルx子水(18. 2MQcm-1)沖洗干凈，鼓風(fēng)干燥箱中風(fēng)干。②在單口瓶中，將IOml lmmol/L HAuClJn熱至沸騰，迅速加入Iml 38. 8mmol/L檸檬酸三鈉。攪拌下繼續(xù)加熱30min至呈酒紅色，停止反應(yīng)，所得的金納米粒子AuNPs通過高清透射電子顯微鏡HR-TEM圖1觀察。圖1為本實施例中制備的金納米粒子AuNPs相應(yīng)的高清透射電子顯微鏡HR-TEM 圖，從該圖中，可以看出所得的金納米粒子AuWs呈均一的單分散球狀納米粒子，粒徑均一，大小約為10 15nm。③將步驟②所得金納米粒子超聲下與對巰基苯硼酸(MBA)和3，3 ‘ - 二硫代二丙酸二(N-羥基丁二酰亞胺酯)(DSP)混合超聲30min，對巰基苯硼酸(MBA)與3，3 ‘ -二硫代二丙酸二 (N-羥基丁二酰亞胺酯)(DSP)的體積比為(1/3，1/2，1/1，2/1，3/1)，得到比色傳感器(MBA-DSP-AuNPs)。圖2是本實施例的MBA-DSP-AuNPs比色傳感器與濃度為150nM的多巴胺(DA)相應(yīng)的高清透射電子顯微鏡HR-TEM圖。能夠清晰地看出在DA分子誘導(dǎo)下MBA-DSP-AuNPs比色傳感器能夠發(fā)生聚集，進(jìn)而影響探針的粒子間等離子共振效應(yīng)，給出靈敏的選擇性信號。將優(yōu)化后雙分子體積比為1/2時所得的MBA-DSP-AuNPs溶液用X-射線電子能譜儀分析(XPS)光譜進(jìn)行表面元素表征，所得結(jié)果如圖3、圖4和圖5所示。圖3是圖1所示 MBA-DSP-AuNPs比色傳感器表面修飾前后S元素的XPS圖譜(X射線光電子能譜)。通過圖 3S2p XPS光譜圖可以看出，MBA與DSP分子中的、元素共價結(jié)合到AuNPs表面。圖4是圖 1所示MBA-DSP-AuNPs比色傳感器表面修飾前后N元素的XPS圖譜(X射線光電子能譜)。 通過圖4Nls XPS光譜圖可以看出，DSP分子中N元素共價結(jié)合到AuNI^s表面。圖5是圖1所示MBA-DSP-AuNPs比色傳感器表面修飾前后B元素的XPS圖譜(X射線光電子能譜)。通過圖5Bls XPS光譜圖可以看出，MBA分子中B元素共價結(jié)合到AuNI^s表面。綜上圖3，4，5分析，可以明顯看出MBA與DSP均共價結(jié)合到AuNPs表面。MBA-DSP-AuNPs溶液的吸光度用紫外可見光譜進(jìn)行觀測。圖6是圖1所示MBA-DSP-AuNPs比色傳感器中在不同濃度多巴胺的紫外可見光譜數(shù)據(jù)。通過圖 6MBA-DSP-AuNPs傳感器對不同濃度DA紫外光譜圖可以看出MBA-DSP-AuNPs傳感器對不同濃度 DA Onm(圖 6，線 1)，185nm(圖 6，線 2)，235nm(圖 6，線 3)，255nm(圖 6，線 4)，275nm(圖 6，線5)，and 305nm(圖6，線6)具有極高的靈敏度。實施例2比色傳感器在腦多巴胺檢測中應(yīng)用包括以下步驟①雄性大鼠飼養(yǎng)。②雄性大鼠麻醉與固定Q50-350克)通過水合氯醛麻醉(初始劑量300毫克/ 公斤水合氯醛麻醉，隨后逐漸加入50毫克/公斤水合氯醛麻醉來需要維持麻醉劑量)和包裹在恒溫毯里。③雄性大鼠微透析取樣大鼠被放置在一個立體框架結(jié)構(gòu)在5毫米以上的雙耳線設(shè)置門牙欄，并通過顱骨適當(dāng)鉆孔。微透析抽樣程序是用微透析泵和液體開關(guān)。透析探針在大腦中植入了 30分鐘的時間內(nèi)到以下坐標(biāo)2. 5毫米至前囟，從中線外側(cè)2. 5毫米和7. 0 毫米以下的硬腦膜。該探針以0. 5μ L/min灌注至少2小時之后，將含有腦多巴胺的樣品進(jìn)行微透析濾膜過濾，去除大分子蛋白物質(zhì)，隨后進(jìn)行采集樣本進(jìn)行分析。④雄性大鼠微透析取樣樣品保存透析液樣本被存放在一個即時分析冰浴或冷凍瓶中供日后使用。⑤在線鼠腦微透析樣品檢測5 μ L透析液樣本加入170 μ L優(yōu)化的MBA-DSP-AuNPs 比色傳感器(MBA DSP=I 幻試劑中，在室溫下培育5分鐘，同時，用紫外可見光譜進(jìn)行實時觀測。從上述實施實例可以看出，將MBA-DSP-AuNPs比色傳感器在神經(jīng)遞質(zhì)檢測中，可以實現(xiàn)對鼠腦微透析取樣樣品中神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺進(jìn)行微量實時可視化選擇性檢測，我們隨意抽取三組小白鼠的常態(tài)下的微透析樣品進(jìn)行檢測，當(dāng)微透析樣品加入到MBA-DSP-AuNPs 比色傳感器溶液中5min內(nèi)，MBA-DSP-AuNPs比色傳感器呈現(xiàn)出較為明顯的顏色變化，我們同時對其進(jìn)行光譜觀察，其檢測結(jié)果如圖7所示。圖7是圖1所示MBA-DSP-AuNPs比色傳感器對小白鼠鼠腦在刺激狀態(tài)下Omin (圖7，線1)，IOmin (圖7，線2)，30min (圖7，線3)， 50min(圖7，線4)，注射nomifensine后(圖7，線5)微透析樣品中多巴胺的紫外可見光譜數(shù)據(jù)，可以看出MBA-DSP-AuNPs比色傳感器對復(fù)雜的微透析樣品具有極好的選擇性。為了分析傳感器對微透析樣品檢測準(zhǔn)確性，我們同時將同組樣品通過傳統(tǒng)方法 HPLC-EC檢測，其檢測結(jié)果如表1所示，從檢測結(jié)果可以看出MBA-DSP-AuNPs比色傳感器能夠檢測nM水平的DA分子，檢測過程快速準(zhǔn)確重現(xiàn)性好，并且首次實現(xiàn)了可視化的對神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺進(jìn)行選擇性檢測。表 權(quán)利要求
1.一種比色傳感器的制備方法，其特征在于該方法包括以下步驟(1)在單口瓶中，將水合氯金酸加熱至沸騰，加入檸檬酸三鈉，水合氯金酸與檸檬酸三鈉的摩爾比為1 1 1 8，繼續(xù)加熱10 50min，停止反應(yīng)；(2)將步驟(1)所得的金納米粒子與對巰基苯硼酸和3，3'-二硫代二丙酸二(N-羥基丁二酰亞胺酯)混合超聲1 50min，對巰基苯硼酸與3，3' -二硫代二丙酸二(N-羥基丁二酰亞胺酯)的體積比為20 1 1 20，得到比色傳感器。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法制備得到的比色傳感器，其特征在于該比色傳感器是通過對巰基苯硼酸和3，3' -二硫代二丙酸二(N-羥基丁二酰亞胺酯)雙分子修飾的金納米粒子。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的比色傳感器，其特征在于所述的金納米粒子大小為10 15nm，呈均一單分散球狀。
4.權(quán)利要求2或3所述的比色傳感器用于腦多巴胺檢測的方法，其特征在于該方法包括以下步驟將含有腦多巴胺的樣品進(jìn)行微透析濾膜過濾，去除大分子蛋白物質(zhì)；對所得樣品取樣進(jìn)行保存；對所保存樣品進(jìn)行在線透析檢測。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的比色傳感器用于腦多巴胺檢測的方法，其特征在于所述的保存是將透析液樣本存放在一個即時分析冰浴或冷凍瓶中備用。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的比色傳感器用于腦多巴胺檢測的方法，其特征在于所述的在線透析檢測是將透析液樣本5 μ L加入MBA-DSP-AuNPs比色傳感器中，在室溫下培育5分鐘，用紫外可見光譜進(jìn)行實時觀測。
全文摘要
本發(fā)明屬于化學(xué)生物傳感器技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種比色傳感器的制備方法、由該方法制備的產(chǎn)品及其產(chǎn)品的應(yīng)用。本發(fā)明公開的比色傳感器的制備方法包括以下步驟(1)在單口瓶中，將水合氯金酸加熱至沸騰，加入檸檬酸三鈉，水合氯金酸與檸檬酸三鈉的摩爾比為1∶1～1∶8，繼續(xù)加熱10～50min，停止反應(yīng)；(2)將步驟(1)所得的金納米粒子與對巰基苯硼酸和3，3′-二硫代二丙酸二(N-羥基丁二酰亞胺酯)混合超聲1～50min，對巰基苯硼酸與3，3′-二硫代二丙酸二(N-羥基丁二酰亞胺酯)的體積比為20∶1～1∶20，得到比色傳感器。本發(fā)明還公開了將上述的比色傳感器用于腦多巴胺檢測的方法。本發(fā)明方法實現(xiàn)了活體檢測，具有雙重識別功能、選擇性好、檢出限低和靈敏度高等優(yōu)點。
文檔編號G01N21/31GK102426154SQ20111024348
公開日2012年4月25日 申請日期2011年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月24日
發(fā)明者孔彪, 朱安偉, 田陽 申請人:同濟大學(xué)