專利名稱：激光誘導(dǎo)植物熒光測定土壤中重金屬對植物脅迫的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種測定土壤中重金屬對植物脅迫的方法，具體涉及一種He-Cd激發(fā)源的激光誘導(dǎo)植物熒光測定土壤中重金屬對植物脅迫的方法。屬于土壤環(huán)境中重金屬污染分析方法領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隨著金屬礦產(chǎn)資源的開采利用，重金屬元素通過大氣和污水灌溉進(jìn)入農(nóng)田，嚴(yán)重影響農(nóng)作物產(chǎn)量和農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)，引起嚴(yán)重的生態(tài)環(huán)境問題。重金屬在土壤-植物系統(tǒng)中的化學(xué)行為是個非常復(fù)雜的過程。不同的土壤類型、不同的重金屬在植物的不同的生長時期和植物不同的部位有著不同的積累模式，由此帶來的危害程度也不盡相同。傳統(tǒng)的方法在研究重金屬在土壤-植物系統(tǒng)中化學(xué)行為和重金屬對植物的毒理機(jī)制時，不得不借助大量的盆栽實驗和煩瑣的化學(xué)分析來完成。即通過加入不同濃度的重金屬模擬污染土壤，盆栽植物，然后通過對土壤和植物體內(nèi)重金屬的存在形態(tài)和含量等的化學(xué)分析獲取研究信息。 當(dāng)研究重金屬在土壤-植物系統(tǒng)中的遷移轉(zhuǎn)化的動態(tài)規(guī)律時，需要在植物生長的不同時期進(jìn)行取樣分析，所以要求更大量的盆栽實驗和更多的分析結(jié)果。顯而易見，傳統(tǒng)的研究方法，不僅需要大量的盆栽實驗獲取大量的植物樣本，而且生長的植物要遭到破壞。除此之外，還要進(jìn)行耗時、費力、花費大的化學(xué)分析。因此，發(fā)明一種簡便、快速、有效、經(jīng)濟(jì)的測定方法，在不損害植物生長的條件下研究土壤植物系統(tǒng)中的重金屬遷移轉(zhuǎn)化動態(tài)，對于推動環(huán)境化學(xué)研究的深入發(fā)展具有重大的理論意義和現(xiàn)實意義。當(dāng)植物用一短波刺激，如紫外線或藍(lán)光(320nm-380nm)，將產(chǎn)生四個熒光譜帶藍(lán) (F440)、綠(F520)、紅(F690)和遠(yuǎn)紅外(F735) 藍(lán)綠光(440-520nm)主要來自植物的表皮細(xì)胞發(fā)射，紅和遠(yuǎn)紅外(690-735nm)來自植物光和海藻或綠色植物細(xì)胞的葉綠體中植物蛋白結(jié)合的葉綠素a，能用來測定植物的光合作用效率。植物光合作用效率受到干旱、寒冷、光強(qiáng)度、環(huán)境污染、病原侵害等經(jīng)常減少。重金屬在植物新陳代謝過程中起重要作用已經(jīng)被廣泛的報道，重金屬能活化酶，參與蛋白質(zhì)和碳水化合物的合成；能通過Ca2+通道進(jìn)入植物體，影響植物抗氧化系統(tǒng)氣體交換、蒸騰作用和光合作用。重金屬對植物的危害程度取決于植物種類和基因差異，以及重金屬的毒性和進(jìn)入植物體內(nèi)重金屬的量等。因此，植物熒光除了能用來直接的定性植物是否受重金屬脅迫外，或許也能用來間接地反映引起植物熒光變化的重金屬的量(植物吸收重金屬的量)。前人將激光誘導(dǎo)植物熒光的方法主要用于植物種類鑒定和生長狀況等的遙感監(jiān)測或接觸植物測定水分、光照、養(yǎng)分、溫度等對植物的脅迫。目前，不管用激光誘導(dǎo)植物葉綠素?zé)晒?LICF)還是用激光誘導(dǎo)植物熒光(LIF)的方法反映重金屬的脅迫研究大都是定性的。還沒有定量反應(yīng)重金屬對植物的脅迫，導(dǎo)致植物熒光強(qiáng)度的變化與植物吸收重金屬的量聯(lián)系起來。目前，在測定葉綠素?zé)晒鈺r所用的激發(fā)源是多種多樣的，激發(fā)波長也大不相同。 Claus 小組(1996)用 CW He-Ne 激光源(The Karlsuhe CCD-OMA LIDAR-Fluorosensor)激發(fā)源，激發(fā)波長為632. Snm的條件下測定植物的脅迫影響。Gopal研究小組用氬離子激光器激發(fā)波長為448nm測定重金屬對玉米生長的影響。由于激發(fā)波長較長，能量較低，所以僅獲得了 690nm和735nm兩個熒光波帶。我們在研究中使用He-Cd激光器，激發(fā)波長為325nm， 獲得了 450nm、690nm和735nm三個植物熒光波帶。目前以He-Cd激光器作為激發(fā)光源，同時獲得3個植物熒光波帶的研究未見報道。葉綠素?zé)晒獗戎礔690/F735已經(jīng)用于指示植物生理學(xué)脅迫。比值F690/F735隨著光合作用的減少而增加，隨著葉綠素濃度的增加而減少。比值F450/F690和F450/F735也能表征植物的脅迫生理現(xiàn)象。也有用F-v/F-m或R)/Fv表征植物對重金屬的敏感性。一般認(rèn)為藍(lán)紅和藍(lán)綠熒光比值是最敏感和最合適的脅迫指示。綜上所述，傳統(tǒng)的研究方法在研究土壤-植物系統(tǒng)中重金屬的環(huán)境化學(xué)行為時， 存在的耗時、費力、樣本量大、花費大、難以動態(tài)監(jiān)測等主要問題。目前采用的激光誘導(dǎo)的方法反映重金屬的脅迫研究大都是定性的，還沒有定量反應(yīng)重金屬對植物的脅迫的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點，旨在提供一種不破壞植物生長、便于動態(tài)監(jiān)測的激光誘導(dǎo)植物熒光原位測定植物對重金屬吸收的新方法。本發(fā)明方法在于用 He-Cd激發(fā)源的活體植物激發(fā)光法作為一種工具用來測定土壤中重金屬對植物的脅迫。以 F450/(F690+F735)比值作為植物對重金屬吸收的定量基礎(chǔ)。通過不同的植物、不同重金屬、 不同土壤中植物熒光的光譜特征及影響因素，找出植物熒光強(qiáng)度與植物吸收重金屬之間的關(guān)系，通過數(shù)學(xué)擬合進(jìn)行定量公式修正，從而發(fā)明一種不破壞植物生長、便于動態(tài)監(jiān)測的激光誘導(dǎo)植物熒光原位測定植物對重金屬吸收的新方法。為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明方法的操作步驟如下(1)待測植物樣品的采集與預(yù)處理 選擇正常生長的黑麥草，用不銹鋼剪刀剪下第4片新葉，放在石英玻璃板上(切忌放在復(fù)印紙上，以防干擾測定)，用軟毛刷輕輕刷去葉面上浮土，若表面浮土較多，可用濕紗布輕輕擦拭，不得用水沖洗。然后將帶測植物同石英玻璃板一同放在避光盒中，待測。(2)激光誘導(dǎo)植物熒光的測定取待測植物樣品中段，分別剪下約5cm葉片段，兩頭用酯膠基依次固定在儀器固定支架上，注意盡量不要觸碰待測區(qū)域。激發(fā)光源用He-Cd激光(Kimmon IK series)在波長325nm，狹縫寬度0. 05mm，激發(fā)光通過1/細(xì)長的雙單色儀(Oriel 77225)，用350到SOOnm波長記錄光致發(fā)光強(qiáng)度。(3)結(jié)果計算A = F450/(F690+F735)式中F450，F(xiàn)690, F735分別是熒光強(qiáng)度譜圖在450nm，690nm和7!35nm處的峰高。
計算出的A值越大，重金屬的脅迫越重。(4)注意事項①測定最好在30分鐘內(nèi)完成，若樣本量過大，可在測定前采樣，分批采樣，切忌大量采樣放入冰箱保存。②測定環(huán)境要求保持室溫在25°C，避光或在紅光下操作。
該方法以短波激光源激發(fā)植物熒光，提出利用激光誘導(dǎo)植物熒光，以F450/ (F690+F735)比值作為植物對重金屬吸收的定量基礎(chǔ)，在不損害植物生長的前提下，原位測定植物熒光，間接地反映土壤-植物系統(tǒng)中重金屬的遷移轉(zhuǎn)化的方法；為土壤-植物系統(tǒng)中重金屬的環(huán)境化學(xué)行為的研究提供一種簡便、快速、經(jīng)濟(jì)、不破壞植物生長、可以動態(tài)監(jiān)測的方法，對于推動環(huán)境化學(xué)研究的深入發(fā)展和重金屬污染農(nóng)田的適時動態(tài)監(jiān)測具有重要的理論意義和現(xiàn)實意義。


圖1為不同濃度的Cu脅迫下黑麥草的熒光強(qiáng)度譜圖。圖2為不同濃度的1 脅迫下黑麥草的熒光強(qiáng)度譜圖。圖3為不同濃度的Cd脅迫下黑麥草的熒光強(qiáng)度譜圖。圖4為不同黑麥草葉片重金屬脅迫下的熒光強(qiáng)度譜圖。圖5為同一葉片不同部位重金屬脅迫下的熒光強(qiáng)度譜圖。
具體實施例方式下面通過具體實施例對本發(fā)明方法作進(jìn)一步闡述。本發(fā)明方法的實現(xiàn)包括激發(fā)光源的光譜特性、儀器操作條件確定；不同植物、不同重金屬脅迫下植物葉片的光譜特征參數(shù)；激光誘導(dǎo)植物熒光測定土壤中重金屬對植物脅迫的方法的影響因素等。實施例1 (一 )、不同植物、不同重金屬脅迫下植物葉片的光譜特征參數(shù)研究稱取1.00kg過20目篩的土壤(風(fēng)干土)于塑料缽中，分別加入0，50，100， 150mg. kg-1 的 Cu2+(CuSO4) ；0，500，1000，1500mg. kg-1 的 Pb2+(PbCl2) ；0，5，10，15mg. kg-1 的 Cd2+ (CdCl2)，在室內(nèi)培養(yǎng)兩個月，重金屬在土壤中的各形態(tài)分配達(dá)平衡后，每缽施磷酸二氫鉀0. 3333g、尿素0. 3477g ；然后播種植物，溫室內(nèi)生長。培養(yǎng)過程中保持土壤水分在田間持水量的60% 70%。三種土壤上共設(shè)置36個處理，每個處理重復(fù)3次。(1)待測植物樣品的采集與預(yù)處理選擇正常生長的黑麥草，用不銹鋼剪刀剪下第4片新葉，放在石英玻璃板上(切忌放在復(fù)印紙上，以防干擾測定)，用軟毛刷輕輕刷去葉面上浮土，若表面浮土較多，可用濕紗布輕輕擦拭，不得用水沖洗。然后將帶側(cè)植物同石英玻璃般一同放在避光盒中，待測。(2)激光誘導(dǎo)植物熒光的測定取待測植物樣品中段，分別剪下約5cm葉片段，兩頭用酯膠基依次固定在儀器固定支架上，注意盡量不要觸碰待測區(qū)域。激發(fā)光源用He-Cd激光(Kimmon IK series)在波長325nm.，狹縫寬度0. 05mm,激發(fā)光通過1/細(xì)長的雙單色儀(Oriel 77225)，用350到SOOnm波長記錄光致發(fā)光強(qiáng)度。(3)結(jié)果分析不同濃度的Cu，Pb和Cd脅迫下黑麥草的熒光強(qiáng)度在450nm，690nm和735nm處均出現(xiàn)峰。這三個峰高和峰形均隨著Cu，1 和Cd脅迫濃度的不同而不同。一般說來，隨著 Cu, Pb和Cd的濃度增加，690nm和750nm處的峰高呈降低趨勢，而450nm處的峰高增高(圖1-圖 3)。圖 1 中，CK-不加 Cu 的處理；Cuトカロ 50mg Cu kg-1 處理；Cu2_ 加 IOOmg Cu kg-1 處 理；Cu3-カロ 150mg Cu kg-1圖 2 中，CK-不加 Pb 的處理；Pbl-加 500mg Pbkg-1 處理；Pb2_ 加 IOOOmgPb kgヽ處 理；Pb3-カロ 1500mg Pb kg-1。 圖 3 中，CK-不加 Cd 的處理；Cdl-加 5. Omg Cdkg-1 處理；Cd2_ 加 10. Omg Cdkg-1 處 理；Cd3-加 15. Omg Cdkg-1。同一處理的不同的黒麥草單株和同一黒麥草葉片不同區(qū)域的黒麥草的熒光強(qiáng)度 譜圖(圖4、圖5)。分別在450nm，690nm和735nm處出現(xiàn)峰，這與圖1-圖3顯示的結(jié)果相 似。可以看出，在同一處理中不同的黒麥草單株的峰形和同一黒麥草葉片中不同區(qū)域的峰 形是相似的。( ニ)、測定結(jié)果表征方法研究為了尋找熒光強(qiáng)度與黒麥草對重金屬的吸收之間的關(guān)系，根據(jù)在三個峰的峰高分 別計算出 F450/F690，F(xiàn)450/F735, F690/F735 和 F45(V (F690+F735)的比值。表 1 的結(jié)果表 明加Cu,Pb和Cd的處理中，F(xiàn)450/F690，F(xiàn)450/F7;35和F45(V(F690+F735)比值均隨重金屬 脅迫濃度的増加而增加。表lCu，Pb 和 Cd 脅迫對熒光強(qiáng)度和 F450/F690、F450/F735、F690/F735、F450/ (F690+F735)的影響
權(quán)利要求
1.一種激光誘導(dǎo)植物熒光測定土壤中重金屬對植物脅迫的方法，其特征在于按如下步驟操作第一步，待測植物樣品的采集與預(yù)處理選擇正常生長的黑麥草，用不銹鋼剪刀剪下第4片新葉，放在石英玻璃板上，輕輕刷去或擦去葉面上浮土，然后將帶測植物同石英玻璃板一同放在避光盒中待測；第二步，激光誘導(dǎo)植物熒光的測定取待測植物樣品中段，分別剪下約5cm葉片段，兩頭用酯膠基依次固定在儀器固定支架上，激發(fā)光源用He-Cd激光， 在波長325nm，狹縫寬度0. 05mm,激發(fā)光通過1/ !長的雙單色儀，用350-800nm波長記錄光致發(fā)光強(qiáng)度；第三步，結(jié)果計算=A = F450/(F690+F735)，式中，F(xiàn)450, F690, F735分別是熒光強(qiáng)度譜圖在450nm，690nm和735nm處的峰高，計算出的A值越大，重金屬的脅迫越重。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種激光誘導(dǎo)植物熒光測定土壤中重金屬對植物脅迫的方法，其特征在于測定在30分鐘內(nèi)完成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種激光誘導(dǎo)植物熒光測定土壤中重金屬對植物脅迫的方法，其特征在于測定環(huán)境保持室溫在25°C，避光或在紅光下操作。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種He-Cd激發(fā)源的激光誘導(dǎo)植物熒光測定土壤中重金屬對植物脅迫的方法。選擇正常生長的黑麥草，剪下新葉，放在石英玻璃板上，將帶測植物同石英玻璃板一同放在避光盒中待測；取待測植物樣品，兩頭用酯膠基依次固定在儀器固定支架上，激發(fā)光源用He-Cd激光，在波長325nm，狹縫寬度0.05mm，激發(fā)光通過1/4m長的雙單色儀，用350-800nm波長記錄光致發(fā)光強(qiáng)度；計算結(jié)果A＝F450/(F690+F735)，F(xiàn)450，F(xiàn)690，F(xiàn)735分別是熒光強(qiáng)度譜圖在450nm，690nm和735nm處的峰高，A值越大，重金屬的脅迫越重。本發(fā)明方法操作簡單，在不損害植物生長的前提下，原位測定植物熒光，為土壤-植物系統(tǒng)中重金屬的環(huán)境化學(xué)行為的研究提供一種簡便、快速、經(jīng)濟(jì)、可以動態(tài)監(jiān)測的方法。
文檔編號G01N21/64GK102288590SQ201110198388
公開日2011年12月21日 申請日期2011年7月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月15日
發(fā)明者成杰民 申請人:山東師范大學(xué)