專利名稱：一種膽固醇分子印跡膜傳感電極檢測血液膽固醇的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及測定血液中膽固醇的含量，具體涉及使用膽固醇分子印跡膜傳感電極來檢測血液中膽固醇的含量。
背景技術(shù)：
膽固醇在人體內(nèi)具有重要的生理作用，它在形成膽酸、構(gòu)成細胞膜重要成分、合成參與機體內(nèi)各種物質(zhì)代謝的激素等方面有著重要的作用與功能，但當(dāng)其過量時便會導(dǎo)致高膽固醇血癥，對機體產(chǎn)生不利影響?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，動脈粥樣硬化、靜脈血栓形成與高膽固醇血癥有密切的相關(guān)性；高膽固醇還會對人體的骨質(zhì)健康產(chǎn)生不良影響，大量攝入膽固醇會導(dǎo)致牙和牙齦間的溝隙會擴大，防止細菌進入溝隙的細胞會失去功能，細菌進入溝隙導(dǎo)致牙周病，牙周病嚴重者，最終導(dǎo)致牙齒脫落。常用的檢查血液中膽固醇的方法有色譜法、試劑法、膽固醇酶感應(yīng)電極法等。色譜法是檢測生物樣品中膽固醇含量的標準方法，但是其對低濃度的生化分子成分檢測結(jié)果具有不穩(wěn)定性；試劑法在配置用于測定膽固醇含量的試劑時，需要加入繁多的緩沖液、防腐劑、顯色劑、催化劑、穩(wěn)定劑等，配置過程復(fù)雜，試劑反應(yīng)需要時間在M小時左右；膽固醇酶感應(yīng)電極法中，需要添加合適的表面活性劑，使酶與膽固醇分子充分接觸，否則將得不到準確的結(jié)果。目前利用分子印跡技術(shù)發(fā)展出很多新型的固相萃取、膜分離、免疫分析、抗體模擬、色譜固定器、仿生物傳感器、催化劑、合成酶等方法。分子印跡技術(shù)是指通過分子印跡聚合物對印跡分子(或稱模板分子)的“記憶”效應(yīng)達到分子識別的目的。在形成分子印跡聚合物時，分子印跡聚合物內(nèi)部形成了許多空穴，而且空穴之間有通道相連，通道的直徑與空穴的大小相近，因此通道能起到攔截非模板分子的作用。在分子印跡聚合物的復(fù)合層內(nèi)，只有尺寸較小的模板分子可以通過通道，與空穴內(nèi)的作用點位相互作用被識別，而結(jié)構(gòu)不同的其他分子難以通過內(nèi)部通道，因而不被識別。利用分子印跡復(fù)合膜分離層的這一特性，模板分子可以源源不斷地從膜一側(cè)轉(zhuǎn)移到另一側(cè)，而非模板分子則不會通過膜。由于分子印跡聚合物對模板分子的識別具有專一性，而且穩(wěn)定性能好，因此其膜適合作為靈敏度較高的傳感器，但是由于分子印跡膜的制備存在很多技術(shù)難點，如需要針對不同的模板分子尋找合適的功能單體；由于制備出來的膜有脆性，需要合適的交聯(lián)劑來進行固化；需要要選擇合適的洗脫劑，不僅要能洗去模板分子，還要能保持膜內(nèi)空穴形態(tài)等，目前其實際應(yīng)用還受到了很大限制。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述技術(shù)問題，本發(fā)明利用膽固醇分子印跡膜傳感電極檢測血液中的膽固醇含量。本膽固醇分子印跡膜傳感電極在檢測血液中的膽固醇含量時，具有成本低、靈敏度高、分析速度快、可以縮減取樣量、避免繁瑣的血液樣品預(yù)處理等優(yōu)點。本發(fā)明的技術(shù)方案如下
3一種膽固醇分子印跡膜傳感電極的用途，用于檢測血液中的膽固醇含量，具體檢測步驟為
(1)血液樣本處理如果血液樣本為人體在空腹采取的血液，則在室溫下靜置，然后進行離心處理，分離出血清；如果血液樣本為血漿，則用肝素或EDTA (乙二胺四乙酸)進行抗凝；
(2)取步驟(1)得到的血液樣本滴加到膽固醇分子印跡膜傳感電極上，然后將該膽固醇分子印跡膜傳感電極插入電流型傳感器，測定并記錄讀數(shù)；
所述膽固醇分子印跡膜傳感電極，由下述制備步驟得到
(1)取絕緣電極基片，涂覆分離的工作電極和對電極，所述工作電極為圓形，對電極為環(huán)繞工作電極的半圓環(huán)形；
(2)在所述絕緣電極基片上對應(yīng)步驟(1)的工作電極和對電極，用導(dǎo)電漿分別印制依次連接的工作電極連線和接線端子以及對電極連線和接線端子；
(3)在所述工作電極連線以及對電極連線表面涂覆一層絕緣層；在所述工作電極以及對電極的表面涂覆一層膽固醇分子印跡膜；
(4)所述膽固醇分子印跡膜的制備方法如下
A、稱取膽固醇模板分子與功能單體溶于有機溶劑中，經(jīng)過超聲波震蕩使其混合均勻， 再向其中加入交聯(lián)劑，經(jīng)過超聲波震蕩使其混合均勻，然后向其中加入引發(fā)劑和粘合劑，經(jīng)過超聲波震蕩使其混合均勻，最后向該溶液中通入氮氣除氧，將所得溶液密封待用；
B、將步驟A所得的溶液滴加到工作電極和對電極表面，蓋玻片壓蓋，在365nm紫外光照射下進行聚合反應(yīng)，合成含有膽固醇模板分子的薄膜；
C、將步驟B所得的承載膽固醇模板分子薄膜的電極用洗脫液進行洗脫，使膽固醇模板分子除去，直到最后一次洗脫液中檢測不到膽固醇模板分子存在，得到膽固醇分子印跡膜， 將制備好的電極保存在雙蒸水中備用；
上述步驟中各種試劑的添加量為膽固醇模板分子為0. iTl.2mm0l，有機溶劑為 90 120ml，功能單體為5. 8 6. Immol,交聯(lián)劑為34 36mmol，引發(fā)劑為25 35mg，粘合劑 0. 04、. 056ml ；將步驟A所得的溶液滴加到工作電極和對電極表面時，滴加的溶液體積為 8 15ul，所形成的膽固醇分子印跡膜為圓形，其直徑為5 6mm，厚度為8(Tl00Um ；
所述電極基片的材質(zhì)為聚碳酸酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯中的一種，其形狀為片材或卷材；工作電極連線以及對電極連線表面涂覆的絕緣層的材質(zhì)為聚氯乙烯；功能單體為甲基丙烯酸、甲基丙烯酰胺、丙烯酰胺中的一種；有機溶劑為氯仿和甲苯的混合溶液，氯仿和甲苯的體積比為1:5、；交聯(lián)劑為二甲基丙烯酸乙二醇酯；引發(fā)劑為偶氮二異丁腈；粘合劑為水性聚氨酯；洗脫液為氯仿和乙酸的混合溶液，氯仿和乙酸的體積比為1:0. 2^0. 3。其中，將血液樣本滴加到膽固醇分子印跡膜傳感電極上檢測時，滴加的血液樣本體積為纊15ul ；如果血液樣本為人體在空腹時采取的血液，則在室溫下靜置的時間為 2(T30min ；采用EDTA (乙二胺四乙酸)進行血漿抗凝時，EDTA的濃度為lmg/mL。本發(fā)明的檢測機理為以目標分子膽固醇為模板，與功能單體接觸并通過誘發(fā)聚合反應(yīng)，圍繞模板形成聚合物，洗脫膽固醇模板分子后，聚合物內(nèi)部分布著大量膽固醇模板分子的印跡“空穴”，其在空間結(jié)構(gòu)、結(jié)合位點等方面高度匹配膽固醇模板分子。用膽固醇分子印跡聚合物膜作為敏感材料，對待測樣品進行檢測，待測樣品中的膽固醇分子能夠與這種“空穴”結(jié)合，從而改變分子印跡膜的電化學(xué)性質(zhì)，造成分子印跡膜的電導(dǎo)率增大、過膜電流增加。通過將覆蓋有膽固醇分子印跡膜的電極與電流型傳感器相連接，可以快速、靈敏的檢測出樣品中是否含有膽固醇分子。本發(fā)明有益的技術(shù)效果在于
(1)本膽固醇分子印跡膜傳感電極采用二甲基丙烯酸乙二醇酯、氯仿和甲苯的混合溶液等親水性溶劑作交聯(lián)劑和有機溶劑，降低了分子印跡膜制備及使用過程中對溶劑的要求，所制備的聚合物可直接測試含水溶劑，擴大了材料的應(yīng)用范圍；
(2)本膽固醇分子印跡膜傳感電極在膽固醇分子印跡膜的制備過程中加入了粘合劑水性聚氨酯，增加了分子印跡膜的柔韌性，防止了在聚合過程中分子印跡膜出現(xiàn)裂痕的現(xiàn)象， 并使所制備的分子印跡膜內(nèi)部的空穴分布均勻，十分有利于檢測效果的提高；
(3)本膽固醇分子印跡膜傳感電極通過絲網(wǎng)印刷技術(shù)與分子印跡聚合技術(shù)相結(jié)合獲得膽固醇傳感器，實現(xiàn)了微型化和集成化，適合于現(xiàn)場檢測，并能避免繁瑣的樣品預(yù)處理過程，對于不同樣品，只需替換附有膽固醇分子印跡膜的絲網(wǎng)印刷電極即可，通過它可以很快地檢測出血液樣本中膽固醇的含量，具有成本低、使用壽命長、重現(xiàn)性良好和特異性識別能力強等優(yōu)點。


圖1為本膽固醇分子印跡膜傳感電極的平面結(jié)構(gòu)示意圖，圖中1、電極基片；2、接線端子；3、電極連線；4、工作電極；5、對電極；6、絕緣層；7、膽固醇分子印跡膜。圖2為本膽固醇分子印跡膜傳感電極的側(cè)視圖，圖中1、電極基片；6、絕緣層；7、 膽固醇分子印跡膜。圖3為使用本發(fā)明進行檢測時電信號的處理流程圖。具體實施方法
下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的實施例作詳細說明，本發(fā)明的保護范圍不限于下述實施例。實施例1
(一)制備電極。如圖1和圖2所示，取絕緣電極基片1，采用采用絲網(wǎng)印刷技術(shù)，用導(dǎo)電銀漿涂覆分離的工作電極4和對電極5，所述工作電極4為圓形，對電極5為環(huán)繞工作電極4的半圓環(huán)形；在所述絕緣電極基片1上對應(yīng)工作電極4和對電極5，分別印制依次連接的工作電極連 3和接線端子2以及對電極連線3和接線端子2 ；在所述工作電極連線3以及對電極連線3
表面涂覆一層絕緣層6。其中，電極基片1的長度為38mm、寬10mm、厚0. 5mm ； 接線端子2的長度為10mm、寬為Imm ；
電極連線3的長度為20mm、寬為Imm ； 兩條平行電極連線3之間的間距為3mm ； 工作電極4為直徑Imm的實心圓形； 對電極5的外直徑為4mm、內(nèi)直徑為2mm。在上述制備好的電極基片的工作電極4和對電極5表面涂覆一層膽固醇分子印跡膜7，所述膽固醇分子印跡膜7的制備方法如下
A、稱取Immol(0. 386g)膽固醇模板分子與6mmol (0. 516g)甲基丙烯酸功能單體溶于 IOOml體積比為1 7的氯仿和甲苯混合溶液中，經(jīng)過超聲波震蕩10分鐘使其混合均勻，再向其中加入35mmol (6. 937g)二甲基丙烯酸乙二醇酯交聯(lián)劑，經(jīng)過超聲波震蕩15使其混合均勻，然后向其中加入0. 03g偶氮二異丁氰引發(fā)劑和0. 05ml水性聚氨酯粘合劑，經(jīng)過超聲波震蕩20分鐘使其混合均勻，然后向該溶液中通入氮氣除氧5分鐘，將所得溶液密封待用；
B、將步驟A所得的溶液滴加IOul到工作電極4和對電極5表面，蓋玻片壓蓋，在365nm 紫外光距離18cm照射聚合15分鐘，重復(fù)兩次，形成含有膽固醇模板分子的薄膜；
C、將步驟B所得的承載膽固醇模板分子薄膜的電極用體積比為1:0.25的氯仿-乙酸混合溶液在索氏提取器中提取16小時，室溫超聲波震蕩后離心收集上清液，反復(fù)洗脫膽固醇模板分子，直到最后一次上清液中檢測不到膽固醇模板分子存在，將制備好的電極保存在雙蒸水中備用。其中，分子印跡膜片7為直徑5mm的圓形，厚度為90um。(二)制備血液樣品。將空腹采取的血液樣本1ml，在室溫下放置30min后，進行離心處理，分離出血清， 將血清置于潔凈試管中加蓋保存。(三)檢測樣品。取IOul經(jīng)上述處理得到的血液樣品(血清)滴加到本分子印跡膜傳感電極上，然后將其插入電流型傳感器，測定并記錄讀數(shù)。針對于同一樣品，更換分子印跡膜傳感電極條， 連續(xù)檢測5次，以所得的平均值作為檢測值。檢測的工作原理如圖3所示電極基上的分子印跡膜內(nèi)的特異性空穴選擇性的與血液樣品中的膽固醇分子結(jié)合，造成分子印跡膜電化學(xué)性質(zhì)變化，導(dǎo)致恒電位激勵下的電流發(fā)生變化，電流信號經(jīng)電流-電壓轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)化為電壓信號并放大，再經(jīng)模數(shù)轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號，經(jīng)單片機分析處理后，數(shù)據(jù)在存儲器中保存記錄并可隨時提取，同時膽固醇濃度直接從液晶顯示電路讀出，數(shù)據(jù)可通過USB接口傳輸?shù)接嬎銠C做長期儲存。本方法在檢測血液樣品時，線性范圍介于100mg/d廣400mg/dl之間，即血液樣品中膽固醇濃度在100mg/dl 400mg/dl之間時，檢測結(jié)果較為準確。其中單位dl為分升，即 1L/10。(四)檢測結(jié)果。一般情況下，成人的總膽固醇含量的正常值為2. 86飛.98mmol/L，兒童的總膽固醇含量的正常值為3. 12^5. 20mmol/L。膽固醇的分子式為C27H46O,分子量為386. 66，根據(jù)Img/ dl=lmmol/LX386.66mg/10，可以換算出成人的總膽固醇正常值為11廣231 mg/dl，兒童的總膽固醇的正常值為12廣201mg/dl。在本實施例中，5次檢測得到的樣品血液樣品中膽固醇的平均含量為185mg/dl， 5次檢測的相對標準偏差為5. 1%，可以看出本膽固醇分子印跡膜傳感電極檢測的重復(fù)性良好。把制備好的膽固醇分子印跡膜傳感電極在_4°C條件下保存在雙蒸水中，經(jīng)過兩個月之后重新檢測相同的血液樣品，檢測結(jié)果表明兩次檢測結(jié)果的相對標準偏差小于3. 2%， 由此可見本膽固醇分子印跡膜傳感電極用于檢測血液的膽固醇含量時具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。
權(quán)利要求
1.一種膽固醇分子印跡膜傳感電極的用途，其特征在于用于檢測血液中的膽固醇含量，具體檢測步驟為(1)血液樣本處理如果血液樣本為人體在空腹時采取的血液，則在室溫下靜置，然后進行離心處理，分離出血清；如果血液樣本為血漿，則用肝素或EDTA (乙二胺四乙酸)進行抗凝；(2)取步驟(1)得到的血液樣本滴加到膽固醇分子印跡膜傳感電極上，然后將該膽固醇分子印跡膜傳感電極插入電流型傳感器，測定并記錄讀數(shù)；所述膽固醇分子印跡膜傳感電極，由下述制備步驟得到(1)取絕緣電極基片，涂覆分離的工作電極和對電極，所述工作電極為圓形，對電極為環(huán)繞工作電極的半圓環(huán)形；(2)在所述絕緣電極基片上對應(yīng)步驟(1)的工作電極和對電極，用導(dǎo)電漿分別印制依次連接的工作電極連線和接線端子以及對電極連線和接線端子；(3)在所述工作電極連線以及對電極連線表面涂覆一層絕緣層；在所述工作電極以及對電極的表面涂覆一層膽固醇分子印跡膜；(4)所述膽固醇分子印跡膜的制備方法如下A、稱取膽固醇模板分子與功能單體溶于有機溶劑中，經(jīng)過超聲波震蕩使其混合均勻， 再向其中加入交聯(lián)劑，經(jīng)過超聲波震蕩使其混合均勻，然后向其中加入引發(fā)劑和粘合劑，經(jīng)過超聲波震蕩使其混合均勻，最后向該溶液中通入氮氣除氧，將所得溶液密封待用；B、將步驟A所得的溶液滴加到工作電極和對電極表面，蓋玻片壓蓋，在365nm紫外光照射下進行聚合反應(yīng)，合成含有膽固醇模板分子的薄膜；C、將步驟B所得的承載膽固醇模板分子薄膜的電極用洗脫液進行洗脫，使膽固醇模板分子除去，直到最后一次洗脫液中檢測不到膽固醇模板分子存在，得到膽固醇分子印跡膜， 將制備好的電極保存在雙蒸水中備用；上述步驟中各種試劑的添加量為膽固醇模板分子為0. iTl.2mm0l，有機溶劑為 90 120ml，功能單體為5. 8 6. Immol,交聯(lián)劑為34 36mmol，引發(fā)劑為25 35mg，粘合劑 0. 04、. 056ml ；將步驟A所得的溶液滴加到工作電極和對電極表面時，滴加的溶液體積為 8 15ul，所形成的膽固醇分子印跡膜為圓形，其直徑為5 6mm，厚度為8(Tl00Um ；所述電極基片的材質(zhì)為聚碳酸酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯中的一種，其形狀為片材或卷材；工作電極連線以及對電極連線表面涂覆的絕緣層的材質(zhì)為聚氯乙烯；功能單體為甲基丙烯酸、甲基丙烯酰胺、丙烯酰胺中的一種；有機溶劑為氯仿和甲苯的混合溶液，氯仿和甲苯的體積比為1:5、；交聯(lián)劑為二甲基丙烯酸乙二醇酯；引發(fā)劑為偶氮二異丁腈；粘合劑為水性聚氨酯；洗脫液為氯仿和乙酸的混合溶液，氯仿和乙酸的體積比為1:0. 2^0. 3。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種膽固醇分子印跡膜傳感電極的用途，其特征在于將血液樣本滴加到膽固醇分子印跡膜傳感電極上檢測時，滴加的血液樣本體積為壙15ul。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種膽固醇分子印跡膜傳感電極的用途，其特征在于如果血液樣本為人體在空腹時采取的血液，則在室溫下靜置的時間為2(T30min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種膽固醇分子印跡膜傳感電極的用途，其特征在于采用 EDTA (乙二胺四乙酸)進行血漿抗凝時，EDTA的濃度為lmg/mL。
全文摘要
一種膽固醇分子印跡膜傳感電極的用途，用于檢測血液中的膽固醇含量，具體檢測步驟為(1)血液樣本處理如果血液樣本為人體在空腹時采取的血液，則在室溫下靜置，然后進行離心處理，分離出血清；如果血液樣本為血漿，則用肝素或EDTA(乙二胺四乙酸)進行抗凝；(2)取步驟(1)得到的血液樣本滴加到膽固醇分子印跡膜傳感電極上，然后將該膽固醇分子印跡膜傳感電極插入電流型傳感器，測定并記錄讀數(shù)。本膽固醇分子印跡膜傳感電極在檢測血液中的膽固醇含量時，具有成本低、靈敏度高、分析速度快、可以縮減取樣量、避免繁瑣的血液樣品預(yù)處理等優(yōu)點。
文檔編號G01N27/416GK102353710SQ20111019085
公開日2012年2月15日 申請日期2011年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月8日
發(fā)明者周智慧, 朱秋勁, 毛飛君, 王捷, 趙曉聯(lián) 申請人:無錫市金坤生物工程有限公司