專(zhuān)利名稱(chēng)：一種半胱氨酸的熒光檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及半胱氨酸的檢測(cè)領(lǐng)域，特別涉及一種半胱氨酸的熒光檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
半胱氨酸屬于蛋白質(zhì)氨基酸，是生物體內(nèi)非常重要的巰基類(lèi)物質(zhì)，它在生物體內(nèi)參與細(xì)胞的還原過(guò)程，具有調(diào)節(jié)肝臟內(nèi)磷脂的代謝和保護(hù)肝臟細(xì)胞免受毒物損害等生理功能。生物體內(nèi)半胱氨酸含量的變化或代謝失調(diào)均會(huì)導(dǎo)致一些疾病的發(fā)生，通過(guò)測(cè)定生物體內(nèi)半胱氨酸含量，可實(shí)現(xiàn)某些代謝疾病的診斷，因此實(shí)現(xiàn)半胱氨酸快速、靈敏的檢測(cè)具有十分重要的意義。已報(bào)道的半胱氨酸測(cè)定方法較多，主要有分光光度法(O.Rusin， N. N. S. Luce, ；R. A. Agbaria, J. 0. Escobedo, S. Jiang, I. Μ. Warner, F. B. Dawan, K. Lian and R. M. Strongin, J. Am. Chem. Soc. ，2004,126,438. W. Wang, 0. Rusin, X. Xu, K. K. Kim, J. 0. Escobedo, S. 0. Fakayode, K. A. Fletcher, M. Lowry, C. M. Schowalter, C. M. Lawrence, F. R. Fronczek, I. M. Warner and R. M. Strongin, J. Am. Chem. Soc.，2005，127，15949.)、 電化學(xué)法(J. Μ. Zen, Α. S. Kumar and J. C. Chen, Anal. Chem. 2001，73，1169. M. Zhou, J. Ding, L. Guo and Q. K. Shang, Anal. Chem. , 2007, 79, 5328. J. C. Ndamanisha, J. Bai,
B.Qi and L. P. Guo, Anal. Biochem.，2009，386，79.)、分離技術(shù)比如高壓液相色譜和毛細(xì)管電泳(C. Lu, Y. Zu and V. W. W. Yam, J. Chromatogr. A, 2007，1163，328. Y. V. Tcherkas and A. D. Denisenko, J. Chromator. A, 2001,913, 309. M. J. Nozal, J. L. Bernal, L. Toribio, P. Marinero, 0. Moral, L. Manzanas and E. Rodriguez, J. Chromatogr. A,1997,778,347.) 禾口比色法(F. X. Zhang, L. Han, L. B. Israel, J. G. Daras, Μ. M. Maye, N. K. Ly and C. J. Zhong, Analyst,2002,127,462.L.Li and B.Li, Analyst,2009,134,1361. P. K.Sudeep, S. T. S. Joseph and K. G. Thomas, J. Am. Chem. Soc.，2005，127,6516.)。但這些方法大多靈敏度或選擇性不好，或者需要復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)步驟。因而難以滿足實(shí)際檢測(cè)的需要。目前基于靶向響應(yīng)DNA結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換的高靈敏度高選擇性低成本生物傳感器越來(lái)越受到研究者的關(guān)注。當(dāng)檢測(cè)到目標(biāo)分子，DNA的結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生改變。核酸適配體(aptamer) 是一類(lèi)通過(guò)指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment, SELEX)技術(shù)體外篩選出來(lái)的對(duì)靶分子具有高度親和力的一類(lèi)DNA或RNA分子。 理論上，對(duì)于特定的目標(biāo)分子，總能找到一種或多種與之特異性結(jié)合的aptamer，因此大大拓寬了應(yīng)用領(lǐng)域，被認(rèn)為是生物傳感器最理想的識(shí)別元件之一。汞離子特異性DNA(MSD，存在7個(gè)胸腺嘧啶-胸腺嘧啶錯(cuò)配)在沒(méi)有汞離子存在時(shí)呈無(wú)規(guī)卷曲狀態(tài)，加入汞離子后由于形成胸腺嘧啶-Hg2+-胸腺嘧啶(T-Hg2+-T)配合物使汞離子特異性DNA呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)，熒光染料Sybr Green I能夠識(shí)別這種結(jié)構(gòu)變化因?yàn)樗cMSD和MSD/Hg2+復(fù)合物的相互作用不同。眾所周知半胱氨酸能與汞離子形成非常穩(wěn)定的絡(luò)合物(G. Berthon, Pure&App. Chem.，1995，67，1117.)。用這個(gè)特征，Mirkin 等(J. S. Lee，P. A. Ulmann，M. S. Han and
C.A. Mirkin, Nano Lett.，2008，8，529.)發(fā)展了一種比色檢測(cè)半胱氨酸的高靈敏度高選擇性方法，但這種方法需要升溫，操作繁瑣。我們最近(H. Xu, M. Hepel, Anal. Chem.，2011， inpress0 )發(fā)展了一種熒光“開(kāi)”的分子燈標(biāo)探針檢測(cè)半胱氨酸，這種方法也是基于Hg2+ 被半胱氨酸和T-T錯(cuò)配的競(jìng)爭(zhēng)配位，靈敏度和選擇性都很高，但它不僅需要對(duì)分子燈標(biāo)進(jìn)行雙重?zé)晒鈽?biāo)記而且也需要對(duì)溶液進(jìn)行加熱，所以這種方法不僅成本高而且也較復(fù)雜。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是要解決現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種高靈敏度和特異性，操作簡(jiǎn)單的半胱氨酸熒光檢測(cè)方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下(1)在緩沖溶液中將汞離子特異性DNA與汞離子反應(yīng)，(2)加入熒光染料，測(cè)定熒光強(qiáng)度，(3)加入待測(cè)氨基酸，測(cè)定熒光強(qiáng)度。其中，上述熒光染料可為任何現(xiàn)有能通過(guò)熒光方法指示單雙鏈結(jié)構(gòu)變化的物質(zhì)。 本發(fā)明優(yōu)選Sybr Green I。Sybr Green I是一種能與雙鏈DNA結(jié)合發(fā)光的熒光染料。其與雙鏈DNA結(jié)合后，熒光大大增強(qiáng)。本發(fā)明所用的緩沖溶液較佳的是IOmM M0PS，含0. IM NaNO3, pH 7. 0-7. 50，使用其可以控制適當(dāng)?shù)腜H，且不與汞離子產(chǎn)生沉淀。本發(fā)明中所說(shuō)的汞離子特異性DNA存在7個(gè)胸腺嘧啶-胸腺嘧啶錯(cuò)配，序列為 5，-TTCTTTCTTCCCCTTGTTTGTT-3，。當(dāng)體系中存在汞離子時(shí)，能夠形成胸腺嘧啶-Hg2+-胸腺嘧啶配合物使DNA呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)。其濃度可為ΙΟ-ΙΟΟηΜ，優(yōu)選為ΙΟηΜ，50nM或ΙΟΟηΜ。本發(fā)明所說(shuō)的汞離子濃度為汞離子特異性DNA濃度的7倍.以便使所有的胸腺嘧啶-胸腺嘧啶錯(cuò)配形成胸腺嘧啶-Hg2+-胸腺嘧啶配合物。本發(fā)明中所說(shuō)的汞離子特異性DNA和汞離子混合反應(yīng)時(shí)間為2分鐘，加入熒光染料反應(yīng)2分鐘后進(jìn)行熒光測(cè)試。加入待測(cè)氨基酸混合均勻后立即進(jìn)行熒光測(cè)試。所述的熒光染料Sybr Green I的濃度要使得汞離子特異性DNA-Hg2+-Sybr Green I體系的熒光強(qiáng)度與汞離子特異性DNA-Sybr Green I體系的熒光強(qiáng)度之差最大。所述的待測(cè)氨基酸，包括從蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物中分離出來(lái)的常見(jiàn)20種氨基酸，色氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、賴氨酸、組氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸、精氨酸、甘氨酸、絲氨酸、酪氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺。本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于1、本發(fā)明只需三步即可完成，大大簡(jiǎn)化了操作步驟。一般工作者只需通過(guò)簡(jiǎn)單訓(xùn)練即可完成，無(wú)需專(zhuān)業(yè)工作人員進(jìn)行操作。2、本發(fā)明5分鐘之內(nèi)即可完成檢測(cè)。大大節(jié)約了檢測(cè)時(shí)間。3、本發(fā)明無(wú)需對(duì)DNA進(jìn)行標(biāo)記，節(jié)約了檢測(cè)成本。4、本發(fā)明具有高度的靈敏度和特異性，檢測(cè)限可達(dá)到3. 34nM;除半胱氨酸外，其余19種氨基酸都不會(huì)對(duì)檢測(cè)造成干擾。


圖1為本發(fā)明的半胱氨酸熒光檢測(cè)方法示意圖。
圖2為根據(jù)本發(fā)明的方法測(cè)定的有無(wú)半胱氨酸時(shí)的熒光光譜。其中[MSD] = IOnM, [Hg2+] = 70nM, [Sybr Green I] = 1. 225 X IO^7M,[半胱氨酸]=140nM。圖3為本發(fā)明中最佳Sybr Green I濃度選擇圖。圖3a為汞離子特異性DNA-Sybr GreenI體系的熒光光譜。圖北為汞離子特異性DNA-Hg2+-Sybr Green I體系的熒光光譜。 圖3c為汞離子特異性DNA-Hg2+-Sybr Green I熒光強(qiáng)度與汞離子特異性DNA-Sybr Green I熒光強(qiáng)度比值與SG濃度的關(guān)系曲線。圖4為根據(jù)本發(fā)明的方法測(cè)定的不同半胱氨酸濃度的熒光光譜(圖4a)和熒光強(qiáng)度的變化(圖 4b)。其中[MSD] = IOnM, [Hg2+] = 70nM, [Sybr Green I] = 1. 225 X IO^7M0 圖4a中半胱氨酸濃度從上到下依次為0，7，21，沘，35，42，49，56，70，84，98，112，126，140， 160，200nM。圖4b插圖為半胱氨酸的線性動(dòng)力學(xué)范圍，其中誤差線為三次測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖5為根據(jù)本發(fā)明的方法測(cè)定的不同氨基酸的熒光強(qiáng)度。其中[MSD] = IOnM, [Hg2+] = 70nM, [Sybr Green I] = 1. 225 X IO^7M,[氨基酸]=140nM，Bnk 空白樣品，Cys 半胱氨酸，Ile 異亮氨酸，Ser 絲氨酸，Lys 賴氨酸，Thr 蘇氨酸，Trp 色氨酸，His 組氨酸，Glu 谷氨酸，Gly 甘氨酸，Pro 脯氨酸，Tyr 酪氨酸，Leu 亮氨酸，Ala 丙氨酸，Val 纈氨酸，Met 蛋氨酸，Gln 谷氨酰胺，Asp 天冬氨酸，Asn 天冬酰胺，Phe 苯丙氨酸，Arg 精氨酸。圖6為根據(jù)本發(fā)明的方法在不同DNA濃度和汞離子濃度下測(cè)定不同濃度半胱氨酸時(shí)的熒光強(qiáng)度和線性動(dòng)力學(xué)范圍(圖6a和6b插圖)。
具體實(shí)施例方式下面根據(jù)附圖，給出本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施例，并予以詳細(xì)的描述，使能更好地理解本發(fā)明的功能、特點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)儀器所用儀器為熒光分光光度計(jì)(LS-55，美國(guó)Perkins Elmer儀器有限公司)。儀器條件為脈沖式氙燈激發(fā)，激發(fā)波長(zhǎng)為495nm，熒光光譜的掃描范圍500-650nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5nm，用寬度IOmm石英比色皿進(jìn)行測(cè)量，樣品體積2mL ；室溫。本發(fā)明各實(shí)施例中所用原料中的熒光染料Sybr Green I的結(jié)構(gòu)式如下，購(gòu)于 Invitrogen公司，母液濃度為10，000 X。
權(quán)利要求
1.一種半胱氨酸的熒光檢測(cè)方法，其包括下列步驟(1)在緩沖溶液中將汞離子特異性DNA與汞離子反應(yīng)，(2)加入熒光染料，測(cè)定熒光強(qiáng)度，(3)加入待測(cè)氨基酸，測(cè)定熒光強(qiáng)度。
2.如權(quán)利要求1所述的熒光檢測(cè)方法，其特征在于熒光染料為能通過(guò)熒光方法指示單雙鏈結(jié)構(gòu)變化的物質(zhì)。
3.如權(quán)利要求2所述的熒光檢測(cè)方法，其特征在于所述熒光染料優(yōu)選為SybrGreenI。
4.如權(quán)利要求1所述的熒光檢測(cè)方法，其特征在于反應(yīng)體系為IOmMM0PS，含0. IM NaNO3, pH 7. 0-7. 50。
5.如權(quán)利要求1所述的熒光檢測(cè)方法，其特征在于汞離子特異性DNA存在7個(gè)胸腺嘧啶 _ 胸腺嘧啶錯(cuò)配，序列為 5，-TTCTTTCTTCCCCTTGTTTGTT-3’。
6.如權(quán)利要求1或5所述的熒光檢測(cè)方法，其特征在于汞離子特異性DNA濃度為 IOnM-IOOnM。
7.如權(quán)利要求1或6所述的熒光檢測(cè)方法，其特征在于汞離子特異性DNA濃度優(yōu)選為 IOnM,50nM 或 ΙΟΟηΜ。
8.如權(quán)利要求1所述的熒光檢測(cè)方法，其特征在于汞離子濃度為汞離子特異性DNA濃度的7倍。
9.如權(quán)利要求1所述的熒光檢測(cè)方法，其特征在所述汞離子特異性DNA和汞離子混合反應(yīng)時(shí)間為2分鐘，加入熒光染料反應(yīng)2分鐘后進(jìn)行熒光測(cè)試。
10.如權(quán)利要求1所述的熒光檢測(cè)方法，其特征在于加入待測(cè)氨基酸混合均勻后立即進(jìn)行熒光測(cè)試。
11.如權(quán)利要求1或3所述的熒光檢測(cè)方法，其特征在于所述的熒光染料SybrGreen I的濃度要使得汞離子特異性DNA-Hg2+-Sybr Green I體系的熒光強(qiáng)度與汞離子特異性 DNA-Sybr Green I體系的熒光強(qiáng)度之差最大。
12.如權(quán)利要求1所述的熒光檢測(cè)方法，其特征在于待測(cè)氨基酸包括色氨酸、蛋氨酸、 蘇氨酸、纈氨酸、賴氨酸、組氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸、精氨酸、 甘氨酸、絲氨酸、酪氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種半胱氨酸的熒光檢測(cè)方法。汞離子特異性DNA(存在7個(gè)胸腺嘧啶-胸腺嘧啶錯(cuò)配)在沒(méi)有汞離子存在時(shí)呈無(wú)規(guī)卷曲狀態(tài)，加入汞離子后由于形成胸腺嘧啶-Hg2+-胸腺嘧啶(T-Hg2+-T)配合物使汞離子特異性DNA呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)，加入熒光染料Sybr Green I，由于Sybr Green I是一種能與雙鏈DNA結(jié)合發(fā)光的熒光染料，熒光強(qiáng)度很高。加入待測(cè)氨基酸，當(dāng)檢測(cè)到半胱氨酸時(shí)，半胱氨酸能與汞離子形成更加穩(wěn)定的配合物，從而提取出T-Hg2+-T配合物中的汞離子，發(fā)夾結(jié)構(gòu)解螺旋，熒光強(qiáng)度下降，而其它氨基酸不會(huì)引起熒光強(qiáng)度的改變。本發(fā)明不僅具有高度的靈敏度，很好的特異性，而且簡(jiǎn)單，快速，整個(gè)過(guò)程能在5分鐘內(nèi)完成。
文檔編號(hào)G01N21/64GK102183495SQ201110034758
公開(kāi)日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2011年1月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月26日
發(fā)明者徐慧, 柳全文, 陳建農(nóng), 高淑麗 申請(qǐng)人:魯東大學(xué)