專利名稱：一組高分化早期肝癌的分子標(biāo)志物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一組高分化早期肝癌的分子標(biāo)志物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肝炎是嚴(yán)重影響中國(guó)乃至世界人類健康的社會(huì)衛(wèi)生問(wèn)題，肝炎患者大部分為乙型肝炎或丙型肝炎而我國(guó)以乙型肝炎為主。雖然，我國(guó)的乙肝發(fā)病率仍居高不下，約25%左右的慢性HBV感染者最終發(fā)展為肝細(xì)胞癌(HCC)。全球3 4億人為HBV慢性感染，中國(guó)就有 9300萬(wàn)以上HBV慢性感染患者。目前，已證明與肝癌有關(guān)的肝炎病毒主要為HBV及HCV。通過(guò)對(duì)乙型肝炎表面抗原(HBsAg)攜帶者進(jìn)行的長(zhǎng)期前瞻性研究發(fā)現(xiàn)，HBsAg陽(yáng)性者發(fā)生肝癌的相對(duì)危險(xiǎn)性(RR)為非攜帶者的13. 69倍，說(shuō)明HBV與肝癌的因果關(guān)系強(qiáng)烈，并且這種關(guān)系有特異性。HBV致癌作用的分子機(jī)理尚不十分清楚。最近研究表明整合入宿主基因組的HBV基因能引起染色體不穩(wěn)定，使其在很多位點(diǎn)發(fā)生雜合性缺失；激活原癌基因；腫瘤抑制基因和原癌基因甲基化狀態(tài)的改變。肝癌形成也是一個(gè)多因素，多步驟，多基因參加的復(fù)雜過(guò)程，一般經(jīng)歷肝炎，肝硬化，不典型增生結(jié)節(jié)，肝癌的進(jìn)展過(guò)程。我國(guó)80%左右的肝癌患者HBV檢測(cè)陽(yáng)性，其發(fā)病常伴有“肝炎一肝硬化一肝癌”的慢性過(guò)程。近年來(lái)，肝癌癌前病變DN (dysplastic nodule，不典型增生結(jié)節(jié))日益受到重視。這些病灶在HBV，HCV感染的肝臟中發(fā)現(xiàn)且發(fā)展成為早期肝癌繼而進(jìn)入進(jìn)展性肝癌階段。另外，癌前期的早期治療有效率可達(dá)90%，而進(jìn)展期腫瘤的總體治愈率僅為5%。肝癌的5年生存率，亞臨床期(I期)為 53.2%，中期(11期)為觀.2%，而晚期(111)幾乎是0%。因而，肝癌的早期診斷，早期治療非常重要。硬化肝中的DN廣泛被公認(rèn)為是HCC癌前病變。DN可分為低度DN (LGDN)和高度 DN (HGDN)，HGDN 更趨于 HCC。Kobayashi M (Cancer，106 636-647，2006)等報(bào)道 HGDN 的累積癌變率分別為 1 年3. 5-46. 2%, 2 年:15. 5-61. 5%, 3 年:31-61. 5%, 5 年:48. 5-80. 8%, 遠(yuǎn)高于一般肝硬化的每年HCC的發(fā)生率2. 5-3. 7%。而HGDN和分化程度高的早期肝癌的鑒別診斷非常困難。目前臨床上其鑒別診斷主要依靠影像學(xué)診斷或有豐富經(jīng)驗(yàn)的病理學(xué)者的 HE染色切片鏡下診斷。影響學(xué)診斷方法主要有超聲波(US)，CT掃描，MRI等。楊文德(臨床消化病雜志，第17卷，第5期，222-223，2005年)等探討3種非創(chuàng)傷性影像檢查方法US，CT 和MRI在肝癌診斷中的敏感性和準(zhǔn)確性。他們回顧性地分析比較了 79例肝癌的US、CT及 MRI優(yōu)缺點(diǎn)。其結(jié)果，肝癌確診率為US: 73. 08%,CT: 87. 34%,MRI 87. 76%。US對(duì)早期肝癌的檢出率較高，但確診率較低。CT和MRI對(duì)中晚期肝癌確診率較高。但任何一種單獨(dú)的方法不足以滿足臨床的需要，需合理及綜合利用，提高早期肝癌診斷。另外，關(guān)于分子標(biāo)志物， 區(qū)別HGDN和高分化早期肝癌的分子標(biāo)志物主要有⑶34和GPC3。而，⑶34在HGDN和肝癌中的表達(dá)水平差異小，而不能有效地區(qū)別它們(ifepatology，30:1174-1178，1999)。后來(lái)， 一些病理學(xué)家雖然利用典型的肝癌⑶34染色類型來(lái)區(qū)別HGDN，但其特異度還是比較低，且其肝癌CD34染色類型的判斷比較繁瑣(Am J Surg Pathol，33:874-885，2009)。GPC是廣泛被應(yīng)用的肝癌分子標(biāo)志物。Coston麗等在2008年總結(jié)了 GPC的有效性(Am J SurgI^athol，32:433-44，2008)。結(jié)果，GPC3診斷高分化早期肝癌的準(zhǔn)確度為80%，而在23%的高度不典型增生中也呈陽(yáng)性，說(shuō)明GPC3的特異度僅為77%，有待提高。另外GPC3不與肝癌的分化程度相關(guān)，所以不足以提示肝癌的進(jìn)程。綜上所述，現(xiàn)有技術(shù)中無(wú)論是分子標(biāo)志物還是影像學(xué)方法其靈敏度和特異度均有限，且尚缺乏，高效區(qū)別高分化早期肝癌和高度不典型增生的免疫組織學(xué)診斷標(biāo)志物。因此，發(fā)現(xiàn)高度不典型增生(HGDN)和高分化早期HCC的標(biāo)志物將為臨床提供強(qiáng)有力的鑒別診斷工具。另外，DN與HCC差異性表達(dá)的分子可以預(yù)測(cè)HCC的發(fā)生，也可以為阻斷其發(fā)展成為 HCC提供線索和方案。因此，DN特異性標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用預(yù)計(jì)將給臨床提供區(qū)分DN和肝癌的有效分子標(biāo)志物。磷酸葡萄糖變位酶-1 (PGMl)是一種α -D-葡萄糖磷酸鹽和α -D-葡萄糖-6-磷酸鹽的變位酶。PGMl基因的缺失引起PGMl蛋白的缺損，導(dǎo)致糖原糖原累積病14 型。而從沒(méi)有人報(bào)道PGMl與肝癌的相關(guān)性。死骨片-1 (SQSTMl)是可與泛素結(jié)合并通過(guò)TNF-α，腫瘤生長(zhǎng)因子(NGF)和白介素-1調(diào)控NFKBl的活性。也可能與細(xì)胞的分化，凋亡，免疫反應(yīng)等有關(guān)。也曾經(jīng)有報(bào)道在乳腺癌和肝癌中增高的報(bào)道，但現(xiàn)有技術(shù)中并沒(méi)有SQSTMl在高分化早期肝癌和高度不典型增生中表達(dá)差異的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提出一組新的高分化早期肝癌的分子標(biāo)志物，并提供該高分化早期肝癌的分子標(biāo)志物在制備早期肝癌診斷試劑中的應(yīng)用。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一組新的高分化早期肝癌的分子標(biāo)志物， 包含磷酸葡萄糖變位酶-1 (PGMl)和死骨片-1 (SQSTM1)。葡萄糖變位酶_1在肝癌中低表達(dá)，而死骨片-1在肝癌中高表達(dá)。具體地，磷酸葡萄糖變位酶-1在LGDN，HGDN,高分化早期肝癌，中度分化早期肝癌中呈降低趨勢(shì)。死骨片-1在LGDN，HGDN，高分化早期肝癌，中度分化早期肝癌中呈升高趨勢(shì)。如圖3所示，為磷酸葡萄糖變位酶-1和死骨片-1在LGDN， HGDN,高分化早期肝癌，中度分化早期肝癌中的表達(dá)水平的變化趨勢(shì)圖。本發(fā)明還提供了磷酸葡萄糖變位酶-1和死骨片-1作為早期肝癌的分子標(biāo)志物組合在制備肝癌臨床診斷試劑中的應(yīng)用。磷酸葡萄糖變位酶-1和死骨片-1的組合可應(yīng)用于臨床肝癌病理切片的檢查和鑒別診斷。鑒于已有的分子標(biāo)志物CD34和GPC3的不足，本發(fā)明提供的2種蛋白是一組非常好的早期肝癌分子標(biāo)志物。在臨床的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用中，可按照常規(guī)方法制備抗磷酸葡萄糖變位酶-1抗體和抗死骨片-1抗體，建立檢測(cè)磷酸葡萄糖變位酶-1和死骨片-1的定性或定量方法以及配套試劑盒，以用于判斷肝癌的進(jìn)程和發(fā)病機(jī)制的研究。本發(fā)明還提供了一種肝癌診斷試劑盒，其特征在于，包含磷酸葡萄糖變位酶-1抗體和死骨片-1抗體。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了新的早期肝癌分子標(biāo)志物，具有較高的檢測(cè)靈敏度和特異度。


圖1為免疫印跡方法證明磷酸葡萄糖變位酶-1和死骨片-1在不典型增生結(jié)節(jié)和早期肝癌中的表達(dá)差異圖。圖2為免疫組織化學(xué)法證明磷酸葡萄糖變位酶-1和死骨片-1在不典型增生結(jié)節(jié)和早期肝癌中的表達(dá)差異圖。圖3為磷酸葡萄糖變位酶-1和死骨片-1在LGDN，HGDN，高分化早期肝癌，中度分化早期肝癌中的表達(dá)水平的變化趨勢(shì)圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例來(lái)具體說(shuō)明本發(fā)明。實(shí)施例1 樣本的收集及蛋白提取
1、取人的不典型增生結(jié)節(jié)病灶和早期肝癌病灶經(jīng)2位病理科專家的HE切片的鏡下診斷后，將對(duì)應(yīng)的蠟塊切成厚度為7 μ m的白片。在溫度為60°C的條件下烘干直至切片組織與載玻片之間無(wú)氣泡(大概30-60分)。2、甲醛固定/石蠟包埋(FFPE)組織蛋白的提取和蛋白濃度測(cè)定
2.1、將上述的肝組織切片置于二甲苯中進(jìn)行脫蠟2次，每次10 min0風(fēng)烘干后精確畫出其病灶范圍。用手術(shù)刀片(11號(hào)刀片)對(duì)病灶部分進(jìn)行精確切割，并放入低吸附管。2. 2、在每個(gè)低吸附管中加入適量石蠟包埋組織蛋白提取緩沖液(Tris-HCl緩沖液)，該緩沖液含有質(zhì)量濃度為1的十二烷基磺酸鈉(SDS)和20mM三羥甲基氨基甲烷 (Tris), pH=9，每 50-400 mm2 組織加入 100-400 μ 1 緩沖液。2. 3、將上述低吸附管在100°C、轉(zhuǎn)速為750rpm的條件下震蕩20 min，再在80°C、轉(zhuǎn)速為750 rpm的條件下震蕩120 min，置于4°C條件下靜置5 min后，加入羅氏(Roche)蛋白酶抑制劑(不含EDTA ) 2-8 μ L·2. 4、將樣本轉(zhuǎn)移至 Ultrafree-MC 離心超濾管(MiIlipore，Durapore PVDF 0. 45 μ m，0.5 ml)，在4°C、離心力為12000 g的條件下離心3 min (時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)直至離心結(jié)束)得到蛋白樣本。采用常規(guī)方法用BCA蛋白定量試劑(碧云天)進(jìn)行蛋白定量。實(shí)施例2 免疫印跡法證明磷酸葡萄糖變位酶-1以及死骨片-1的表達(dá)差異
1、將實(shí)施例1提取得到的蛋白樣本(每組各18例樣本混合)，采用常規(guī)方法進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜(Millipore)上。2、將脫脂奶粉溶解在 pH=7. 4 的 TBS-T 緩沖液(0. 05% (v/v) Tween 20/Tris-緩沖液)中得到無(wú)脂肪牛奶溶液，脫脂奶粉的濃度為5% (w/v)，將上述無(wú)脂肪牛奶溶液加入到上述蛋白樣本中，Ih后，加入一抗，4°C孵育過(guò)夜，用TBS-T洗膜3次后，加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)志的二抗，常溫孵育lh。其中，一抗的公司和稀釋倍率如下小鼠抗-PGMl (ab55616, Abeam, 1 300),兔抗-SQSTMl (P0067, Sigma-Aldrich, 1 1000),兔抗-α-Tubulin (abl5246, Abeam, 1 200)o 二抗的公司和稀釋倍率如下山羊抗兔IgG抗體-HRP 標(biāo)記(Goat Anti-Rabbit IgG-HRP，貨號(hào)170-6515，Bio-Rad，1 20000)，山羊抗鼠 IgG 抗體-HRP 標(biāo)記(Goat Anti-Mouse IgG (H + L)-HRP，貨號(hào)170-6516，Bio-Rad， 1:20000)。3、采用常規(guī)方法顯色，條帶用ECL 蛋白印跡檢測(cè)試劑(Pierce Chemical公司生產(chǎn))發(fā)光5min后，曝光到χ-光膠片(Kodak公司生產(chǎn))。最后用QUANTITY ONE軟件(Bio-Rad 公司提供)進(jìn)行定量。如圖1所示，為免疫印跡方法證明磷酸葡萄糖變位酶-1和死骨片-ι在不典型增生結(jié)節(jié)和早期肝癌中的表達(dá)差異圖。以α-微管蛋白(Tubulin)作為內(nèi)參。實(shí)施例3 免疫組織化學(xué)法證明PGMl以及SQSTMl的表達(dá)差異
1、取人的不典型增生結(jié)節(jié)病灶和早期肝癌病灶經(jīng)2位病理科專家的HE切片的鏡下診斷后，將對(duì)應(yīng)的蠟塊用常規(guī)方法制成組織芯片，切成4μπι厚度切片，放到3-氨基丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilane)涂抹的載玻片上。2、將載有組織切片的載玻片按照常規(guī)方法進(jìn)行二甲苯脫蠟，水化(100%乙醇，95% 乙醇，85%乙醇各處理5min)，將載有組織切片的載玻片置于0. OlM檸檬酸鹽緩沖液(pH6. 0) 中在100°C進(jìn)行抗原修復(fù)處理3min，取出放置冷卻，置于含有質(zhì)量濃度為3%的H2A的磷酸鹽(PBS)緩沖液中進(jìn)行內(nèi)源性過(guò)氧化物酶封閉處理30min，取出后，置于山羊血清中60min， 取出，加入一抗，4°C孵育過(guò)夜，用磷酸鹽緩沖液沖洗后，用EnVision檢測(cè)試劑盒顯色。其中，抗體的生產(chǎn)公司和稀釋倍數(shù)為小鼠抗-PGMl (ab55616, Abeam, 1:2000),兔抗-SQSTMl (P0067, Sigma-Aldrich，1:500)。3、采用常規(guī)方法進(jìn)行蛋白表達(dá)水平定量連接Leica CCD相機(jī)的DFC420 Leica DM IRE2 顯微鏡(Leica Microsystems Imaging Solutions Ltd, Cambridge, United Kingdom)上在X200視野拍代表性的區(qū)域。應(yīng)用軟件為L(zhǎng)eica Qffin Plus v3軟件。積分光密度值(Integrated Optical Density, I0D)利用 Image-Pro Plus v6. 0 軟件(Media Cybernetics Inc，Bethesda，MD)計(jì)算得出。統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件為SPSS13. 0，制圖軟件主要為 GraphPad Prism 5。如圖2所示，為免疫組織化學(xué)法證明磷酸葡萄糖變位酶-1和死骨片-1在不典型增生結(jié)節(jié)和早期肝癌中的表達(dá)差異圖。最上一行A為HE染色。由圖可知PGMl在肝癌中低表達(dá)(B)，而SQSTMl在肝癌中高表達(dá)(C)。各個(gè)蛋白的表達(dá)水平用IOD表示，并繪制成箱須圖(Box-whisker Plot)。圖中 DN 組為 46 例，eHCC 組為 51 例。Mann-Whitney U 檢驗(yàn)結(jié)果PGMl 為 p<0. 0001，SQSTMl 為 p<0. 0002。實(shí)施例4 肝癌診斷試劑盒及其應(yīng)用 1、一種肝癌診斷試劑盒，由以下試劑組成 抗原修復(fù)液(O. OlM檸檬酸鹽緩沖液，pH=6. 0)；
含有質(zhì)量濃度為3%的H2A的磷酸鹽(PBS)緩沖液，pH=7. 4 ； 山羊血清；
小鼠抗-PGMl (ab55616，Abcam公司提供，稀釋倍數(shù)1:2000)； 兔抗-SQSTMl (P0067, Sigma-Aldrich 公司提供，稀釋倍數(shù) 1 500)； EnVision檢測(cè)試劑盒(兔/鼠通用)(DAK0公司提供)。2、應(yīng)用上述肝癌診斷試劑盒進(jìn)行肝癌診斷的方法如下
2.1、采用常規(guī)方法對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行蛋白表達(dá)水平定量連接Leica CXD相 1/1W DFC420 Leica DM IRE2 MitH (Leica Microsystems Imaging Solutions Ltd, Cambridge, United Kingdom)上在X 200視野拍代表性的區(qū)域。應(yīng)用軟件為L(zhǎng)eica Qffin Plus v3 軟件。禾只分光密度值(Integrated Optical Density，I0D)禾Ij用 Image-Pro Plus v6. 0 軟件(Media Cybernetics Inc，Bethesda，MD)計(jì)算得出。統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件為 SPSS13. 0， 制圖軟件主要為GraphPad Prism 5。2. 1、另外，病理科醫(yī)生或者研究人員可通過(guò)顯微鏡下的觀察對(duì)免疫組織化學(xué)的結(jié)果進(jìn)行評(píng)估。其方法為，綜合考慮染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的比率。染色強(qiáng)度無(wú)黃色為0， 陽(yáng)性強(qiáng)度淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<15%為0 分，15%-25%為1分，25%-50%為2分，>50為3分。將每種蛋白的染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分?jǐn)?shù)相乘，得出該蛋白的陰性或陽(yáng)性結(jié)果，既0分為陰性(-)，1-2分為弱陽(yáng)性(-)，3-4分為中等陽(yáng)性(++)，6-9分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。至少1種蛋白為陰性可判斷為早期肝癌。
權(quán)利要求
1.磷酸葡萄糖變位酶-1和死骨片-1作為早期肝癌的分子標(biāo)志物組合在制備肝癌臨床診斷試劑中的應(yīng)用。
2.一種肝癌診斷試劑盒，其特征在于，包含磷酸葡萄糖變位酶-1抗體和死骨片-1抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一組高分化早期肝癌的分子標(biāo)志物及其應(yīng)用。所述的一組高分化早期肝癌的分子標(biāo)志物，包含磷酸葡萄糖變位酶-1(PGM1)和死骨片-1(SQSTM1)。本發(fā)明還提供了磷酸葡萄糖變位酶-1和死骨片-1作為早期肝癌的分子標(biāo)志物組合在制備肝癌臨床診斷試劑中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種肝癌診斷試劑盒，其特征在于，包含磷酸葡萄糖變位酶-1抗體和死骨片-1抗體。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是具有較高的檢測(cè)靈敏度和特異度。
文檔編號(hào)G01N33/50GK102175843SQ20111002257
公開(kāi)日2011年9月7日 申請(qǐng)日期2011年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月20日
發(fā)明者劉銀坤, 康曉楠, 李巖, 郭坤, 金光植 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院