專利名稱：一種大葉藻胚石蠟切片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種石蠟切片的制作方法，尤其涉及一種大葉藻胚的石蠟切片制作方法。
背景技術(shù)：
大葉藻(Zostera marina L.)俗稱海帶草，是海洋高等種子植物，屬于被子植物 門(Angiospermae)，單子葉植物綱(Monocotyledoneae，或稱百合綱Liliopsida)，澤瀉目 (Alismales)，眼子菜科(Potamogetonaceae)，大葉藻屬(Zostera L.)，大葉藻能夠在海洋 中進(jìn)行沉水生活，和陸地的高等植物一樣能進(jìn)行光合作用，用種子來(lái)繁殖后代。為適應(yīng)海洋 沉水環(huán)境，大葉藻種子植物的內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)與陸生種子植物具有較大差異，比如細(xì)胞膜上 有強(qiáng)大的Na、K泵結(jié)構(gòu)，表皮細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞壁較厚，水分不易被完全置換，細(xì)胞具有高 滲透壓，水分含量高等差別。正因?yàn)榇笕~藻種子與陸生種子存在上述差別，而現(xiàn)有石蠟切片 方法主要用于陸生植物，利用現(xiàn)有的石蠟切片方法獲得的大葉藻胚石蠟切片染色不清晰， 組織結(jié)構(gòu)不完整。究其原因，現(xiàn)有石蠟切片方法制作的大葉藻胚石蠟切片固定時(shí)間短，組織 容易變形；脫水時(shí)間短，組織不能完全透明，也就不能完全浸蠟；浸蠟時(shí)間長(zhǎng)，易使組織變 脆變硬，不能切出完整、清晰的石蠟切片。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種染色清晰，組織結(jié)構(gòu)完整的大葉藻胚石蠟 切片制作方法。本發(fā)明要解決的技術(shù)方案是一種大葉藻胚的石蠟切片制作方法，其步驟是一種大葉藻胚石蠟切片的制作方法，其步驟是(1)取材與固定將去掉胚乳后獲得的完整大葉藻胚浸入FAA固定液中固定48小 時(shí)以上；(2)脫水大葉藻胚自固定液中取出后先入50%濃度酒精中浸泡3次，每次5分 鐘，然后依次入50 %濃度酒精、70 %濃度酒精、80 %濃度酒精、95 %濃度酒精、無(wú)水乙醇中浸 泡脫水，各級(jí)浸泡脫水2小時(shí)，每梯度需更換同濃度酒精3 4次；脫水后的大葉藻胚再依 次入體積比為1 1的無(wú)水乙醇和二甲苯的混合液浸泡30分鐘，在二甲苯中第1次浸泡5 分鐘，在二甲苯中第2次浸泡5分鐘；(3)浸蠟與包埋在盛有大葉藻胚和二甲苯的容器中漸次加入石蠟，當(dāng)二甲苯與 石蠟的體積比為1 1時(shí)開(kāi)始浸泡30分鐘，再轉(zhuǎn)入融化的純石蠟中浸泡3次，每次放置30 分鐘，將充分透蠟后的大葉藻胚放入恒溫箱中保持58°C，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，獲得含有大葉 藻胚的蠟塊；(4)切片、展片、烘干將包有大葉藻胚的蠟塊固定在輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)上進(jìn)行石蠟連 續(xù)切片，得到蠟帶，切片厚度為10微米，將蠟帶置于水浴鍋中展片，水浴鍋溫度為40°C，蠟 帶受熱攤平完全展開(kāi)后，將涂有甘油蛋白的載玻片插入水里，讓蠟帶附在載玻片上，室溫晾干或者放到35°C恒溫箱中烘干獲得切片；(5)脫蠟、復(fù)水、蘇木精染色干燥后的切片入二甲苯中第1次脫蠟20分鐘，在二 甲苯中第2次脫蠟10分鐘，脫蠟后的切片依次入體積比為1 1的二甲苯與無(wú)水乙醇的混 合液、無(wú)水乙醇、95 %濃度的酒精、80 %濃度的酒精、70 %濃度的酒精、50 %濃度的酒精中各 浸泡5分鐘，再入蒸餾水中浸洗兩次，每次5分鐘，完成復(fù)水，復(fù)水后的切片經(jīng)蘇木精染液染 色5分鐘，最后用水沖洗15分鐘；(6)切片脫水、伊紅酒精染色染色后的切片經(jīng)蒸餾水浸洗兩遍，依次入50%濃度 的酒精、70%濃度的酒精、80%濃度的酒精中各浸泡5分鐘進(jìn)行脫水處理，脫水后的切片入 事先配好備用的10%伊紅酒精溶液染色1分鐘，然后依次經(jīng)過(guò)第1次95%濃度的酒精、第 2次95%濃度的酒精、第1次無(wú)水乙醇、第2次無(wú)水乙醇中各浸泡5分鐘；(7)透明、封片將染色后的切片分別入體積比為1 1的二甲苯與無(wú)水乙醇混合 液浸泡5分鐘、第1次二甲苯浸泡10分鐘、第2次二甲苯浸泡20分鐘進(jìn)行透明處理，切片 從二甲苯中取出后，擦去切片周圍的二甲苯，在二甲苯未揮發(fā)完之前，在切片中央滴一滴中 性加拿大樹(shù)膠，蓋上蓋玻片，通風(fēng)干燥，制成永久制片。在所述步驟(1)中，所述FAA固定液按50%濃度的酒精18體積份、冰醋酸1體積 份、37%濃度的福爾馬林1體積份比例配置。在所述步驟(4)中，所述甘油蛋白按甘油和雞蛋清以體積比1 1的比例配制。在所述步驟(5)中，所述蘇木精染液按如下比例配置，每95毫升蒸餾水取蘇木精 0. 8克，將蘇木精溶于蒸餾水中，然后加入7. 5克研磨后的硫酸鋁銨(銨明礬)，待銨明礬溶 解后依次加入0. 1克碘酸鈉、45毫升甘油和3毫升冰醋酸即可獲得蘇木精染液。在所述步驟(6)中，10%的伊紅酒精溶液按如下比例配置，每100毫升95%濃度的 酒精取10克署紅，將署紅溶于95%濃度的酒精即可獲得伊紅酒精溶液。本發(fā)明的技術(shù)效果是表一為現(xiàn)有石蠟切片方法與本發(fā)明石蠟切片方法的區(qū)別， 以及本發(fā)明石蠟切片具有的技術(shù)效果。表1現(xiàn)有石蠟切片方法與本發(fā)明石蠟切片方法的切片效果及原因
權(quán)利要求
1.一種大葉藻胚石蠟切片的制作方法，其步驟是(1)取材與固定將去掉胚乳后獲得的完整大葉藻胚浸入FAA固定液中固定48小時(shí)以上；(2)脫水大葉藻胚自固定液中取出后先入50%濃度酒精中浸泡3次，每次5分鐘，然 后依次入50 %濃度酒精、70 %濃度酒精、80 %濃度酒精、95 %濃度酒精、無(wú)水乙醇中浸泡脫 水，各級(jí)浸泡脫水2小時(shí)，每梯度需更換同濃度酒精3 4次；脫水后的大葉藻胚再依次入 體積比為1 1的無(wú)水乙醇和二甲苯的混合液浸泡30分鐘，在二甲苯中第1次浸泡5分鐘， 在二甲苯中第2次浸泡5分鐘；(3)浸蠟與包埋在盛有大葉藻胚和二甲苯的容器中漸次加入石蠟，當(dāng)二甲苯與石蠟 的體積比為1 1時(shí)開(kāi)始浸泡30分鐘，再轉(zhuǎn)入融化的純石蠟中浸泡3次，每次放置30分 鐘，將充分透蠟后的大葉藻胚放入恒溫箱中保持58°C，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，獲得含有大葉藻 胚的蠟塊；(4)切片、展片、烘干將包有大葉藻胚的蠟塊固定在輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)上進(jìn)行石蠟連續(xù)切 片，得到蠟帶，切片厚度為10微米，將蠟帶置于水浴鍋中展片，水浴鍋溫度為40°C，蠟帶受 熱攤平完全展開(kāi)后，將涂有甘油蛋白的載玻片插入水里，讓蠟帶附在載玻片上，室溫晾干或 者放到35°C恒溫箱中烘干獲得切片；(5)脫蠟、復(fù)水、蘇木精染色干燥后的切片入二甲苯中第1次脫蠟20分鐘，在二甲苯 中第2次脫蠟10分鐘，脫蠟后的切片依次入體積比為1 1的二甲苯與無(wú)水乙醇的混合液、 無(wú)水乙醇、95 %濃度的酒精、80 %濃度的酒精、70 %濃度的酒精、50 %濃度的酒精中各浸泡5 分鐘，再入蒸餾水中浸洗兩次，每次5分鐘，完成復(fù)水，復(fù)水后的切片經(jīng)蘇木精染液染色5分 鐘，最后用水沖洗15分鐘；(6)切片脫水、伊紅酒精染色染色后的切片經(jīng)蒸餾水浸洗兩遍，依次入50%濃度的酒 精、70%濃度的酒精、80%濃度的酒精中各浸泡5分鐘進(jìn)行脫水處理，脫水后的切片入事先 配好備用的10%伊紅酒精溶液染色1分鐘，然后依次經(jīng)過(guò)第1次95%濃度的酒精、第2次 95%濃度的酒精、第1次無(wú)水乙醇、第2次無(wú)水乙醇中各浸泡5分鐘；(7)透明、封片將染色后的切片分別入體積比為1 1的二甲苯與無(wú)水乙醇混合液浸 泡5分鐘、第1次二甲苯浸泡10分鐘、第2次二甲苯浸泡20分鐘進(jìn)行透明處理，切片從二 甲苯中取出后，擦去切片周圍的二甲苯，在二甲苯未揮發(fā)完之前，在切片中央滴一滴中性加 拿大樹(shù)膠，蓋上蓋玻片，通風(fēng)干燥，制成永久制片。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種大葉藻胚石蠟切片的制作方法，其特征在于在所述步驟 (1)中，所述FAA固定液按50%濃度的酒精18體積份、冰醋酸1體積份、37%濃度的福爾馬 林1體積份比例配置。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種大葉藻胚石蠟切片的制作方法，其特征在于在所述步驟中，所述甘油蛋白按甘油和雞蛋清以體積比1 1的比例配制。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種大葉藻胚石蠟切片的制作方法，其特征在于在所述步驟 (5)中，所述蘇木精染液按如下比例配置，每95毫升蒸餾水取蘇木精0. 8克，將蘇木精溶于 蒸餾水中，然后加入7. 5克研磨后的硫酸鋁銨，待硫酸鋁銨溶解后依次加入0. 1克碘酸鈉、 45毫升甘油和3毫升冰醋酸即可獲得蘇木精染液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種大葉藻胚石蠟切片的制作方法，其特征在于在所述步驟(6)中，10%的伊紅酒精溶液按如下比例配置，每100毫升95%濃度的酒精取10克署紅，將 署紅溶于95%濃度的酒精即可獲得伊紅酒精溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種大葉藻胚石蠟切片的制作方法，其步驟是(1)取材與固定取大葉藻種子，剝?nèi)ス?，去掉胚乳后獲得完整大葉藻胚浸入FAA固定液中固定48小時(shí)以上；(2)脫水大葉藻胚自固定液中取出后先入酒精中浸泡脫水；(3)浸蠟與包埋在盛有大葉藻胚和二甲苯的容器中漸次加入石蠟，并進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，獲得含有大葉藻胚的蠟塊；(4)切片、展片、烘干將包有大葉藻胚的蠟塊固定在輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)上進(jìn)行石蠟連續(xù)切片，得到蠟帶，讓蠟帶附在載玻片上；(5)脫蠟、復(fù)水、蘇木精染液染色；(6)切片脫水、伊紅酒精染色；(7)透明、封片，制成永久制片。本發(fā)明能夠得到染色清晰，組織結(jié)構(gòu)完整的大葉藻胚石蠟切片。
文檔編號(hào)G01N1/06GK102116711SQ20111004118
公開(kāi)日2011年7月6日 申請(qǐng)日期2011年1月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月31日
發(fā)明者劉延嶺, 吳萌萌, 崔翠菊, 李慧, 李霞, 梁廣津, 王宏梅, 田萍萍, 錢冠蘭, 錢瑞 申請(qǐng)人:山東東方海洋科技股份有限公司