專利名稱：一種基于空間校正及光譜校正的毛細管陣列電泳檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種毛細管陣列電泳檢測方法，屬于高通量微量分析技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
DNA測序是現(xiàn)代分子生物研究中的重要技術(shù)，而電泳技術(shù)是DNA測序中必不可少的技術(shù)手段。由于毛細管具有良好的散熱效能，允許在毛細管兩端加上高至30kV的電壓， 分離毛細管的縱向電場強度可達到400V/cm以上，因而分離操作可以在很短的時間內(nèi)完成，達到非常高的分離效率(理論塔板數(shù)達到400000/m以上，最高達107/m數(shù)量級)。因為毛細管的內(nèi)徑很小(一般< 100 μ m)，對內(nèi)徑50 μ m,長度為50cm的毛細管，其容積不足 1 μ L，進樣體積在nL級，樣品濃度可低于10 4mol/L。毛細管電泳技術(shù)達到了儀器分析所要求的高效，快速，樣品用量少等最基本和最優(yōu)異的特點。此外，毛細管電泳技術(shù)還有容易自動化，操作簡便，容劑消耗少，環(huán)境污染小等優(yōu)點。毛細管電泳技術(shù)應(yīng)用首先集中在氨基酸，糖類，核酸和蛋白質(zhì)等生物分子的分離分析上，隨著此項技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，其應(yīng)用已逐漸的向醫(yī)藥衛(wèi)生，食品化工，環(huán)境等領(lǐng)域滲透。毛細管電泳技術(shù)還應(yīng)用于DNA的高速測序，蛋白質(zhì)的高效分離，糖類分析，細胞分析，手性拆分，物理化學(xué)常數(shù)的測定，生產(chǎn)工程控制等。為了提高毛細管檢測的通量，毛細管陣列作為高通量電泳分析手段被廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)分析中。在醫(yī)療、化學(xué)化工、生物制藥、法醫(yī)分析等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用毛細管陣列進行微量試劑的定性和定量分析。毛細管陣列可以同時實現(xiàn)批量試劑的分析。但由于毛細管之間的位置關(guān)系存在不確定性，使得毛細管陣列進行微量試劑的定性和定量分析時存在誤差。另外對于單個毛細管中多色熒光染料的同時檢測，由于熒光標記物的熒光譜帶比較寬， 造成不同熒光光譜之間的很大重疊，通過普通的分光很難將它們很好的區(qū)分開，這也造成了毛細管電泳分析的很大誤差。目前尚沒有消除這些誤差的成熟技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種能夠準確矯正每個毛細管在毛細管陣列中位置并能準確識別各熒光標記物特異性的毛細管陣列電泳檢測方法，極大提高毛細管檢測的精確度。本發(fā)明提供一種基于空間校正及光譜校正的毛細管陣列電泳檢測方法，所述方法包括步驟(1)利用拉曼光譜定位毛細管陣列中各毛細管在電荷耦合元件上的成像位置， (2)通過光譜校正對每根毛細管中的多色熒光染料進行解譜，(3)對毛細管陣列電泳的DNA 片斷進行分析。進一步，所述方法步驟(1)包括A.用激光束照射毛細管束發(fā)出拉曼光，B.通過拉曼成像儀成像在電荷耦合元件CCD上，C.分析電荷耦合元件CCD上的光譜圖對毛細管束中各毛細管進行定位。進一步，所述激光束照射毛細管束內(nèi)的溶劑水散射發(fā)出拉曼光，所用激光束為雙激光束，所述雙激光束的波長分別為488nm和514. 5nm。進一步，所述方法步驟C.中以像素數(shù)為橫軸，光譜強度為縱軸得到空間校正譜圖，通過峰識別得到每根毛細管中心位置和每根毛細管之間的有效寬度。進一步，所述方法步驟( ，用激光束照射毛細管，毛細管中熒光染料被激發(fā)產(chǎn)生熒光光譜，所述熒光光譜經(jīng)過成像裝置成像在電荷耦合元件面陣CCD上，將所用η種熒光標記物分別在所述面陣CCD上成像，得到η種熒光在所述CCD上的光譜分布，將每種熒光落在象素為mXp面陣CXD每個象素上的熒光強記錄下來，得到mXn的矩陣P，對矩陣P進行歸一得到矩陣Q=，通過Q矩陣對所用熒光在CXD上的成像組合進行光譜解譜，其中 n、m、p均為自然數(shù)。進一步，所述熒光光譜經(jīng)過成像裝置成像在線陣CXD上。進一步，所述方法步驟C3)對所述電荷耦合元件CCD上獲得的每一幀光譜數(shù)據(jù)，通過空間校正，區(qū)分出每根毛細管對應(yīng)的光譜數(shù)據(jù)，對每一根毛細管中的光譜數(shù)據(jù)，通過光譜校正矩陣解譜得到每種染料的光譜數(shù)據(jù)及每種熒光獨立的位置分布，對連續(xù)多幀光譜數(shù)據(jù)進行處理獲得DNA片斷信息。本發(fā)明方法的實現(xiàn)分三步。第一步通過空間校正實現(xiàn)毛細管陣列的位置識別；第二步通過光譜校正實現(xiàn)對一根毛細管中的多色熒光染料進行解譜；第三步進行DNA片斷分析。1.空間校正空間校正的目的是為了給出每根毛細管在CXD上的成像位置。采用凝膠中水散射激光發(fā)生拉曼散射，測量散射光在CXD上的成像來確定每根毛細管的位置。用激光照在毛細管上，激光被毛細管凝膠中的水散射，發(fā)出拉曼光，通過取光狹縫，光柵分光，透鏡聚焦后成像在CXD上，分析CXD上的光譜圖確定毛細管位置分布?？臻g校正采用雙激光束，分別為488nm和514. 5nm。水的特征拉曼峰位于3400CHT1 處。對于488nm (20491. 8cm"1)，水散射的拉曼特征峰位于17091. 8cm"1，對應(yīng)的波長為 585nm。對于514. 5nm(19436. 3CHT1)，水散射的拉曼特征峰位于16036. 3CHT1，對應(yīng)的波長為 623. 6nm。其譜主要分布在^OOcnT1到3800CHT1波數(shù)之間。488nm和514. 5nm激光被水散射的特征拉曼峰投影到數(shù)據(jù)采集CXD上可以得到圖3。藍光(左側(cè))是采集488nm激光被水散射的拉曼光強度，紅光(右側(cè))對應(yīng)的是采集514. 5nm激光被水散射的拉曼熒光強度，每一個峰對應(yīng)一根毛細管，采用相鄰毛細管間隔采集不同波長激光被散射的拉曼光的特點，即單數(shù)毛細管采集488nm激光器激發(fā)的拉曼光，雙數(shù)毛細管采集514. 5nm激光器激發(fā)的拉曼光，反之亦可。從圖中我們可以看到，488nm 和514. 5nm激光被水散射的拉曼峰恰好能夠分開，且正好分布在CXD檢測范圍之內(nèi)500 660nm。這恰好符合了空間校正中采集兩組數(shù)據(jù)進行校正的需求。圖4給出了空間校正CCD 上的一幀光譜圖，從圖4上可以明顯看到每根毛細管上對應(yīng)兩個亮點(拉曼峰值)。對圖4進行橫軸數(shù)據(jù)求和作為光譜強度，以縱軸象素為橫坐標作圖給出空間校正譜圖如圖5所示。通過簡單的峰識別可以給出每根毛細管中心位置(如圖6所示)和有效寬度(一般左右各取一個或兩個象素)。2、光譜校正為實現(xiàn)對檢測信號的特異性分析，必需進行校正處理，最通用的技術(shù)方法是建立顏料組合熒光信號矩陣，用于數(shù)據(jù)分析時信號強度的校正。對熒光的光強信息沒有太苛刻的要求，只要得到熒光準確的位置和時間信號就可以獲得所期望的實驗結(jié)果。但是一般熒光標記物的熒光譜帶比較寬，這造成不同熒光光譜之間的重疊成分很大，通過普通的分光很難將它們很好的區(qū)分開。如果采用把光譜展得很寬以獲得較高的分辨能力的方法，會使熒光強度嚴重下降，探測靈敏度和信噪比就成為了難題。針對這類探測方法的特殊性，我們在進行熒光探測前要對所使用的已知熒光染料進行光譜校正，即要得到激光激發(fā)的每種所用標記熒光光譜在CCD上單獨成像，根據(jù)成像得到熒光光譜的分布矩陣，對矩陣歸一后就可以用歸一矩陣對探測的熒光譜進行解譜以得到所要的熒光譜圖。熒光光譜帶較寬且強度很弱，用面陣CCD很難讓熒光成像很好的區(qū)分開，如果把光譜展得很寬以獲得較高分辨能力，熒光的強度會嚴重減弱，信號的靈敏度和信噪比會下降。如果光譜展開的比較窄，熒光比較強，則熒光光譜重疊就會加劇，甚至無法判讀光譜峰位，解譜成為難題。為了兼顧以上兩個方面，一般儀器都采用了光電倍增管來代替CCD。這就要同時采用多個光電倍增管，使得分光系統(tǒng)變得很復(fù)雜。針對熒光信號靈敏度和光譜解譜兩個相互制約的難題，本發(fā)明采用激光激發(fā)熒光光譜，并對熒光光譜進行光譜校正的方法進行CCD信號處理。采用該方法無需太多關(guān)注光譜的展寬程度，只要所用熒光光譜形狀不完全重合，強度分布不同，就可以通過光譜校正得到各種熒光的相對強度，同時把CCD上所有的感光信號都有效利用起來，從而增加CCD的靈敏度，提高熒光信號的信噪比。用光譜校正對面陣CCD上熒光信號進行解譜的步驟如下。首先我們要知道所用熒光標記物有幾種，設(shè)定為η種。我們讓η種標記熒光分別在面陣C⑶上成像，得到這η種熒光在C⑶上的光譜分布。面陣CXD象素為mXp。把每種熒光落在C⑶每個象素上的熒光強記錄下來，得到一個mXn的矩陣P。由于每種標記物被激發(fā)的熒光強度差別很大，為了后期進行信號處理的方便，對矩陣P進行歸一得到矩陣Q =
(Qij) mXn0通過Q矩陣我們就可以對所用熒光在CXD上的成像組合進行光譜解譜了。如某時刻從CCD各個象素上采的熒光光強分布為一 mX 1矩陣B，每種熒光的相對強度是一個ηX 1 矩陣X，貝IJ :QX = B。進行矩陣變換得到X= (QtQ)^1(QtB)0從上式可以得知，當我們得到了光譜校正矩陣Q后，只要得到任意時刻熒光落在面陣CCD上各個象素的強度分布矩陣B，就可以通過光譜校正得到各種熒光的相對強度分布，從而得到所用熒光的光譜信息。在下面的實驗中可以看出，即使CCD上的熒光光譜重疊非常嚴重，甚至無法判讀出峰位，也可以通過這種方法得到很好的熒光譜圖。3、DNA片段分析進行DNA片斷分析時，對獲得CXD上的每一幀光譜數(shù)據(jù)，首先通過空間校正，區(qū)分出每根毛細管對應(yīng)的光譜數(shù)據(jù)。對每一根毛細管中的光譜數(shù)據(jù)，通過光譜校正矩陣解譜得到每種染料的光譜數(shù)據(jù)。原來分布雜散的光譜分光后得到每種熒光獨立的位置分布，分布位置對應(yīng)光譜波長。對連續(xù)多幀光譜數(shù)據(jù)進行處理獲得DNA片斷信息。本發(fā)明的有益效果(1)采用激光激發(fā)石英或水的拉曼光譜實現(xiàn)光譜成像；(2)可采用單一或多激光器激發(fā)；(3)實現(xiàn)毛細管在CXD上的位置定位和平行度調(diào)整；
(4)采用熒光染料組合矩陣實現(xiàn)單個毛細管中多色熒光染料的同時檢測；(5)可以回收熒光染料分散在線陣CCD上所有象素上的有效光，光譜利用率高；(6)可以采用象素組合的方式提高分布矩陣的穩(wěn)定性，減少計算量，提高檢測的穩(wěn)定性；(7)可以應(yīng)用與線陣CXD檢測實現(xiàn)單根毛細管的熒光檢測，也可以應(yīng)用于面CXD 上實現(xiàn)毛細管陣列的熒光分光處理；(8)方法實現(xiàn)裝置結(jié)構(gòu)簡單，易操作。


圖1是空間校正方法實現(xiàn)示意圖；圖2為水的拉曼光譜圖是水散射的特征拉曼峰；圖3為水的拉曼光譜圖488nm和514. 5nm激光被水散射的特征拉曼峰投影到數(shù)據(jù)采集CXD上；圖4為毛細管陣列拉曼光在CXD上的成像圖；圖5為空間位置定位分析示意圖橫軸為象素數(shù)，縱軸為光譜強度作圖；圖6空間定位分析數(shù)據(jù)； 圖7是光譜校正方法實現(xiàn)示意圖；其中1-激光束，2-毛細管陣列，3-單根毛細管，4-拉曼光，5-拉曼光譜成像(XD， 6-熒光染料。
具體實施例方式現(xiàn)結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明方法作進一步詳細說明。本發(fā)明方法的實現(xiàn)分三步第一步通過空間校正實現(xiàn)毛細管陣列的位置識別；第二步通過光譜校正實現(xiàn)對一根毛細管中的多色熒光染料進行解譜；第三步進行DNA片斷分析。參考圖1，用激光束1照在毛細管束2的檢測窗口處，激光被單根毛細管3的石英或管內(nèi)溶液中的水散射，發(fā)出拉曼光4，通過取光狹縫，光柵分光，透鏡聚焦后成像在CCD 5 上，分析CXD 5上的光譜圖對毛細管束進行位置定位。參考圖7，當熒光染料6通過毛細管3的檢測窗口時被激光束1激發(fā)，熒光光譜經(jīng)過成像裝置成像在線陣(XD5上。1、空間校正空間校正的目的是為了給出每根毛細管在CXD上的成像位置。采用凝膠中水散射激光發(fā)生拉曼散射，測量散射光在C⑶上的成像來確定每根毛細管的位置。用激光照在毛細管上，激光被毛細管凝膠中的水散射，發(fā)出拉曼光，通過取光狹縫，光柵分光，透鏡聚焦后成像在CXD上，分析CXD上的光譜圖確定毛細管位置分布。2、光譜校正用光譜校正對面陣CCD上熒光信號進行解譜的步驟如下。首先我們要知道所用熒光標記物有幾種，設(shè)定為η種。我們讓η種標記熒光分別在面陣CXD上成像，得到這η種熒光在CXD上的光譜分布。為了數(shù)據(jù)處理方便，我們把整個面陣CCD分成若干個小塊(如每14象素X 3象素為一塊)，標記為bin，假定總共用到m個 bin, 一般m >如。這里解釋一下為什么要把CXD上的象素做bin處理如果用光譜校正對面陣CCD上熒光信號進行解譜的步驟如下。首先我們要知道所用熒光標記物有幾種，設(shè)定為η種。我們讓η種標記熒光分別在面陣CXD上成像，得到這η種熒光在CXD上的光譜分布。為了數(shù)據(jù)處理方便，我們把整個面陣CCD分成若干個小塊(如每14象素X 3象素為一塊)，標記為bin，假定總共用到m個 bin, 一般m >如。這里解釋一下為什么要把CXD上的象素做bin處理如果以CCD上的象素為測量單位，建立起來的矩陣會穩(wěn)定性很差，抗干擾能力弱，微小的擾動就可能帶來不可預(yù)知的結(jié)果；當然如果bin選擇的太大，矩陣的穩(wěn)定性會很好，但是分光效果會比較差。故一般選擇在20bin左右，并通過轉(zhuǎn)換矩陣的條件數(shù)來衡量矩陣的抗干擾能力。把每種熒光落在CXD每個bin上的熒光強記錄下來，得到一個mXn的矩陣P。 由于每種標記物被激發(fā)的熒光強度差別很大，為了后期進行信號處理的方便，對矩陣P進行歸一得到矩陣Q= (Qij)mxn0通過Q矩陣我們就可以對所用熒光在CXD上的成像組合進行光譜解譜了。如某時刻從CXD各個bin上采的熒光光強分布為一 mX 1矩陣B，每種熒光的相對強度是一個nX 1 矩陣X，貝IJ :QX = B。進行矩陣變換得到X= (QtQ)^1(QtB)0從上式可以得知，當我們得到了光譜校正矩陣Q后，只要得到任意時刻熒光落在面陣CCD上各個bin的強度分布矩陣B，就可以通過光譜校正得到各種熒光的相對強度分布，從而得到所用熒光的光譜信息。在下面的實驗中可以看出，即使CCD上的熒光光譜重疊非常嚴重，甚至無法判讀出峰位，也可以通過這種方法得到很好的熒光譜圖。3、DNA片段分析進行DNA片斷分析時，對獲得CXD上的每一幀光譜數(shù)據(jù)，首先通過空間校正，區(qū)分出每根毛細管對應(yīng)的光譜數(shù)據(jù)。對每一根毛細管中的光譜數(shù)據(jù)，通過光譜校正矩陣解譜得到每種染料的光譜數(shù)據(jù)。原來分布雜散的光譜分光后得到每種熒光獨立的位置分布，分布位置對應(yīng)光譜波長。對連續(xù)多幀光譜數(shù)據(jù)進行處理獲得DNA片斷信息。盡管通過參照發(fā)明的某些優(yōu)選實施例，已經(jīng)對發(fā)明進行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當理解，可以在形式上和細節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的精神和范圍。
權(quán)利要求
1.一種基于空間校正及光譜校正的毛細管陣列電泳檢測方法，其特征在于，所述方法包括步驟(1)利用拉曼光譜定位毛細管陣列中各毛細管在電荷耦合元件上的成像位置， (2)通過光譜校正對每根毛細管中的多色熒光染料進行解譜，(3)對毛細管陣列電泳的DNA 片斷進行分析。
2.按照權(quán)利要求1所述的基于空間校正及光譜校正的毛細管陣列電泳檢測方法，其特征在于，所述方法步驟(1)包括A.用激光束照射毛細管束發(fā)出拉曼光，B.通過拉曼成像儀成像在電荷耦合元件CXD上，C.分析電荷耦合元件CXD上的光譜圖對毛細管束中各毛細管進行定位。
3.按照權(quán)利要求2所述的基于空間校正及光譜校正的毛細管陣列電泳檢測方法，其特征在于，所述激光束照射毛細管束內(nèi)的溶劑水散射發(fā)出拉曼光，所用激光束為雙激光束，所述雙激光束的波長分別為488nm和514. 5nm。
4.按照權(quán)利要求2所述的基于空間校正及光譜校正的毛細管陣列電泳檢測方法，其特征在于，所述方法步驟C.中以像素數(shù)為橫軸，光譜強度為縱軸得到空間校正譜圖，通過峰識別得到每根毛細管中心位置和每根毛細管之間的有效寬度。
5.按照權(quán)利要求1所述的基于空間校正及光譜校正的毛細管陣列電泳檢測方法，其特征在于，所述方法步驟O)，用激光束照射毛細管，毛細管中熒光染料被激發(fā)產(chǎn)生熒光光譜， 所述熒光光譜經(jīng)過成像裝置成像在電荷耦合元件面陣CCD上，將所用η種熒光標記物分別在所述面陣CCD上成像，得到η種熒光在所述CCD上的光譜分布，將每種熒光落在象素為 mXp面陣CXD每個象素上的熒光強記錄下來，得到mXn的矩陣P，對矩陣P進行歸一得到矩陣Q=，通過Q矩陣對所用熒光在CXD上的成像組合進行光譜解譜，其中n、m、p 均為自然數(shù)。
6.按照權(quán)利要求1所述的基于空間校正及光譜校正的毛細管陣列電泳檢測方法，其特征在于，所述熒光光譜經(jīng)過成像裝置成像在線陣CXD上。
7.按照權(quán)利要求1所述的基于空間校正及光譜校正的毛細管陣列電泳檢測方法，其特征在于，所述方法步驟C3)對所述電荷耦合元件CCD上獲得的每一幀光譜數(shù)據(jù)，通過空間校正，區(qū)分出每根毛細管對應(yīng)的光譜數(shù)據(jù)，對每一根毛細管中的光譜數(shù)據(jù)，通過光譜校正矩陣解譜得到每種染料的光譜數(shù)據(jù)及每種熒光獨立的位置分布，對連續(xù)多幀光譜數(shù)據(jù)進行處理獲得DNA片斷信息。
全文摘要
本發(fā)明提供一種基于空間校正及光譜校正的毛細管陣列電泳檢測方法，所述方法包括步驟(1)利用拉曼光譜定位毛細管陣列中各毛細管在電荷耦合元件上的成像位置，(2)通過光譜校正對每根毛細管中的多色熒光染料進行解譜，(3)對毛細管陣列電泳的DNA片斷進行分析。本發(fā)明采用激光激發(fā)毛細管石英或管中溶劑水的拉曼光譜實現(xiàn)光譜成像，實現(xiàn)了毛細管在CCD上的位置定位和平行度調(diào)整；采用熒光染料組合矩陣實現(xiàn)單個毛細管中多色熒光染料的同時檢測，采用象素組合的方式提高分布矩陣的穩(wěn)定性，減少計算量，提高檢測的穩(wěn)定性；方法實現(xiàn)裝置結(jié)構(gòu)簡單，易操作。
文檔編號G01N21/64GK102411024SQ201110160549
公開日2012年4月11日 申請日期2011年6月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月15日
發(fā)明者張濤, 李彬, 賈二惠, 趙怡鶴, 陳學(xué)亮 申請人:公安部第一研究所, 北京中盾安民分析技術(shù)有限公司