專利名稱：一種亞單位流感疫苗中裂解劑含量的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種亞單位流感疫苗中裂解劑的檢測方法，特別是使用高效液相色譜檢測方法。
背景技術(shù)：
壬苯醇醚-9是一種非離子型表面活性劑，其化學(xué)名稱為NonylphenylPolyethylene Glycol Ether。在亞單位流感疫苗生產(chǎn)過程中，需加入裂解劑壬苯醇醚-9，對全病毒進(jìn)行裂解，再經(jīng)純化，得到亞單位疫苗。由于非離子性表面活性劑對細(xì)胞膜的侵害性，因此疫苗中的裂解劑殘留量必須嚴(yán)格控制在一定的安全限量標(biāo)準(zhǔn)之內(nèi)。以往國內(nèi)報(bào)道過比色法測定裂解劑的方法，但是此方法受方法學(xué)限制，不是直接反映裂解劑含量，具有一定誤差。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種亞單位流感疫苗中壬苯醇醚-9的檢測方法，該方法包括以下步驟(I)待檢亞單位流感疫苗樣品的處理，(2)HPLC檢測得到標(biāo)準(zhǔn)品壬苯醇醚-9的標(biāo)準(zhǔn)曲線，(3)處理后的待檢亞單位流感疫苗樣品的HPLC檢測，(4)計(jì)算亞單位流感疫苗中壬苯醇醚-9的含量；其中步驟(I)和步驟⑵之間，以及步驟⑵和步驟⑶之間的順序可以互換；其特征在于，HPLC檢測采用的色譜柱是C4柱。本發(fā)明的檢測方法，其特征在于HPLC檢測采用的色譜柱是ThermoBioBasic_4C4柱。本發(fā)明的檢測方法，其特征在于步驟(I)的待檢亞單位流感疫苗樣品的處理方法為用4倍體積的甲醇沉淀后上清液作為待測樣品。本發(fā)明的檢測方法，其特征在于HPLC檢測時(shí)的紫外檢測器的波長為275nm。本發(fā)明的的檢測方法，其特征在于HPLC檢測時(shí)采用體積比為80 20的甲醇/水作為流動相，流速lml/min。本發(fā)明的檢測方法，其特征在于步驟I的沉淀溫度為-20°C 65°C。本發(fā)明的檢測方法，其特征在于步驟I的沉淀溫度為37°C。本發(fā)明的檢測方法，其特征在于HPLC檢測時(shí)的柱溫為22 37°C。本發(fā)明的檢測方法，其特征在于HPLC檢測時(shí)的柱溫為33°C。優(yōu)選的本發(fā)明的檢測方法，該方法包括以下步驟(I)待檢亞單位流感疫苗樣品的處理取待檢亞單位流感疫苗樣品200 iil，加入800 ill甲醇，劇烈震蕩30sec，37°C 30min, 14000rpm離心20min,吸取上清,0. 45um濾膜過濾,得到測試液；
(2)HPLC檢測得到標(biāo)準(zhǔn)品壬苯醇醚-9的標(biāo)準(zhǔn)曲線精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品壬苯醇醚-9250 u g，用體積比為4 I的甲醇/水溶解定容至100ml,即得2500 u g/ml壬苯醇醚_9溶液,依次稀釋定容為1000 u g/ml、50 u g/ml、50 u g/ml、25 u g/ml>5 u g/ml,按樣品處理方法處理后HPLC測定，以壬苯醇醚_9濃度對峰面積制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；(3)處理后的待檢亞單位流感疫苗樣品的HPLC檢測步驟I得到的測試液用和制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的同樣條件進(jìn)行HPLC測定，得到色譜圖；(4)計(jì)算亞單位流感疫苗中壬苯醇醚-9的含量
其中HPLC 的色譜條件為色譜柱Thermo BioBasic_4C4 柱,4. 6mmX 150mm, 5 u m,定量環(huán)20iU，流動相體積比為80 20的甲醇7jC，流速lml/min，紫外檢測器檢測波長275nm，柱溫33°C，上樣量100u I0本發(fā)明的檢測方法，是根據(jù)以下實(shí)驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)的，I.材料與方法I. I儀器和藥品Hitachi L-2000高效液相色譜儀，L-2400紫外檢測器，L-2130泵，EZSTART色譜工作站；Mettler Toledo AL 204 電子天平；Beckman Coulter Microfuge 22R 臺式高速離心機(jī)。裂解劑標(biāo)準(zhǔn)品壬苯醇醚-9 ;甲醇為色譜純；水為Milli-Q(Millipore)超純水機(jī)制備，電阻率18. 2MQ cm。I. 2色譜條件色譜柱ThermoBioBasic_4C4 柱(4. 6mmX 150mm, 5 u m),定量環(huán)20ul,流動相甲醇7jC (80 20, v/v)，流速紫外檢測器檢測波長275nm，柱溫:33°C，上樣量IOOul。I. 3亞單位流感疫苗處理方法取亞單位流感疫苗200ul，加入800ul甲醇，劇烈震蕩30sec，37°C 30min, 14000rpm離心20min,吸取上清,0. 45um濾膜過濾，HPLC分析。I. 4專屬性實(shí)驗(yàn)取滅活流感病毒提取液，不加裂解劑，超聲20min后按I. 3方法處理后HPLC測定。I 5標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品250iig，用甲醇/水(4 : 1，v/v)溶解定容至100ml，即得2500 V- g/ml 壬苯醇醚-9 溶液，依次稀釋定容為 1000 u g/ml, 250 u g/ml, 50 u g/ml, 25 u g/ml, 5 u g/ml,按樣品處理方法處理后HPLC測定，以壬苯醇醚_9濃度對峰面積制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。I. 6回收率測定I. 6. I壬苯醇醚-9在全病毒提取液中的回收率取滅活流感病毒提取液，加入壬苯醇醚-9PB溶液，使終濃度達(dá)6000 U g/ml，混勻，40C 16小時(shí)(過夜)，依次進(jìn)行5倍，25倍稀釋，三個(gè)濃度分別按I. 3方法處理后測定回收率。I. 6. 2壬苯醇醚-9在亞單位流感疫苗中的回收率
取亞單位流感疫苗，加入一定量壬苯醇醚_9，按I. 3方法處理后測定回收率。I. 7精密度測定I. 7. I日內(nèi)精密度取各濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液和亞單位流感疫苗連續(xù)進(jìn)樣五針，以峰面積計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD% )0I. 7. 2日間精密度取各濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液和亞單位流感疫苗連續(xù)五天進(jìn)樣，以峰面積計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD % )。I. 8檢測限和定量限
以十倍信噪比為最低檢測限，以日內(nèi)精密度和日間精密度均小于3%為定量限。2.結(jié)果2. I色譜譜圖250 u g/ml壬苯醇醚_9甲醇/水標(biāo)準(zhǔn)品溶液保留時(shí)間(RT)為3. 300min,理論塔板數(shù)為2702，譜圖見圖I。專屬性實(shí)驗(yàn)譜圖見圖2?；厥章蕼y定I中5倍稀釋病毒裂解液保留時(shí)間(RT)為3. 307min,理論塔板數(shù)為2314，譜圖見圖3。回收率測定2中壬苯醇醚-9，亞單位流感疫苗及壬苯醇醚-9加亞單位流感疫苗的譜圖分別見圖4，圖5，圖6，亞單位流感疫苗中的保留時(shí)間(RT)為3. 280min，理論塔板數(shù)為2524。2. 2專屬性實(shí)驗(yàn)由譜圖可知，在壬苯醇醚-9出峰時(shí)間內(nèi)，經(jīng)過甲醇沉淀處理的滅活全病毒提取液幾乎無吸收。2. 3標(biāo)準(zhǔn)曲線制備標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖7，強(qiáng)制過原點(diǎn)下，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y = 0. 000099066x,r2 = 0. 9999，在5 ii g/ml 2500 ii g/ml范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。2. 4回收率測定壬苯醇醚-9在全病毒提取液中的回收率見表I。壬苯醇醚-9在亞單位流感疫苗中的回收率見表2。2. 5精密度測定2. 5. I日內(nèi)精密度日內(nèi)精密度見表3。2. 5. 2日間精密度日間精密度見表4。2. 6檢測限和定量限5 U g/ml標(biāo)準(zhǔn)品溶液的信噪比約為10，日內(nèi)精密度和日間精密度均小于3%，本方法的檢測限和定量限定為5 y g/ml。表I壬苯醇醚9在全病毒提取液中的回收率(n = 5)
權(quán)利要求
1.一種亞單位流感疫苗中壬苯醇醚-9的檢測方法，該方法包括以下步驟 (1)待檢亞單位流感疫苗樣品的處理， (2)HPLC檢測得到標(biāo)準(zhǔn)品壬苯醇醚-9的標(biāo)準(zhǔn)曲線， (3)處理后的待檢亞單位流感疫苗樣品的HPLC檢測， (4)計(jì)算亞單位流感疫苗中壬苯醇醚-9的含量； 其中步驟⑴和步驟⑵之間，以及步驟⑵和步驟⑶之間的順序可以互換； 其特征在于，HPLC檢測采用的色譜柱是C4柱。
2.如權(quán)利要求I的檢測方法，其特征在于HPLC檢測采用的色譜柱是ThermoBi oBas i c-4C4 柱。
3.如權(quán)利要求2的檢測方法，其特征在于步驟(I)的待檢亞單位流感疫苗樣品的處理方法為用4倍體積的甲醇沉淀后上清液作為待測樣品。
4.如權(quán)利要求2的檢測方法，其特征在于HPLC檢測時(shí)的紫外檢測器的波長為275nm。
5.如權(quán)利要求3或4的檢測方法，其特征在于HPLC檢測時(shí)采用體積比為80 20的甲醇/水作為流動相，流速lml/min。
6.如權(quán)利要求5的檢測方法，其特征在于步驟I的沉淀溫度為_20°C 65°C。
7.如權(quán)利要求6的檢測方法，其特征在于步驟I的沉淀溫度為37°C。
8.如權(quán)利要求7的檢測方法，其特征在于HPLC檢測時(shí)的柱溫為22 37°C。
9.如權(quán)利要求8的檢測方法，其特征在于HPLC檢測時(shí)的柱溫為33°C。
10.如權(quán)利要求9的檢測方法，該方法包括以下步驟 (1)待檢亞單位流感疫苗樣品的處理 取待檢亞單位流感疫苗樣品200iU，加入800 ill甲醇，劇烈震蕩30sec，37°C 30min,.14000rpm離心20min，吸取上清，0. 45um濾膜過濾，得到測試液； (2)HPLC檢測得到標(biāo)準(zhǔn)品壬苯醇醚-9的標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品壬苯醇醚-9250 u g，用體積比為4 I的甲醇/水溶解定容至100ml，即得2500 u g/ml壬苯醇醚_9溶液，依次稀釋定容為1000 u g/ml、50 u g/ml、50 u g/ml、.25 u g/ml>5 u g/ml,按樣品處理方法處理后HPLC測定，以壬苯醇醚_9濃度對峰面積制作標(biāo)準(zhǔn)曲線； (3)處理后的待檢亞單位流感疫苗樣品的HPLC檢測 步驟I得到的測試液用和制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的同樣條件進(jìn)行HPLC測定，得到色譜圖； (4)計(jì)算亞單位流感疫苗中壬苯醇醚-9的含量 其中 HPLC 的色譜條件為色譜柱Thermo BioBasic_4C4 柱，4. 6mmX 150mm, 5 u m,定量環(huán)20iU，流動相體積比為80 20的甲醇水，流速lml/min，紫外檢測器檢測波長275nm，柱溫33°C，上樣量100u I0
全文摘要
本發(fā)明涉及一種亞單位流感疫苗中裂解劑含量的檢測方法，該方法包括以下步驟(1)待檢亞單位流感疫苗樣品的處理，(2)HPLC檢測得到標(biāo)準(zhǔn)品壬苯醇醚-9的標(biāo)準(zhǔn)曲線，(3)處理后的待檢亞單位流感疫苗樣品的HPLC檢測，(4)計(jì)算亞單位流感疫苗中壬苯醇醚-9的含量。
文檔編號G01N30/88GK102749408SQ20111010110
公開日2012年10月24日 申請日期2011年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月21日
發(fā)明者張艷, 李小強(qiáng), 楊江山, 田文莉 申請人:天士力金納生物技術(shù)(天津)有限公司