專利名稱：用于檢測i型糖尿病特征蛋白的質(zhì)譜模型及構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及糖尿病檢測領(lǐng)域，為一種全新的非入侵性檢測方法，在體外對糖尿病， 特別是I型糖尿病進行的發(fā)現(xiàn)和檢測，其敏感性和特異性均達到以上。
背景技術(shù)：
糖尿病是由于胰島素不足而引起的代謝性疾病?；咎卣魇情L期高血糖。胰島素是由胰腺中β細(xì)胞分泌的，是葡萄糖代謝中不可缺少的一種激素。當(dāng)胰島素分泌不足，葡萄糖利用及貯存受阻，血液中葡萄糖濃度(血糖濃度)就會升高。血糖濃度超過一定水平， 多余的葡萄糖便通過腎臟排出體外，這時化驗小便會發(fā)現(xiàn)尿糖陽性，故稱糖尿病。糖尿病分原發(fā)性和繼發(fā)性兩大類。原發(fā)性糖尿病是指其發(fā)病原因尚未明確，也稱特發(fā)性糖尿病或原因不明性糖尿病，占絕大多數(shù)。一般所稱糖尿病即指原發(fā)性糖尿病?？煞忠韵聨仔?胰島素依賴型糖尿病(IDDM，I型)該型約占糖尿病總數(shù)的5% _10%，發(fā)病年齡多小于40歲，主要為幼年及青少年， 偶見于非肥胖的成人?；颊唧w內(nèi)胰島素極少或缺乏，發(fā)病時糖尿病癥狀較明顯，病情較重， 有酮癥傾向(指易發(fā)生糖尿病酮癥酸中毒)必須依賴外源性胰島素為生，一旦中止胰島素治療則會威脅生命。2非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM，II型)該型約占糖尿病總數(shù)的90%或以上，多于40歲后發(fā)病，起病緩慢、隱匿，臨床癥狀不典型，病情較輕，有些病人是因動脈硬化、冠心病、腎臟疾病或眼科疾病就診而發(fā)現(xiàn)糖尿病，有些是在健康檢查時才發(fā)現(xiàn)患有糖尿病。該型糖尿病一般無酮癥傾向，控制飲食或加用口服降糖藥治療便能控制病情，少數(shù)病人為控制血糖必須用胰島素治療，但不依賴外源性胰島素(即停用胰島素不致于威脅病人生命)。目前我國糖尿病及糖耐量低減的患病率分別為2. 51%和3. 27%，糖尿病患病率最高地區(qū)為新疆自治區(qū)克拉瑪依市6%)，其次是北京地區(qū)(3. 99%)，浙江省糖尿病患病率為2. 96%。雖然中國糖尿病患病率與世界發(fā)達國家相比仍然較低，但是中國人口眾多， 估計現(xiàn)有25-64歲的糖尿病人約1500萬。另一觀察發(fā)現(xiàn)，大于25歲的成年人糖尿病的發(fā)病率超過130/10萬，推算在大于25歲的人口中，每年將有70萬糖尿病新病人，調(diào)查還發(fā)現(xiàn)， 糖尿病患病率隨著年齡、體重還發(fā)現(xiàn)，糖尿病患病率隨著年齡、體重及平均收入的增加而增加，肥胖者患病率約為正常體重者的5倍。尿病對患者生活質(zhì)量和健康的嚴(yán)重影響，以及控制糖尿病所付出的代價體現(xiàn)在以下幾個方面死亡率增加2-3倍；患心臟病及中風(fēng)幾率增加2-3倍；失明者比正常人多10倍；壞疽和截肢者比正常人多20倍。引發(fā)致命腎臟病的主要原因?，F(xiàn)在國內(nèi)外還沒有基于血清多肽的糖尿病診斷方法，我們應(yīng)用基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)提供一種可用于診斷的方法?；|(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-T0F-MS)是近年來發(fā)展起來的一種新型的軟電離生物質(zhì)譜，其原理是用激光照射樣品與基質(zhì)形成的共結(jié)晶薄膜，基質(zhì)從激光中吸收能量傳遞給生物分子，而電離過程中將質(zhì)子轉(zhuǎn)移到生物分子或從生物分子得到質(zhì)子，而使生物分子電離的過程。TOF的原理是離子在電場作用下加速飛過飛行管道，根據(jù)到達檢測器的飛行時間不同而被檢測即測定離子的質(zhì)荷比(M/Z)與離子的飛行時間成正比， 檢測離子。盡管MALDI-T0F的準(zhǔn)確度高達0. 1 % 0. 01 %，遠遠高于目前常規(guī)應(yīng)用的SDS 電泳與高效凝膠色譜技術(shù)，但在糖尿病標(biāo)志物的應(yīng)用中仍然存在一些缺陷，因此國內(nèi)迄今為止尚無采用MALDI-T0F-MS技術(shù)獲得檢測糖尿病血清特征蛋白的報道。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明目的在于提供一種用于檢測I型糖尿病特征蛋白的質(zhì)譜模型及其制備方法。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供一種用于檢測I型I型糖尿病特征蛋白的質(zhì)譜標(biāo)記，其包括質(zhì)荷比為:7010. 32,8141. 47,7597. 7,7645. 62,3314. 94,8862. 88,7765. 57、 9062.14,7921.58,7832.64,6630.96,4643.76,9289.11,8565.22,3302.42,9429.72 和 1984. 14m/z 的峰。本發(fā)明還提供一種用于檢測I型糖尿病特征蛋白的質(zhì)譜模型，該質(zhì)譜模型中包含質(zhì)荷比為 7010. 32m/z、8141. 47m/z、7597. 7m/z、7645. 62m/z、3314. 94m/z、8862. 88m/z、 7765. 57m/z、9062. 14m/z、7921. 58m/z、7832. 64m/z、6630. 96m/z、4643. 76m/z、9289. llm/z、 8565. 22m/z、3302. 42m/z、9429. 72m/z 和 1984. 14m/z 的峰，其中，當(dāng) 3314. 94m/z、6630. 96m/ ζ,3302. 42m/z和1984. 14m/z的峰上調(diào)表達，其余質(zhì)荷比的峰都下調(diào)表達時，預(yù)示為I型糖尿病患者或潛在患者。所述的3314. 94m/z、6630. 96m/z、3302. 42m/z和1984. 14m/z特征蛋白的上調(diào)表達的臨界值分別為 31. 44士8. 94,85. 84士51. 23,9. 70士3. 31 和 20. 01 士5. 07。 所述的 7010.32m/z、8141. 47m/z、7597. 7m/z、7645. 62m/z、8862. 88m/z、7765. 57m/z、 9062. 14m/z、7921. 58m/z、7832. 64m/z、4643. 76m/z、9289. llm/z,8565. 22m/z 和 9429. 72m/ ζ的特征蛋白下調(diào)表達的臨界值分另為34. 36士9. 05、15. 17士4. 61,9. 45士2. 58、 14. 69士3. 31,17. 10士5. 98,115. 29士47. 08,24. 36士9. 51,16. 19士4. 34,11. 59士3. 81、 202. 98士98. 84,960. 32士365. 62,8. 40士 1. 64 和 45. 82士 19. 61。進而，本發(fā)明提供一種建立所述質(zhì)譜模型的方法，包括如下步驟1)收集多例臨床確診的I型糖尿病患者血清和正常對照人員的血清作為兩組血清標(biāo)本，進行低溫冷凍備用；2)對血清蛋白進行質(zhì)譜前預(yù)處理；3)對預(yù)處理過的兩組血清蛋白進行質(zhì)譜檢測讀取，獲得兩組血清多肽的指紋圖譜；4)對所有的糖尿病患者和正常人血清多肽的指紋圖譜進行標(biāo)準(zhǔn)化處理，并收集數(shù)據(jù)；5)對所得數(shù)據(jù)進行標(biāo)準(zhǔn)化處理，篩選出具有下列質(zhì)荷比峰的糖尿病特征蛋白:7010.32,8141.47,7597.7,7645.62,3314. 94,8862. 88,7765. 57,9062. 14,7921. 58、 7832. 64,6630. 96,4643. 76,9289. 11,8565. 22,3302. 42,9429. 72,1984. 14m/z,根據(jù)這 17 個質(zhì)荷比峰建立檢測糖尿病特征蛋白的質(zhì)譜模型。其中，所述步驟幻預(yù)處理的方法是采用磁珠純化和穩(wěn)定樣品中的血清蛋白或多肽。
其中，所述步驟3)采用WCX2芯片對兩組血清蛋白進行吸附，并對結(jié)合在弱陽離子 WCX2芯片上的兩組血清蛋白進行讀取，獲得兩組血清多肽的指紋圖譜。本發(fā)明與其它糖尿病的檢測方法比較，具有以下優(yōu)點第一，本發(fā)明采用糖尿病患者與正常人具有差異的多個特征蛋白組合進行對糖尿病血清的檢測，并采用了傳統(tǒng)統(tǒng)計學(xué)與現(xiàn)代生物信息學(xué)方法相結(jié)合的方法進行數(shù)據(jù)處理， 從而得到糖尿病患者和健康人血清蛋白質(zhì)指紋圖譜檢測模型，并且所發(fā)現(xiàn)的一系列蛋白質(zhì)質(zhì)荷比峰為尋找新的更理想的疾病標(biāo)志物提供了基礎(chǔ)和資源。第二，與以往的血清學(xué)檢測方法比較具有較高的敏感性和特異性，并能用于篩選抗糖尿病的藥物中。第三，本發(fā)明模型的構(gòu)建方法設(shè)計合理可行，為提供糖尿病的臨床治愈率提供了新的篩查方法，同時也為探索腫瘤發(fā)生發(fā)展的機制提供了新的思路。第四，利用本發(fā)明分析了 50份血清樣品，驗證結(jié)果顯示，50例判斷正確，檢出率達 100%，特異性為100%，靈敏性為100%，因此本發(fā)明可對糖尿病作出診斷，提高病人的存活率和生活質(zhì)量。


圖1為部分健康人血清和I型糖尿病患者血清的多肽圖譜。圖2重復(fù)做樣的5個Sigma血清質(zhì)譜指紋圖。圖3為蛋白峰在所有建模型樣品中的表達水平展示，箭頭指向荷質(zhì)比為 7010. 32m/z的I型糖尿病特征蛋白峰；其中箭頭指向建模型的7010. 32m/z的特征蛋白帶， 紅色代表正常組，綠色代表I型糖尿病組。圖4為蛋白峰在所有建模型樣品中的表達水平展示，箭頭指向荷質(zhì)比為 3314. 94m/z的I型糖尿病特征蛋白峰；其中箭頭指向建模型的3314. 94m/z的特征蛋白帶， 紅色代表正常組，綠色代表I型糖尿病組。圖5為蛋白峰在所有建模型樣品中的表達水平展示，箭頭指向荷質(zhì)比為 7765. 57m/z的I型糖尿病特征蛋白峰；其中箭頭指向建模型的7765. 57m/z的特征蛋白帶， 紅色代表正常組，綠色代表I型糖尿病組。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例11、樣本和儀器共50例血清樣本，其中25例來自I型糖尿病患者，另外25例來自健康人群。所有25例I型糖尿病患者均經(jīng)診斷病理報告確定。所有的血清樣本均在清晨空腹下抽取，分離血清后儲存在-80低溫冰箱中?；|(zhì)輔助激光解析飛行時間質(zhì)譜Autof IexII T0F/T0F及實驗用的WCX磁珠試劑盒由美國Bruker公司研制。使用Bruker公司的數(shù)據(jù)分析軟件Clinprotools做數(shù)據(jù)的預(yù)處理.應(yīng)用Waters公司的液相系統(tǒng)Nano Aquity UPLC和HiermoFisher公司的質(zhì)譜系統(tǒng) LTQ ObitrapXL(Thermo)，金星磁珠富集法蛋白鑒定。
2、血清的采集及處理收集靜脈血在BD管中，避免溶血。緩慢地上下振蕩管五次，使血液中的凝結(jié)塊混勻。室溫(25°C )血凝結(jié)1小時，垂直放置。其中血液必須精確凝結(jié)一小時，否則，由于樣品不同的凝結(jié)時間而導(dǎo)致不同的肽譜。室溫下，用臨床離心機以1. 400-2. OOOg離心SST管 (真空采血管，BD公司)十分鐘。吸取血清(上清液)到對應(yīng)的已標(biāo)記管中。標(biāo)記干凈的 0.5ml離心管，同一血清樣品50 μ 1—管，分裝多管。立即凍存血清樣品于-80°C。由于反復(fù)凍融血清樣品易造成多肽沉淀，從而使得肽譜丟失部分多肽，應(yīng)避免反復(fù)凍融。凍存血清分為永久保存和待分裝的。血清分裝后可在-80°C保存多年。血清樣品的磁珠處理在進行Clirfrot實驗前，從低溫冰箱提取分裝的血清樣品各1管，放于濕冰上?；瘍?0 90分鐘。取出10 μ 1磁珠結(jié)合緩沖液(BS)，10 μ 1混勻的磁珠懸浮液，5μ 1血清樣品至樣品管，混勻。室溫靜置5min后，將樣品管放入磁珠分離器。 使磁珠貼壁1分鐘，磁珠與懸浮的液體分離，吸去懸浮的液體，再向樣品管中加入100 μ 1磁珠清洗緩沖液(WQ，在磁珠分離器前后相鄰兩孔間反復(fù)移動樣品管10次。最后一次使樣品管在磁珠分離器上靜置，磁珠與懸浮的液體分離，吸去懸浮的液體。重復(fù)從加100 μ 1磁珠清洗緩沖液，到最后吸去懸浮液體的操作步驟共3次。從磁珠分離器上取下樣品管，并向樣品管中加入5 μ 1磁珠洗脫緩沖液(EQ，溶解貼壁的磁珠，樣品管放入磁珠分離器，磁珠貼壁2min，磁珠與懸浮的液體充分分離后，將上清液移入干凈的剛加入5μ 1磁珠穩(wěn)定緩沖液 (SS)O. 5ml 樣品管。3.生物信息學(xué)方法(一 )質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集應(yīng)用Autof lexIITOF/TOF質(zhì)譜儀。激光能量 50% 時，IOshots 去雜，36% 時 50shots 采集一個樣品結(jié)晶點的某一個點，平均每個樣品結(jié)晶點收集8次共400shots。激光頻率 50Hz。數(shù)據(jù)收集范圍l-20KDa。在每8個樣品結(jié)晶點收集數(shù)據(jù)前用標(biāo)準(zhǔn)品進行外標(biāo)校正， 平均分子量偏差小于lOOppm。參見圖1，圖1中為血清多肽指紋譜圖，前三個(sigmaA-C) 為健康人的，后三個為I型糖尿病患者的。實驗質(zhì)控(1)對于每一張采集到的原始圖譜，我們設(shè)定S/N >= 5的峰數(shù)量做為評判圖譜質(zhì)量的一個標(biāo)準(zhǔn)；對于峰數(shù)量大于50的圖譜才保存，舍棄峰數(shù)量小于50的圖譜。 (2)針對整個實驗操作，采用Sigma血清的組內(nèi)變異系數(shù)保證實驗的一致性，本實例方法的變異系數(shù)為16. 2%，滿足一致性允許范圍，說明實驗一致性良好，參見表1、圖2。表1為 Sigma血清中12個蛋白峰的變異系數(shù)值；圖2為實驗中5個Sigma A-E血清的指紋圖譜。表ISigma血清的組內(nèi)變異系數(shù)
權(quán)利要求
1.用于檢測I型糖尿病特征蛋白的質(zhì)譜標(biāo)記，其包括質(zhì)荷比為7010.32、8141. 47、 7597.7,7645.62,3314.94,8862.88,7765.57,9062. 14,7921.58,7832.64,6630.96, 4643. 76,9289. 11,8565. 22,3302. 42,9429. 72 和 1984. 14m/z 的峰。
2.用于檢測I型糖尿病特征蛋白的質(zhì)譜模型，其特征在于，該質(zhì)譜模型中包含質(zhì)荷比為 7010.32,8141.47,7597.7,7645.62,3314.94,8862.88,7765.57,9062.14,7921.58、 7832. 64,6630. 96,4643. 76,9289. 11,8565. 22,3302. 42,9429. 72 和 1984. 14m/z 的峰，其中，當(dāng)3314. 94,6630. 96,3302. 42和1984. 14m/z的峰上調(diào)表達，其余質(zhì)荷比的峰都下調(diào)表達時，預(yù)示為I型糖尿病患者或潛在患者。
3.建立權(quán)利要求2所述質(zhì)譜模型的方法，包括如下步驟1)收集多例臨床確診的I型糖尿病患者血清和正常對照人員的血清作為兩組血清標(biāo)本，進行低溫冷凍備用；2)對血清蛋白進行質(zhì)譜前預(yù)處理；3)對預(yù)處理過的兩組血清蛋白進行質(zhì)譜檢測讀取，獲得兩組血清多肽的指紋圖譜；4)對所有的I型糖尿病患者和正常人血清多肽的指紋圖譜進行標(biāo)準(zhǔn)化處理，并收集數(shù)據(jù)；5)對所得數(shù)據(jù)進行標(biāo)準(zhǔn)化處理，篩選出具有下列質(zhì)荷比峰的17個I型糖尿病特征蛋白:7010. 32,8141. 47,7597. 7,7645. 62,3314. 94,8862.88,7765.57,9062.14,7921.58、 7832. 64,6630. 96,4643. 76,9289. 11,8565. 22,3302. 42,9429. 72 和 1984. 14m/z，根據(jù)這 17 個質(zhì)荷比峰建立檢測I型糖尿病特征蛋白的質(zhì)譜模型。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，其中步驟幻預(yù)處理的方法是采用磁珠純化和穩(wěn)定樣品中的血清蛋白或多肽。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于檢測I型糖尿病特征蛋白的質(zhì)譜模型，其包括質(zhì)荷比為7010.32、8141.47、7597.7、7645.62、3314.94、8862.88、7765.57、9062.14、7921.58、7832.64、6630.96、4643.76、9289.11、8565.22、3302.42、9429.72、1984.14m/z，其中，當(dāng)3314.94、6630.96、3302.42和1984.14m/z的峰上調(diào)表達，其余質(zhì)荷比的峰都下調(diào)表達時，預(yù)示為I型糖尿病患者或潛在患者。本發(fā)明的質(zhì)譜模型，可用于I型糖尿病早期檢測和篩查，方法簡單易于操作，準(zhǔn)確性高，為I型糖尿病早期檢測和篩查提供了新的思路。
文檔編號G01N30/06GK102323365SQ20111021697
公開日2012年1月18日 申請日期2011年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月29日
發(fā)明者任晶, 殷汝雷, 胡曉慧, 馬慶偉 申請人:毅新興業(yè)(北京)科技有限公司