專利名稱：一種甲型副傷寒沙門菌脈沖場(chǎng)凝膠電泳方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種凝膠電泳方法，具體涉及一種用于甲型副傷寒沙門菌的脈沖場(chǎng)凝膠電泳方法。
背景技術(shù)：
甲型副傷寒沙門菌(S. paratyphi Α)的潛伏期長(zhǎng)，一般為8-10天。當(dāng)發(fā)生一起甲型副傷寒沙門菌的暴發(fā)時(shí)，追蹤溯源是很困難的。如果脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)分型方法的區(qū)分能力不強(qiáng)，就加大了追蹤溯源的難度。因此發(fā)展適用性強(qiáng)的甲型副傷寒沙門菌的PFGE 方法是非常必要的。以前有研究已經(jīng)證明許多因素可以影響PFGE的結(jié)果，如膠塊的制備，細(xì)胞的裂解，膠塊的水洗時(shí)間，限制性內(nèi)切酶和電泳參數(shù)等，但其中最重要的因素是酶和參數(shù)的選擇。菌株之間的親緣關(guān)系的判斷是根據(jù)比較酶切片段帶型的能力。一種合適的酶應(yīng)當(dāng)有最合適的片段數(shù)目和足夠的流行病學(xué)相關(guān)區(qū)分能力。電泳參數(shù)(包括脈沖時(shí)間和總電泳時(shí)間)直接影響酶切片段在電泳膠中的分布。當(dāng)一株甲型副傷寒沙門菌染色體DNA用同一種酶酶切后，其所得的限制性片段是固定的，不同菌株之間限制性片段的差異就是固定的，但不同的電泳參數(shù)對(duì)他們這種固有差異的表現(xiàn)能力不同。因此當(dāng)電泳參數(shù)發(fā)生改變時(shí)，原位置相似的條帶在新的膠中的相對(duì)位置差別可能會(huì)加大，從而顯示出差異，因而不同的電泳參數(shù)會(huì)顯示出不同的菌株區(qū)分能力。目前，國際上的甲型副傷寒沙門菌的PFGE實(shí)驗(yàn)方案是根據(jù)PulseNet的標(biāo)準(zhǔn)化方案，但它是針對(duì)沙門菌屬的非傷寒沙門菌血清型，而不是針對(duì)甲型副傷寒沙門菌的。該非傷寒沙門菌PFGE標(biāo)準(zhǔn)化方案中將)(ba I作為了首選酶，Bin I次選酶，Spe I第三種酶；用 Xba I和SpeI酶切的電泳參數(shù)都是脈沖時(shí)間為2. 2-63. 8s，18-19h。以往有研究者應(yīng)用這種標(biāo)準(zhǔn)化方案分析甲型副傷寒沙門菌時(shí)面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，只能將甲型副傷寒分離株分出有限的型別S. Paratyphi A isolates had limited genetic diversity (Goh, Puthucheary et al.2002 ；Li, Cui et al. 2006)。因此提示有可能是這種標(biāo)準(zhǔn)化方案不適合甲型副傷寒沙門菌。這種標(biāo)準(zhǔn)化方案在分析甲型副傷寒沙門菌時(shí)分型能力不夠強(qiáng)，不能有效將流行株和非流行株區(qū)分開，當(dāng)甲型副傷寒暴發(fā)時(shí)很難開展病原的分子溯源工作。因此這種標(biāo)準(zhǔn)化方案不適合甲型副傷寒沙門菌。本發(fā)明在上述背景下，提出一種適合于甲型副傷寒沙門菌的PFGE方案，使其對(duì)甲型副傷寒沙門菌具有更強(qiáng)的分型區(qū)分能力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種甲型副傷寒沙門菌脈沖場(chǎng)凝膠電泳方法，對(duì)于甲型副傷寒沙門菌具有更強(qiáng)的分型區(qū)分能力。本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的提供一種甲型副傷寒沙門菌脈沖場(chǎng)凝膠電泳方法，以經(jīng)分離并培養(yǎng)得到的甲型副傷寒沙門菌為分析樣品，依次進(jìn)行以下各步驟膠塊制備、細(xì)胞裂解、洗膠塊、膠塊內(nèi)DNA的酶切、加樣和電泳；所述的膠塊制備、細(xì)胞裂解、洗膠塊和加樣步驟都按照常規(guī)脈沖場(chǎng)凝膠電泳方法進(jìn)行；其特征在于所述的膠塊內(nèi)DNA的酶切是以Spe I作為首選酶，Xba I作為次選酶，》ιοΙ作為第三種酶；所述的電泳參數(shù)中，Spe I酶對(duì)應(yīng)的脈沖時(shí)間為l-20s，總電泳時(shí)間為19-20h ；Xba I酶對(duì)應(yīng)的脈沖時(shí)間為1. 549s，總電泳時(shí)間為19_20h ；Xho I酶對(duì)應(yīng)的脈沖時(shí)間為2. 249s，總電泳時(shí)間為19-20h。所述的甲型副傷寒沙門菌脈沖場(chǎng)凝膠電泳方法可以按照以下幾種方式進(jìn)行方法一包括1-3次單獨(dú)的脈沖場(chǎng)凝膠電泳過程，即將分離并培養(yǎng)得到的甲型副傷寒沙門菌樣品依次采用所述的首選酶及其相應(yīng)的電泳參數(shù)、所述的次選酶及其相應(yīng)電泳參數(shù)和/或第三種酶及其相應(yīng)電泳參數(shù)，按照所述各步驟(膠塊制備、細(xì)胞裂解、洗膠塊、膠塊內(nèi)DNA的酶切、加樣和電泳)分別處理1-3遍。即，以分離和培養(yǎng)得到的相同批次的菌株為分析樣品，先用所述首選酶及其相應(yīng)的電泳參數(shù)，按照所述的各步驟將分析樣品做脈沖場(chǎng)凝膠電泳處理；如果得到的帶型數(shù)目足夠多，能將流行株和非流行株很好的區(qū)分開，分辨率較高，能獲得理想的分子分型，即結(jié)束電泳；如果得到的帶型數(shù)目較少，同一帶型包含的菌株數(shù)目較多，分辨率較低，不能很好的區(qū)分流行株和非流行株時(shí)，則啟用所述的次選酶及其相應(yīng)的電泳參數(shù)，按照所述的各步驟將分析樣品再做脈沖場(chǎng)凝膠電泳處理一遍；如果次選酶及其相應(yīng)的電泳參數(shù)得到的分子型別分辨率較高時(shí)，即結(jié)束電泳；如果依然不能滿足分子溯源的需要，就再啟用所述的第三種酶及其相應(yīng)電泳參數(shù)，按照所述的各步驟將分析樣品做脈沖場(chǎng)凝膠電泳處理。通常情況下，啟用次選酶及其相應(yīng)電泳參數(shù)處理后，得到的帶型數(shù)目就足夠多了。方法二由2-3個(gè)連續(xù)的脈沖場(chǎng)凝膠電泳過程組成，即以分離并培養(yǎng)得到的甲型副傷寒沙門菌為樣品，依次采用所述的首選酶及其相應(yīng)的電泳參數(shù)、所述的次選酶及其相應(yīng)電泳參數(shù)和/或所述的第三種酶及其相應(yīng)電泳參數(shù)中的兩種或三種，按照上述各步驟 (膠塊制備、細(xì)胞裂解、洗膠塊、膠塊內(nèi)DNA的酶切、加樣和電泳)進(jìn)行連續(xù)處理。具體包括以下步驟1)用所述的首選酶及其相應(yīng)的電泳參數(shù)，按照所述的各步驟將分析樣品做脈沖場(chǎng)凝膠電泳處理；2)用所述的次選酶及其相應(yīng)的電泳參數(shù)，將經(jīng)過步驟1)處理后得到的膠塊進(jìn)行所述的洗膠塊、膠塊內(nèi)DNA的酶切、加樣和電泳處理；禾口/ 或3)采用所述的第三種酶及其相應(yīng)電泳參數(shù)將經(jīng)過步驟2)處理后得到的膠塊進(jìn)行所述的洗膠塊、膠塊內(nèi)DNA的酶切、加樣和電泳處理。本發(fā)明還提供所述甲型副傷寒沙門菌脈沖場(chǎng)凝膠電泳方法在甲型副傷寒沙門菌分型或基因組變異檢測(cè)中的應(yīng)用。將上述首選酶、次選酶和/或第三種酶及其相應(yīng)的參數(shù)電泳后的結(jié)果組合應(yīng)用， 用BioNumerics軟件分析，以UPGMA方法聚類，按100%相似性系數(shù)可以分成的亞帶型明顯增多，分辨率比單一酶的要高，這將有助于為流行病學(xué)調(diào)查提供更可靠的實(shí)驗(yàn)室證據(jù)。本發(fā)明中，作為分析樣品的甲型副傷寒沙門菌可以按照常規(guī)方法從疑似病例的血、骨髓、糞便樣本或污染的水、食品中分離得到。所述的分離方法在諸多公開出版物上都有記載，例如人民衛(wèi)生出版社2006年出版的《傷寒、副傷寒防治手冊(cè)》(第二版)45-55頁。 將分離得到的甲型副傷寒沙門菌按照常規(guī)的細(xì)菌培養(yǎng)方法培養(yǎng)后，即可作為本發(fā)明脈沖場(chǎng)凝膠電泳方法的分析樣品。本發(fā)明從酶的選擇和電泳參數(shù)兩方面優(yōu)化了現(xiàn)有技術(shù)中的標(biāo)準(zhǔn)化的非傷寒沙門菌PFGE標(biāo)準(zhǔn)化方案，使其成為一種適用于甲型副傷寒沙門菌的PFGE的最佳方案。與現(xiàn)有技術(shù)中的非傷寒沙門菌PFGE標(biāo)準(zhǔn)化方案相比，本發(fā)明方法對(duì)甲型副傷寒沙門菌的區(qū)分能力顯著提高。這對(duì)于甲型副傷寒疫情暴發(fā)時(shí)病原的追蹤溯源，以及指導(dǎo)后續(xù)的防控來說無疑是具有重大意義的進(jìn)步。


圖1是實(shí)施例1中，通用分子量標(biāo)準(zhǔn)株H9812與表4中的S. paratyphi AGXS04-1876和GZ9A06198以本發(fā)明的電泳方法的首選酶為內(nèi)切酶，分別用本發(fā)明和 PulseNet標(biāo)準(zhǔn)化方案的電泳參數(shù)處理得到的電泳圖。圖2是實(shí)施例2的第二次PFGE中，通用分子量標(biāo)準(zhǔn)株H9812與表4中的 S. paratyphi A GXS04-1876和GZ9A06198以本發(fā)明的電泳方法的次選酶為內(nèi)切酶，分別用本發(fā)明和PulseNet標(biāo)準(zhǔn)化方案的電泳參數(shù)處理得到的電泳圖。圖3是實(shí)施例3的第三次PFGE中，通用分子量標(biāo)準(zhǔn)株H9812與表4中的 S. paratyphi A GXS04-1876和GZ9A06198以本發(fā)明的電泳方法的第三種酶為內(nèi)切酶，分別用本發(fā)明和PulseNet標(biāo)準(zhǔn)化方案的電泳參數(shù)處理得到的電泳圖。圖4是實(shí)施例5中，表7中的甲型副傷寒沙門菌應(yīng)用實(shí)施例2的方法進(jìn)行第一次 PFGE得到的聚類圖。圖5是實(shí)施例5中，表7中的甲型副傷寒沙門菌應(yīng)用實(shí)施例2的方法進(jìn)行第二次 PFGE得到的聚類圖。圖6是實(shí)施例5中的表7中的甲型副傷寒沙門菌應(yīng)用PulseNet標(biāo)準(zhǔn)化方案的首選酶OCba I)及其電泳參數(shù)(2.2-63.8s，19h)處理得到的聚類圖。
具體實(shí)施例方式以下通過具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容進(jìn)行詳細(xì)說明。其中所使用的普通化學(xué)試劑和儀器均為現(xiàn)有的市售產(chǎn)品，或按照公知的PFGE標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程配制；所用到的通用分子量標(biāo)準(zhǔn)株H9812可購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所或中國疾病預(yù)防控制中心傳染病控制所PulseNet網(wǎng)絡(luò)中心實(shí)驗(yàn)室；所用的限制性內(nèi)切酶及其配套緩沖液均購自寶生物工程(大連)有限公司；所用的甲型副傷寒沙門菌樣品是按照人民衛(wèi)生出版社2006年出版的《傷寒、副傷寒防治手冊(cè)》(第二版)45-55頁記載的方法分離得到并經(jīng)血清型確認(rèn)的，基本信息如下表 4 表4實(shí)施例所用樣品菌株的相關(guān)信息
權(quán)利要求
1.一種甲型副傷寒沙門菌脈沖場(chǎng)凝膠電泳方法，以經(jīng)分離并培養(yǎng)得到的甲型副傷寒沙門菌為分析樣品，依次進(jìn)行以下各步驟膠塊制備、細(xì)胞裂解、洗膠塊、膠塊內(nèi)DNA的酶切、 加樣和電泳；所述的膠塊制備、細(xì)胞裂解、洗膠塊和加樣步驟都按照常規(guī)脈沖場(chǎng)凝膠電泳方法進(jìn)行；其特征在于所述的膠塊內(nèi)DNA的酶切是以Spe I作為首選酶，)(ba I作為次選酶， XhoI作為第三種酶；所述的電泳參數(shù)中，Spe I酶對(duì)應(yīng)的脈沖時(shí)間為l-20s，總電泳時(shí)間為 19-20h ；Xba I酶對(duì)應(yīng)的脈沖時(shí)間為1. 5-29s,總電泳時(shí)間為19_20h ；Xho I酶對(duì)應(yīng)的脈沖時(shí)間為2. 249s，總電泳時(shí)間為19-20h。
2.權(quán)利要求1所述的甲型副傷寒沙門菌脈沖場(chǎng)凝膠電泳方法，其特征在于所述的方法包括1-3次單獨(dú)的脈沖場(chǎng)凝膠電泳過程，即將分離并培養(yǎng)得到的甲型副傷寒沙門菌樣品依次采用所述的首選酶及其相應(yīng)的電泳參數(shù)、所述的次選酶及其相應(yīng)電泳參數(shù)和/或第三種酶及其相應(yīng)電泳參數(shù)，按照所述各步驟分別處理1-3遍。
3.權(quán)利要求1所述的甲型副傷寒沙門菌脈沖場(chǎng)凝膠電泳方法，其特征在于，以分離和培養(yǎng)得到的相同批次的菌株為分析樣品，包括以下步驟1)用所述的首選酶及其相應(yīng)的電泳參數(shù)，按照所述的各步驟將分析樣品做脈沖場(chǎng)凝膠電泳處理；2)用所述的次選酶及其相應(yīng)的電泳參數(shù)，按照所述的各步驟將分析樣品做脈沖場(chǎng)凝膠電泳處理。
4.權(quán)利要求1所述的甲型副傷寒沙門菌脈沖場(chǎng)凝膠電泳方法，其特征在于，以分離和培養(yǎng)得到的相同批次的菌株為分析樣品，包括以下步驟1)用所述的首選酶及其相應(yīng)的電泳參數(shù)，按照所述的各步驟將分析樣品做脈沖場(chǎng)凝膠電泳處理；2)用所述的次選酶及其相應(yīng)的電泳參數(shù)，按照所述的各步驟將分析樣品做脈沖場(chǎng)凝膠電泳處理；3)用所述的第三種酶及其相應(yīng)電泳參數(shù)，按照所述的各步驟將分析樣品做脈沖場(chǎng)凝膠電泳處理。
5.權(quán)利要求1所述的甲型副傷寒沙門菌脈沖場(chǎng)凝膠電泳方法，其特征在于所述的方法是由2-3個(gè)連續(xù)的脈沖場(chǎng)凝膠電泳過程組成，即以分離并培養(yǎng)得到的甲型副傷寒沙門菌為樣品，依次采用所述的首選酶及其相應(yīng)的電泳參數(shù)、所述的次選酶及其相應(yīng)電泳參數(shù)和/ 或所述的第三種酶及其相應(yīng)電泳參數(shù)中的兩種或三種，按照所述各步驟進(jìn)行連續(xù)處理。
6.權(quán)利要求1所述的甲型副傷寒沙門菌脈沖場(chǎng)凝膠電泳方法，其特征在于，包括以下步驟1)用所述的首選酶及其相應(yīng)的電泳參數(shù)，按照所述的各步驟將分析樣品做脈沖場(chǎng)凝膠電泳處理；2)用所述的次選酶及其相應(yīng)的電泳參數(shù)，將經(jīng)過步驟1)處理后得到的膠塊進(jìn)行所述的洗膠塊、膠塊內(nèi)DNA的酶切、加樣和電泳處理。
7.權(quán)利要求6所述的甲型副傷寒沙門菌脈沖場(chǎng)凝膠電泳方法，其特征在于進(jìn)一步采用所述的第三種酶及其相應(yīng)電泳參數(shù)將經(jīng)過步驟幻處理后得到的膠塊進(jìn)行所述的洗膠塊、膠塊內(nèi)DNA的酶切、加樣和電泳處理。
8.權(quán)利要求1所述的甲型副傷寒沙門菌脈沖場(chǎng)凝膠電泳方法，其特征在于，具體包括以下步驟[1].膠塊的制備[1.1]在試管內(nèi)加入aiil CSB，用CSB濕潤接種環(huán)，將事先分離和培養(yǎng)好的甲型副傷寒沙門菌樣品均勻懸濁于CSB中，測(cè)其OD值，并調(diào)整至3. 6 4. 5 ；[1. 2]取400 μ 1步驟[1. 1]得到的細(xì)菌懸濁液于1. 5ml試管中，置于37°C水浴中孵育 5分鐘；[1. 3]從水浴中取出步驟[1. 2]得到的試管，加入20μ 1儲(chǔ)存液濃度為20mg/ml的蛋白酶K混勻，使其終濃度為0. 5mg/ml ；[1.4]在由TE和10%十二烷基硫酸鈉按9 1的體積比配制成的溶液中加入凝膠強(qiáng)度> 1800g/cm2的瓊脂糖，配制成的凝膠溶液，瓊脂糖加入比例為每IOOml溶液中加入 Ig瓊脂糖；將配制好的凝膠溶液放于56°C水浴箱中；[1. 5]在步驟[1. 3]得到的試管中加入400 μ 1步驟[1. 4]制備的的凝膠溶液，混勻； [1.6]將步驟[1.5]得到的混合物加入成膠模具，避免氣泡產(chǎn)生，在室溫下凝固10-15 分鐘，得到膠塊；[2],細(xì)胞的裂解[2. 1]配制CLB 每5ml細(xì)胞裂解液加入25 μ 1的20mg/ml的蛋白酶K，使其終濃度為 0. lmg/ml，然后顛倒混勻；蛋白酶K要置于冰上，配制好的細(xì)胞CLB也要置于冰上備用； [2. 2]將5ml步驟[2. 1]配制的蛋白酶K/CLB混合液加入50ml的螺旋蓋試管中； [2. 3]將步驟[1. 6]得到的膠塊放入步驟[2. 2]得到的試管中，用刀片削去模具表面多余的膠，保證膠塊在液面下而不在管壁上，做好標(biāo)記；[2. 4]將步驟[2. 3]得到的試管放在水浴搖床中孵育2小時(shí)，轉(zhuǎn)速170轉(zhuǎn)/分鐘； [2. 5]將純水和TE放在50°C水浴搖床中預(yù)熱；[3],洗膠塊[3. 1]從步驟[2. 4]的水浴搖床中拿出螺旋蓋試管，蓋上濾篩蓋，倒掉CLB ；每管中加入 15ml步驟[2. 5]預(yù)熱的純水，確保膠塊在液面下，放回水浴搖床中，搖10分鐘；水浴結(jié)束后將試管中的水倒掉，用步驟[2. 5]預(yù)熱的純水將膠再洗一次；[3. 2]將步驟[3. 1]得到的試管中的水倒掉，加入15ml步驟[2. 5]預(yù)熱到50°C的TE, 在的水浴搖床中搖15分鐘；倒掉TE，再用步驟[2. 5]預(yù)熱的TE重復(fù)洗三次，每次10 15分鐘；倒掉TE，加入IOml TE，放在4°C冰箱保存?zhèn)溆?；[4],膠塊內(nèi)DNA的酶切[4. 1]按照表1中的比例配制分別與所述的首選酶、次選酶和/或第三種酶配套的緩沖液的稀釋液，混勻置于冰上表1.緩沖液的稀釋液的配制比例試劑μ 1/膠塊μ 1/10膠塊純水180 μ 11800 μ 1配套緩沖液20 μ 1200 μ 1總體積200 μ 12000 μ 13[4. 2]在1. 5ml試管中加入200 μ 1步驟[4. 1]配制的緩沖液的稀釋液； [4. 3]將步驟[3. 2]得到的樣品膠塊放在干凈的培養(yǎng)皿上，分別用刀片切成2mm寬的膠塊，放入步驟[4. 2]中加入了稀釋液的相應(yīng)試管中，確保膠塊在液面下面，將試管放在37°C 水浴中孵育10-15分鐘，得到待酶切膠塊；[4. 4]將所述的首選酶、次選酶和/或第三種酶按照表2的比例配制酶切緩沖液，混勻置于冰上備用表2.酶切緩沖液的配制比例
9.權(quán)利要求8所述的甲型副傷寒沙門菌脈沖場(chǎng)凝膠電泳方法，其特征在于，進(jìn)一步包括A)按照所述步驟[1.1]至步驟[4. 3]的方法得到待酶切膠塊，在每個(gè)放膠塊的試管中加入200 μ 1步驟[4. 4]配制的次選酶的酶混合液，確保膠塊在液面的下面；在37°C水浴中孵育2 4小時(shí)，然后按照步驟[5]至步驟W]的方法處理；或者B)將步驟[6.3]處理后得到的膠塊洗去所述的首選酶的酶混合液，放入加有200 μ 1 步驟[4. 1]配制的與次選酶相配套的緩沖液的稀釋液的1. 5ml試管中，確保膠塊在液面下面，將試管放在37°C水浴中孵育10-15分鐘，得到待酶切膠塊，在每個(gè)放膠塊的試管中加入 200 μ 1步驟[4. 4]配制的次選酶的酶混合液，確保膠塊在液面的下面；在37°C水浴中孵育 2 4小時(shí)，然后按照步驟[5]至步驟W]的方法處理。
10.權(quán)利要求1所述的甲型副傷寒沙門菌脈沖場(chǎng)凝膠電泳方法在甲型副傷寒沙門菌分型或基因組變異檢測(cè)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種甲型副傷寒沙門菌脈沖場(chǎng)凝膠電泳方法，以經(jīng)分離得到的甲型副傷寒沙門菌為分析樣品，依次進(jìn)行以下各步驟膠塊制備、細(xì)胞裂解、洗膠塊、膠塊內(nèi)DNA的酶切、加樣和電泳；其中，所述的膠塊制備、細(xì)胞裂解、洗膠塊和加樣步驟都按照常規(guī)脈沖場(chǎng)凝膠電泳方法進(jìn)行；所述的膠塊內(nèi)DNA的酶切是以Spe I作為首選酶，Xba I作為次選酶，Xho I作為第三種酶；所述的電泳參數(shù)中，Spe I酶對(duì)應(yīng)的脈沖時(shí)間為1-20s，19-20h；Xba I酶對(duì)應(yīng)的脈沖時(shí)間為1.5-29s，19-20h；Xho I酶對(duì)應(yīng)的脈沖時(shí)間為2.2-29s，19-20h。本發(fā)明的方法對(duì)甲型副傷寒沙門菌的分辨率相對(duì)現(xiàn)有技術(shù)顯著提高，能夠有效的應(yīng)用于甲型副傷寒沙門菌的分子分型或基因組變異的檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N27/447GK102305823SQ201110137040
公開日2012年1月4日 申請(qǐng)日期2011年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月25日
發(fā)明者姚李四, 張曉龍, 徐寶梁, 李新, 李海山, 楊宇, 王艷, 胡群, 陳春霞, 韓輝 申請(qǐng)人:中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院