專利名稱：基于sers的分析物檢測的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明歸于光譜學(xué)和分子診斷學(xué)領(lǐng)域，涉及通過在光譜學(xué)上檢測抗原/抗體結(jié)合事件(binding events)而由表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)對(duì)分析物進(jìn)行檢測的方法。具體而言，本發(fā)明針對(duì)使用表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)對(duì)分析物進(jìn)行檢測的方法，所述方法包括使分析物與至少一種分析物結(jié)合分子相接觸，該分析物結(jié)合分子通過拉曼活性分子接頭(Raman-active molecular linker)附著至使拉曼散射增強(qiáng)的金屬襯底表面；對(duì)來自所述復(fù)合體(compound)的表面增強(qiáng)拉曼信號(hào)(surface enhanced Raman signal)進(jìn)行檢測。另一方面，本發(fā)明涉及適用于所發(fā)明的基于SERS的分析物檢測方法的綴合物和生物傳感器。
背景技術(shù)：
在醫(yī)療實(shí)踐中，對(duì)疾病進(jìn)行的鑒別不僅需要識(shí)別癥狀，而且需要檢測出明確地表明其存在的具體特征。此外，在無癥狀群體中進(jìn)行的早期檢測具有極度重要性不僅促進(jìn)了早期治療，而且降低了健康維護(hù)成本。通常，只能想到通過對(duì)生物流體(如血液、尿和腦脊液)分析其循環(huán)的疾病相關(guān)生物標(biāo)志物(circulating disease-related biomarkers),來篩選疾病發(fā)展的標(biāo)記(生物標(biāo)志物)。很少能夠通過僅對(duì)一種單一的生物標(biāo)志物的檢測而實(shí)現(xiàn)精確的診斷，為了可靠的結(jié)果必須對(duì)一組標(biāo)志物進(jìn)行分析，如在多元(mul t ip I exed )分析中進(jìn)行。此外，對(duì)多種生物標(biāo)志物在疾病各階段的表達(dá)模式進(jìn)行監(jiān)測不僅能夠有助于預(yù)后(prognosis)，而且能夠使得對(duì)疾病的發(fā)展情況進(jìn)行跟蹤?，F(xiàn)在，大多數(shù)的蛋白生物標(biāo)志物分析均基于免疫分析法。這些方法通常提供了由聚合物或玻璃制成的平臺(tái)，該平臺(tái)承載著處于不同位置(界限清楚)的數(shù)種固定化抗體。這些分析包括將所述平臺(tái)暴露于樣品，隨后用一種或兩種另外的抗體進(jìn)行孵育，在上述兩步之間進(jìn)行若干個(gè)洗滌和封閉步驟(blocking steps)以增強(qiáng)分析結(jié)果的特異性。通常通過熒光檢測、發(fā)色團(tuán)吸收或比色讀數(shù)來進(jìn)行檢測。重要的是，傳統(tǒng)的免疫分析法(即ELISA和熒光免疫分析法)在每次分析中能檢測出的蛋白數(shù)量方面其可擴(kuò)展性有限。這歸因于能夠并入單個(gè)分析平臺(tái)中的感應(yīng)區(qū)(sensing area)的數(shù)量有限(原因是由于衍射極限而在讀出系統(tǒng)中可實(shí)現(xiàn)的最小激光光斑尺寸)，這對(duì)于感應(yīng)區(qū)的有用尺寸強(qiáng)加了值不小于200nm的下限，盡管實(shí)際中該尺寸通常在I U m的范圍內(nèi)。盡管可爭辯有可能對(duì)熒光免疫分析法進(jìn)行改進(jìn)、從而通過向各感應(yīng)區(qū)中并入多于一種的熒光基團(tuán)(例如，通過擴(kuò)展每個(gè)感應(yīng)區(qū)所使用的蛋白捕獲熒光信標(biāo)的數(shù)量)來對(duì)多種分析物(即蛋白/生物標(biāo)志物)同時(shí)進(jìn)行檢測，但令人遺憾的是，寬的熒光帶寬(60-90nm)使得每個(gè)感應(yīng)區(qū)的可檢測熒光基團(tuán)的最大數(shù)量被限制至約3種。換句話說，在傳統(tǒng)的免疫分析法中，每個(gè)感應(yīng)區(qū)可檢測的蛋白的最大數(shù)量無法超過3種。盡管近些年來已經(jīng)開發(fā)出了許多免疫傳感器陣列，但是仍然不存在真正快速、精確和可小型化的系統(tǒng)。振動(dòng)光譜技術(shù)即紅外(IR)、正常拉曼和表面增強(qiáng)拉曼(SER)已被考慮用于分析物檢測。由于近IR和中IR技術(shù)受到了來自水性介質(zhì)競爭吸收的限制，拉曼光譜技術(shù)逐漸成為首選的方法。拉曼散射的一個(gè)重要方面是頻移量和分子振動(dòng)模式之間的相關(guān)性。由于振動(dòng)模式對(duì)分子的化學(xué)性質(zhì)敏感，因此探測分子振動(dòng)可揭露出與其化學(xué)幾何結(jié)構(gòu)(chemicalgeometry)和與其他分子的相互作用有關(guān)的信息。雖然許多技術(shù)(如核磁共振(NMR)和X-射線晶體學(xué))也可以提供得知化學(xué)結(jié)構(gòu)的方法，但是因?yàn)橐子谥苽錁悠?，通過拉曼散射對(duì)振動(dòng)狀態(tài)進(jìn)行光學(xué)測量提供了更方便的途徑。出于這一原因，對(duì)于每種分子而言獨(dú)一無二的拉曼光譜在未知物質(zhì)種類(species)的識(shí)別中已被用作“指紋”;并且在更感興趣的方面，拉曼散射被用于闡明構(gòu)象變化。然而，在生物學(xué)情況下，這些應(yīng)用受到限制，主要是由于弱的敏感性和對(duì)高激光功率以及復(fù)雜儀器的需要。通過表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)的開發(fā)克服了這些缺點(diǎn)中的大多 數(shù)，所述SERS中的光譜強(qiáng)度通過SERS活性分析物分子與襯底表面(例如，銅、金或銀的納米顆粒表面)的相互作用得以極大地增強(qiáng)。這些增強(qiáng)因子達(dá)到了單分子探測的水平有許多實(shí)例(Nicholas & Ricardo，Chem. Soc. Rev.，2008，37，946-954)。然而，對(duì)具有此類超乎尋常的敏感性的分子進(jìn)行檢測仍然依賴于分子納米顆粒集合體(ensemble)的性質(zhì)，并且目前局限于某些種類的SERS活性分子。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明允許將基于SERS的檢測擴(kuò)展至能夠?qū)γ總€(gè)感應(yīng)區(qū)的多個(gè)蛋白進(jìn)行檢測的高度多元的系統(tǒng)。與免疫分析法相反，該檢測不需要二抗或三抗，因此，使材料損耗減到最少。此外，由于以分子指紋檢測為基礎(chǔ)，本發(fā)明既不需要有色的底物也不需要外部的標(biāo)記物(labeler)。在另外的方面，本發(fā)明的分析設(shè)計(jì)并不需要多個(gè)洗滌步驟。事實(shí)上，無洗滌步驟或僅有一個(gè)洗滌步驟足以實(shí)現(xiàn)檢測。在第一方面，本發(fā)明由此涉及使用表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)對(duì)一種或多種分析物進(jìn)行檢測的方法，所述方法包括-使一種或多種分析物與至少一種分析物結(jié)合分子相接觸，該分析物結(jié)合分子通過拉曼活性分子接頭附著至使拉曼散射增強(qiáng)的金屬襯底表面；以及-對(duì)來自所述復(fù)合體的表面增強(qiáng)拉曼信號(hào)進(jìn)行檢測。在這一方法的各種實(shí)施方式中，復(fù)合體的表面增強(qiáng)拉曼信號(hào)與分析物的量相關(guān)。分析物可被包含于樣品中，并且檢測可在體外進(jìn)行。在所發(fā)明的方法的一個(gè)實(shí)施方式中，在包含所述分析物的體液中對(duì)分析物進(jìn)行檢測。所述體液可選自于由血漿、血清、血液、淋巴液(lymph)、liquor和尿所組成的組。在所請(qǐng)求保護(hù)的方法的各種實(shí)施方式中，分析物為蛋白、肽、核酸、碳水化合物、月旨質(zhì)、細(xì)胞、病毒、小分子或半抗原。在一個(gè)實(shí)施方式中，分析物結(jié)合分子與分析物特異性地結(jié)合。所述分析物結(jié)合分子可選自于由抗體、抗體片段或抗體樣分子(antibody like molecules)所組成的組。如果分析物結(jié)合分子為抗體，所述抗體可為單克隆抗體或多克隆抗體。該方法還可以是用于對(duì)多于一種的分析物進(jìn)行檢測的多元方法(mu 11 i p I eXmethod),其中,在接觸步驟中使用多于一種的分析物結(jié)合分子。在所述方法的各種實(shí)施方式中，分析物結(jié)合分子共價(jià)偶聯(lián)至拉曼活性分子接頭，該拉曼活性分子接頭通過共價(jià)相互作用附著至襯底表面。拉曼活性分子接頭化合物可選自于由如下物質(zhì)所組成的組6_巰基嘌呤、8-氮雜-腺嘌呤、N-苯甲?；汆堰?、2-巰基-苯并咪唑、4-氨基-吡唑[3，4-d]嘧啶、玉米素、亞甲基藍(lán)、9-氨基-吖啶、溴化乙錠、俾斯麥棕Y、N-芐基-氨基嘌呤、硫堇醋酸鹽、3，6- 二氨基吖啶、6-氰基嘌呤、4-氨基-5-咪唑-甲酰胺鹽酸鹽、1，3-二亞氨基異吲哚啉、羅丹明6G、結(jié)晶紫、堿性品紅、苯胺藍(lán)二銨鹽、N-[(3-(苯胺基亞甲基)-2-氯-I-環(huán)己烯-I-基)亞甲基]苯胺單鹽酸鹽、0-(7-氮雜苯并三唑-I-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲鎗六氟磷酸鹽、9-氨基芴鹽酸鹽、堿性藍(lán)、1，8_ 二氨基-4，5- 二羥基蒽醌、原黃素半硫酸鹽水合物、2-氨基-1，I, 3-三氰基丙烯、變胺藍(lán)RT
鹽、4，5，6-三氨基嘧啶硫酸鹽、2-氨基-苯并噻唑、三聚氰胺、3-(3-吡啶基甲基氨基)丙腈、磺胺嘧啶銀(I)、吖啶黃素、4-氨基-6-巰基吡唑[3，4-d]嘧啶、2-氨基嘌呤、腺嘌呤硫醇FAD氟腺嘌呤、4-氨基-6-巰基吡唑[3，4-d]嘧啶、羅丹明110、腺嘌呤、5-氨基-2-巰基苯并咪唑、吖啶橙鹽酸鹽、醋酸甲酚紫、中性吖啶黃素、溴甲菲啶、5，10，15，20-四(N-甲基-4-吡啶基)卟啉四(對(duì)甲苯磺酸鹽)、5，10，15，20-四(4-三甲基氨基苯基)卟啉四(對(duì)甲苯磺酸鹽)、3，5- 二氨基R丫卩定鹽酸鹽、碘化丙唳(3, 8- 二氨基-5-(3- 二乙基氨基丙基)-6-苯基菲唳鐵碘化甲碘化物)、反式-4-[4-( 二甲基氨基)苯乙烯基]-I-甲基卩比卩定鐵碘化物；和4-((4-( 二甲基氨基)苯基)偶氮基)苯甲酸、其琥珀酰亞胺酯；或上述物質(zhì)的衍生物。優(yōu)選地，拉曼活性分子接頭為包含硫醇基團(tuán)的化合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述拉曼活性接頭分子為6-巰基嘌呤。在所發(fā)明的方法的各種實(shí)施方式中，分析物結(jié)合分子通過形成酰胺鍵共價(jià)偶聯(lián)至拉曼活性分子接頭。對(duì)于這一偶聯(lián)，可將碳二亞胺、如I-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺用作偶聯(lián)劑。在各種實(shí)施方式中，金屬襯底表面由貴金屬或銅制成。所述貴金屬可選自于由銀和金所組成的組。在某些實(shí)施方式中,襯底為納米顆粒。所述納米顆?？砂挥匈F金屬或由貴金屬組成。所述貴金屬可例如選自金和銀。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，納米顆粒包被有銀膜。在另一具體的實(shí)施方式中，納米顆粒為用檸檬酸鹽穩(wěn)定化的金納米顆粒。在另一方面，本發(fā)明涉及用于對(duì)分析物使用表面增強(qiáng)拉曼光譜進(jìn)行檢測的綴合物，所述綴合物包含分析物結(jié)合分子、拉曼活性接頭分子和金屬襯底，其中，分析物結(jié)合分子共價(jià)偶聯(lián)至拉曼活性接頭分子，拉曼活性接頭分子共價(jià)附著至金屬襯底。在該綴合物中，分析物結(jié)合分子和/或拉曼活性接頭分子和/或金屬襯底可如上文所定義，并與所發(fā)明的方法相關(guān)。在又一方面，本發(fā)明針對(duì)使用表面增強(qiáng)拉曼光譜對(duì)分析物進(jìn)行檢測的生物傳感器，所述生物傳感器包含一種或多種如本發(fā)明所述的綴合物。該生物傳感器可進(jìn)一步包含襯底，其中，納米顆粒粘附至襯底。在各種實(shí)施方式中，該生物傳感器被裝配用于體內(nèi)和/或體外用途。分析物可為蛋白、肽、核酸、碳水化合物、脂質(zhì)、細(xì)胞、病毒、小分子或半抗原。
在另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的生物傳感器用于分析物檢測的用途。該檢測可在體內(nèi)或體外進(jìn)行。


圖I示意性地示出基于SERS的納米級(jí)傳感器的原理。圖2示意性地示出基于SERS的多元納米級(jí)傳感器的原理。圖3為用于SERS測量的實(shí)驗(yàn)設(shè)備的示意圖。
圖4顯示出來源于如本發(fā)明所述傳感器的SERS光譜，使用6_巰基嘌呤(6_MP)作為拉曼活性接頭分子。圖5顯示出基于SERS的傳感器隨抗原濃度變化的響應(yīng)曲線。圖6顯示出以100%功率、IOs采集和I次積累得到的潔凈襯底的光譜。三條曲線代表了三次測量A、B和C的光譜。圖7顯示出以10%功率、30s采集和2次積累得到的包被有6-MP的Au IME襯底的光譜。三條曲線代表了三次測量A、B和C的光譜。圖8顯示出以10%功率、30s采集和2次積累得到的包被有6_MP_抗p53的Au IME襯底的光譜。三條曲線代表了三次測量A、B和C的光譜。圖9顯示出在p53存在的情況下，以10%功率、30s采集和2次積累得到的包被有6-MP-抗p53的Au IME襯底的光譜。三條曲線代表了三次測量A、B和C的光譜。圖10顯示出以10%功率、30s采集和2次積累得到的包被有6_MP_抗p53的AuME襯底(沖洗后)的光譜。三條曲線代表了三次測量A、B和C的光譜。圖11顯示出圖7、圖8、圖9和圖10的所有“A”光譜的層疊。當(dāng)加入抗p53和p53時(shí)沒有觀察到新的峰。圖12顯示出綴合有抗p53的生物傳感器各自的光譜，三次測量為a) A、b) B和c)C0圖13顯示出綴合有抗p53并用p53孵育的生物傳感器各自的光譜，三次測量為a)A、b)B 和 c)C。圖14顯示出在用PBS對(duì)生物傳感器進(jìn)行沖洗后，綴合有抗p53并用p53孵育的生物傳感器各自的光譜，三次測量為8)八、13)8和(3)(。圖15顯示出圖12、圖13和圖14經(jīng)疊加后的光譜。
具體實(shí)施例方式當(dāng)分子與攜帶低于其第一電子躍遷的光子能量的單色光相互作用時(shí)，可發(fā)生兩種光學(xué)過程。在第一種占主導(dǎo)地位的過程中，大部分的入射光被彈性散射，而光子能量未被吸收；這被稱為瑞利散射(Rayleigh scattering)。第二種相對(duì)較弱的過程涉及少量的入射光子能量被分子系統(tǒng)吸收，然后該分子系統(tǒng)經(jīng)歷從一種振動(dòng)狀態(tài)到另一振動(dòng)狀態(tài)的轉(zhuǎn)變，接下來以從入射頻率所“遷移”的頻率進(jìn)行隨后的光的二次發(fā)射，這一光學(xué)作用在傳統(tǒng)上被稱為拉曼散射。拉曼散射的一個(gè)重要方面是頻移量和分子振動(dòng)模式之間的相關(guān)性，這里，振動(dòng)模式是指分子振動(dòng)的“方式”。由于振動(dòng)模式對(duì)分子的化學(xué)性質(zhì)敏感，因此探測分子振動(dòng)可揭露出與其化學(xué)幾何結(jié)構(gòu)有關(guān)的信息。雖然許多技術(shù)(如核磁共振(NMR)和X-射線晶體學(xué))也可以提供得知化學(xué)結(jié)構(gòu)的方法，但是因?yàn)橐子谥苽錁悠罚ㄟ^拉曼散射對(duì)振動(dòng)狀態(tài)進(jìn)行光學(xué)測量提供了更方便的途徑(Garman E & Sweet RM,Methods Mol Biol.，2007，364，63-94 ;Chen J & Brooks CL，Prot.，2007，67 (4)，922-930)。出于這一原因，對(duì)于每種分子獨(dú)一無二的拉曼光譜在未知物質(zhì)種類的識(shí)別中已被用作“指紋”；并且在更感興趣的方面，拉曼散射被用于闡明構(gòu)象變化。盡管其具有高特異性，但由于拉曼散射的低效率，拉曼光譜的用途受到限制。據(jù)估計(jì)，每IO6-IO8個(gè)散射光子中僅有I個(gè)為拉曼散射，這導(dǎo)致拉曼信號(hào)非常弱。Fleischman等在1974年首次觀察到了表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS),對(duì)于吸附在電化學(xué)粗糙的銀電極上的卩比唳得到了非常強(qiáng)的拉曼信號(hào)(Fleischman M等，Chem. Phys.Lett.，1974，26，123)。對(duì)于引起拉曼散射中的這一增強(qiáng)作用(可高達(dá)未增強(qiáng)信號(hào)的IO14倍)而言，有兩種機(jī)制已被廣泛接受(Kneipp K等，Chem. Rev.，1999，99 (10)，2957-2976)。這兩種機(jī)制為電磁增強(qiáng)作用和化學(xué)增強(qiáng)作用。
電磁增強(qiáng)作用占到了上述增強(qiáng)作用中的大多數(shù)(其因子為IO4-IO7),由金屬表面吸附的或非常接近于金屬表面的分析物與激光束在金屬中激發(fā)的表面等離子體激元場(surface plasmon fields)之間的相互作用產(chǎn)生(Moskovits M, J. Raman Spectro. , 2005,36 (6-7),485-496)。位于金屬表面的傳導(dǎo)電子顯示出側(cè)向運(yùn)動(dòng)自由度，這是由于它們僅僅受到“主體(bulk)”金屬一側(cè)的正電荷的限制。當(dāng)光與這些電子相互作用時(shí)，它們一起振蕩，這一振蕩被稱為表面等離子體激元(surface plasmon)。在粗糙表面上,振蕩被局域化并垂直于表面平面，產(chǎn)生局部放大的電磁場，這成為SERS作用的原因。局域表面等離子激元(LSP)具有使光的吸收和散射最有效地發(fā)生的共振頻率。這一頻率取決于表面的性質(zhì)(尺寸、粗糙度、形狀、顆粒間距和介電環(huán)境)和金屬(Kelly KL等，J. Phys. Chem. B，2003，107 (3)，668-677)。這在SERS襯底的制造中具有重要性，因?yàn)槿藗儠?huì)想要操控共振頻率來接近用以確保最大增強(qiáng)作用的激發(fā)頻率(Haynes CL & Van DuyneRP, J.Phys. Chem. B，2003，107(30)，7426-7433)?；瘜W(xué)增強(qiáng)作用被認(rèn)為對(duì)總的增強(qiáng)作用僅貢獻(xiàn)了 IO-IO2的數(shù)量級(jí)(Liang EJ &Kiefer W，J. Raman Spectro. ,1996,27 (12)，879-885)?；瘜W(xué)增強(qiáng)作用涉及分析物和金屬表面之間的電子耦合，所述電子耦合改變了分子的極化度；以及在拉曼散射中作為共振中間體的表面物質(zhì)種類的形成。同時(shí)，人們已經(jīng)提出了分析物和金屬之間的電荷轉(zhuǎn)移機(jī)制。SERS襯底通常是指良好設(shè)計(jì)的金屬納米結(jié)構(gòu)，分析物吸附在該金屬納米結(jié)構(gòu)上用于進(jìn)行SERS采集(acquisition)。存在著三類SERS襯底粗糙的金屬表面；膠態(tài)金屬納米顆粒；和平面金屬結(jié)構(gòu)，例如在平面襯底、如玻璃上支持的金屬納米顆粒陣列(Vo-Dinh T，Trac-Trends. Anal. Chem. , 1998,17(8-9),557-582 ；Baker GA & Moore DS,Anal. Bioanal.Chem.，2005，382 (8)，1751-1770)。如上所述，作為SERS增強(qiáng)作用的原因的LSP高度依賴于SERS襯底的表面特征，使得SERS成為表面敏感技術(shù)。由于蛋白為弱的拉曼散射體，使用SERS無法容易地檢測到它們與襯底的結(jié)合。然而，本發(fā)明的發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)，使用基于SERS的納米級(jí)應(yīng)力傳感器可對(duì)蛋白進(jìn)行檢測。在這一裝置(setup)中，將分析物結(jié)合分子(如抗體)偶聯(lián)至固定有SERS活性物質(zhì)的襯底。作為分析物結(jié)合事件的結(jié)果，通過使SERS活性物質(zhì)與襯底和/或抗體的鍵受到應(yīng)力(例如拉伸和壓縮)，誘導(dǎo)了 SERS光譜中可檢測的位移。令人驚奇的是，這使得可以對(duì)分析物結(jié)合進(jìn)行高靈敏度和特異性的檢測。因此，在第一方面，本發(fā)明針對(duì)使用表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)對(duì)一種或多種分析物進(jìn)行檢測的方法，所述方法包括-使一種或多種分析物與至少一種分析物結(jié)合分子相接觸，該分析物結(jié)合分子通過拉曼活性分子接頭附著至使拉曼散射增強(qiáng)的金屬襯底表面；以及-對(duì)來自所述復(fù)合體的表面增強(qiáng)拉曼信號(hào)進(jìn)行檢測。本文中的術(shù)語“至少一個(gè)”或“一個(gè)或多個(gè)”可互換使用，就分子而論時(shí)是指I個(gè)、2個(gè)、或3個(gè)以上，例如至少I個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)、12個(gè)、14個(gè)、15個(gè)、20個(gè)、25個(gè)或大量分子。就此而論,術(shù)語“大量(a plurality of)”意味著多于兩個(gè)，優(yōu)選3-100個(gè)。
本文所使用的術(shù)語“分析物結(jié)合分子”是指能夠與所選擇的分析物結(jié)合，從而形成由分析物結(jié)合分子和分析物組成的復(fù)合物(complex)的任何分子。優(yōu)選地，這一結(jié)合是特異性的，從而使分析物和分析物結(jié)合分子之間形成特異性的復(fù)合物。本文所使用的“特異性地結(jié)合”和“特異性結(jié)合”意味著分析物結(jié)合分子基于對(duì)靶分子上的表位(epitope)或結(jié)合區(qū)域的識(shí)別而結(jié)合至祀分析物。相比于結(jié)合至樣品中的其他化合物，分析物結(jié)合分子優(yōu)選以更高的結(jié)合親和力(binding affinity)來識(shí)別并結(jié)合至靶分子。在本發(fā)明的各種實(shí)施方式中，“特異性地結(jié)合”可意味著相比于結(jié)合至與靶分子無關(guān)的分子，抗體或其他生物分子以高出至少約IO6倍的親和力、優(yōu)選至少約IO7倍的親和力、更優(yōu)選至少約IO8倍的親和力、最優(yōu)選至少約IO9倍的親和力結(jié)合至靶分子。一般而言，特異性結(jié)合是指比非特異性結(jié)合高出約IO6倍到約IO9倍的親和力。在某些實(shí)施方式中，特異性結(jié)合其特征可在于比非特異性結(jié)合高出IO9倍的親和力。可通過任何合適的方法對(duì)結(jié)合親和力進(jìn)行測定。這類方法是本領(lǐng)域已知的，包括但不限于表面等離子體激元共振和等溫滴定量熱法。在具體的實(shí)施方式中，分析物結(jié)合分子唯一地識(shí)別并結(jié)合至靶分析物。分析物結(jié)合分子可以是蛋白質(zhì)分子、例如抗體(如單克隆抗體或多克隆抗體)，在特異性的決定簇(determinant)或表位處免疫學(xué)意義上結(jié)合至祀分析物。術(shù)語“抗體”以廣義使用，具體而言覆蓋了單克隆抗體以及抗體變型或片段(例如，F(xiàn)ab、F(ab’)2、scFv、Fv雙體抗體(diabody)和線性抗體)，只要它們顯示出期望的結(jié)合活性。本文所使用的術(shù)語“單克隆抗體”是指從實(shí)質(zhì)上均一的抗體群中得到的抗體，SP，除了可能以較小的量存在的天然發(fā)生的突變外，該群包含的個(gè)體抗體是一致的。單克隆抗體是高度特異性的，針對(duì)單一的抗原位點(diǎn)。此外，與通常包含針對(duì)不同決定簇(表位)的不同抗體的傳統(tǒng)(多克隆)抗體制劑相反，各單克隆抗體針對(duì)抗原上的單一決定簇。除了它們的特異性之外，單克隆抗體具有以下優(yōu)點(diǎn)可通過雜交瘤培養(yǎng)合成單克隆抗體，不會(huì)受到其它免疫球蛋白污染。修飾語“單克隆”表示從實(shí)質(zhì)上均一的抗體群中得到抗體這一特征，不應(yīng)被理解為需要通過任何特定的方法生產(chǎn)抗體。單克隆抗體可包含“嵌合”抗體和人源化抗體?！扒逗稀笨贵w為不同部分源自于不同動(dòng)物物種的分子，例如具有來源于鼠mAb的可變區(qū)和人免疫球蛋白恒定區(qū)的分子。通過由培養(yǎng)物中的傳代細(xì)胞系提供產(chǎn)生抗體分子的任何技術(shù)可得到單克隆抗體。這些技術(shù)包括但不限于Koehler和Milstein的雜交瘤技術(shù)(美國專利號(hào)4，376，110)、人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)和EBV-雜交瘤技術(shù)。這類抗體可為包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD以及它們的任何亞類在內(nèi)的任何免疫球蛋白種類?？稍隗w外或在體內(nèi)對(duì)產(chǎn)生mAb的雜交瘤進(jìn)行培養(yǎng)。在體內(nèi)產(chǎn)生高滴度HlAbs使之成為非常有效的生產(chǎn)方法?！岸嗫寺】贵w”為來源于用抗原或其抗原性功能衍生物(antigenic functionderivative)免疫的動(dòng)物血清的、非均一的抗體分子群。對(duì)于多克隆抗體的生產(chǎn),可通過注射任選補(bǔ)充有佐劑的抗原或半抗原-載體綴合物來對(duì)宿主動(dòng)物如兔子、小鼠和山羊進(jìn)行免疫?；蛘?，可使用單鏈抗體生產(chǎn)的技術(shù)(美國專利號(hào)4，946，778)來生產(chǎn)合適的單鏈抗體。一般通過氨基酸橋接使Fv區(qū)的重鏈片段和輕鏈片段連接、產(chǎn)生單鏈多肽而形成單鏈抗體。可通過已知技術(shù)生成識(shí)別特異性表位的抗體片段。例如，這類片段包括但不限于 可通過胃蛋白酶消化抗體分子而產(chǎn)生的F(ab’)2片段、可通過對(duì)F(ab’)2片段的二硫鍵進(jìn)行還原而生成的Fab片段。或者，可構(gòu)建Fab表達(dá)庫，使得可以快速且容易地鑒定具有期望的特異性的單克隆Fab片段。分析物結(jié)合分子還可為已發(fā)生修改或突變，從而以足夠的結(jié)合親和力來結(jié)合給定配體的任何其它蛋白支架(proteinaceous scaffold)。有用的支架的實(shí)例包括在美國專利申請(qǐng)2005/0089932或美國專利6，682，736中所述的支架。合適的支架的其它實(shí)例為例如在下述國際專利申請(qǐng)中所述的脂質(zhì)運(yùn)載蛋白家族(lipocalin protein family)的成員W099/16873, WO 00/75308、WO 03/029471、WO03/029462、TO 03/029463、WO 2005/019254, WO 2005/019255 或 WO 2005/019256。按照上述，除脂質(zhì)運(yùn)載蛋白家族的成員之外，支架包括但不限于EGF樣結(jié)構(gòu)域、Kringle結(jié)構(gòu)域、I型纖連蛋白結(jié)構(gòu)域、II型纖連蛋白結(jié)構(gòu)域、III型纖連蛋白結(jié)構(gòu)域、PAN結(jié)構(gòu)域、Gla結(jié)構(gòu)域、SRCR結(jié)構(gòu)域、Kunitz/牛胰腺的胰蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)域、淀粉酶抑肽、Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)域、三葉草(P-型)結(jié)構(gòu)域、C型von Willebrand因子結(jié)構(gòu)域、過敏毒素樣結(jié)構(gòu)域、CUB結(jié)構(gòu)域、I型甲狀腺球蛋白重復(fù)體(repeat)、A類LDL-受體結(jié)構(gòu)域、Sushi結(jié)構(gòu)域、Link結(jié)構(gòu)域、I型血小板反應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)域、免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域或免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域(例如，結(jié)構(gòu)域抗體或駱駝重鏈抗體)、C型凝集素結(jié)構(gòu)域、MAM結(jié)構(gòu)域、A型von Willebrand因子結(jié)構(gòu)域、促生長因子B結(jié)構(gòu)域、WAP型四個(gè)二硫鍵核心的結(jié)構(gòu)域、C型F5/8結(jié)構(gòu)域、血紅素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域、SH2結(jié)構(gòu)域、SH3結(jié)構(gòu)域、層粘連蛋白型EGF樣結(jié)構(gòu)域、C2 結(jié)構(gòu)域、Kappabodies、微抗體、Janusins、納米抗體(nanobody)、adnectin、四連接素、微體(microbody)、affilin、親合體(affibody)或錨蛋白、晶狀體蛋白、打結(jié)素(knottin)、泛素、鋅指蛋白、錨蛋白或錨蛋白重復(fù)蛋白或富含亮氨酸重復(fù)蛋白、avimer ;以及通過人受體結(jié)構(gòu)域家族的外顯子改組發(fā)展出的多價(jià)avimer蛋白。如上所述，在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，分析物結(jié)合分子可為脂質(zhì)運(yùn)載蛋白家族成員的突變蛋白。在這些實(shí)施方式中的一些中，脂質(zhì)運(yùn)載蛋白折疊的￠-桶狀結(jié)構(gòu)的開口端(涵蓋了脂質(zhì)運(yùn)載蛋白家族的天然配體結(jié)合位點(diǎn))被用于形成靶分析物結(jié)合位點(diǎn)。蛋白的脂質(zhì)運(yùn)載蛋白家族的成員包括但不限于Pieris brassicae的膽汁三烯結(jié)合蛋白(SWISS-PR0T數(shù)據(jù)庫登錄號(hào)P09464)、人淚脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(SWISS-PR0T數(shù)據(jù)庫登錄號(hào)M90424)、人載脂蛋白D (SWISS-PR0T數(shù)據(jù)庫登錄號(hào)P05090)、視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)(例如人或豬來源；人RBP的SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫登錄號(hào)P02753 ;豬RBP的SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫登錄號(hào)P27485)、人嗜中性明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(hNGAL，SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫登錄號(hào)P80188)、大鼠a2-微球蛋白相關(guān)蛋白(A2m，(SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫登錄號(hào)P31052)、和小鼠24p3/uterocalin (24p3, (SWISS-PROT 數(shù)據(jù)庫登錄號(hào) P11672)、褐鼠(Rattus norvegicus)的 Von Ebners 腺蛋白 2(VEG 蛋白 2 ;SWISS-PROT 數(shù)據(jù)庫登錄號(hào) P41244)、豬(Sus scrofra)(pig)的Von Ebners腺蛋白2 (LCN1 ；SffISS-PROT數(shù)據(jù)庫登錄號(hào)P53715)、狗的主要變態(tài)反應(yīng)原Can fl前體(ALL 1，SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫登錄號(hào)018873)、以及煙草天蛾(Manductasexta)的蟲青素A或蟲青素B (SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫登錄號(hào)分別為P00305和Q00630)。分析物結(jié)合分子還可為能夠與配體(一般為多肽配體或糖肽配體)形成結(jié)合復(fù)合物的結(jié)合蛋白、受體或其胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，上述給出的非限制性實(shí)例描述了作為分析物結(jié)合分子的各種形式的抗體，上述非限制性實(shí)例還可以延伸至其它蛋白受體，例如重組、嵌合、雜交、 截短等形式的非抗體受體。分析物結(jié)合分子還可以是非蛋白質(zhì)受體，例如基于核酸的分子、如適體或Spiegelmer (由L-核糖核苷酸制成的適體)。在分析物結(jié)合分子為蛋白質(zhì)分子的情況下，分析物結(jié)合分子可通過形成酰胺鍵共價(jià)偶聯(lián)至拉曼活性分子接頭?？赏ㄟ^碳二亞胺偶聯(lián)實(shí)現(xiàn)這一共價(jià)偶聯(lián)，例如使用I-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺作為偶聯(lián)劑。所述偶聯(lián)可經(jīng)由N-端或C-端或經(jīng)由蛋白的一個(gè)或多個(gè)氨基酸側(cè)鏈進(jìn)行。可用于這一共價(jià)偶聯(lián)的側(cè)鏈包括但不限于賴氨酸側(cè)鏈、組氨酸側(cè)鏈、半胱氨酸側(cè)鏈、酪氨酸側(cè)鏈、絲氨酸側(cè)鏈、蘇氨酸側(cè)鏈、天冬氨酸側(cè)鏈和谷氨酸側(cè)鏈。術(shù)語“接頭”或“接頭分子”是指下述拉曼活性分子將分析物結(jié)合分子連接至襯底表面，并通過SERS信號(hào)變化來促進(jìn)對(duì)分析物進(jìn)行的檢測，該分析物與分析物結(jié)合分子特異性結(jié)合。拉曼活性分子與襯底表面相互作用，并因此提供了 SERS信號(hào)。原則上，可使用滿足下述條件的任何分子與拉曼活性表面相互作用時(shí)可生成SERS信號(hào)，并且因?yàn)橛山Y(jié)合至分析物結(jié)合蛋白的分析物所引起的分子應(yīng)力，產(chǎn)生SERS信號(hào)變化。拉曼活性分子接頭可選自于各種已知的拉曼活性化合物，所述拉曼活性化合物包括但不限于6_巰基嘌呤、8-氮雜-腺嘌呤、N-苯甲?；汆堰省?-巰基-苯并咪唑、4-氨基-吡唑[3，4-d]嘧啶、玉米素、亞甲基藍(lán)、9-氨基-吖啶、溴化乙錠、俾斯麥棕Y、N-芐基-氨基嘌呤、硫堇醋酸鹽、3，6- 二氨基吖啶、6-氰基嘌呤、4-氨基-5-咪唑-甲酰胺鹽酸鹽、1，3- 二亞氨基異吲哚啉、羅丹明6G、結(jié)晶紫、堿性品紅、苯胺藍(lán)二銨鹽、N-[ (3-(苯胺基亞甲基)-2-氯-I-環(huán)己烯-I-基)亞甲基]苯胺單鹽酸鹽、0-(7-氮雜苯并三唑-I-基)-N，N，N’，N’ -四甲基脲鎗六氟磷酸鹽、9-氨基芴鹽酸鹽、堿性藍(lán)、1，8- 二氨基-4，5- 二羥基蒽醌、原黃素半硫酸鹽水合物、2-氨基-1，I, 3-三氰基丙烯、變胺藍(lán)RT鹽、4，5，6-三氨基嘧啶硫酸鹽、2-氨基-苯并噻唑、三聚氰胺、3-(3-吡啶基甲基氨基)丙腈、磺胺嘧啶銀(I)、吖啶黃素、4-氨基-6-巰基吡唑[3，4-d]嘧啶、2-氨基嘌呤、腺嘌呤硫醇FAD氟腺嘌呤、4-氨基-6-巰基吡唑[3，4_d]嘧啶、羅丹明110、腺嘌呤、5-氨基-2-巰基苯并咪唑、吖啶橙鹽酸鹽、醋酸甲酚紫、中性吖啶黃素、溴甲菲啶、5，10, 15，20-四(N-甲基-4-吡啶基)卟啉四(對(duì)甲苯磺酸鹽)、5，10, 15，20-四(4-三甲基氨基苯基)卟啉四(對(duì)甲苯磺酸鹽)、3，5-二氨基吖啶鹽酸鹽、碘化丙啶(3，8-二氨基-5-(3- 二乙基氨基丙基)-6-苯基菲啶鎗碘化甲碘化物)、反式-4-[4-( 二甲基氨基)苯乙烯基]-I-甲基吡啶鹽碘化物；和4-((4-( 二甲基氨基)苯基)偶氮基)苯甲酸、其琥珀酰亞胺酯；以及上述物質(zhì)的衍生物?！把苌铩笔侵附Y(jié)構(gòu)上與母體化合物密切相關(guān)的經(jīng)修飾的化合物。優(yōu)選的衍生物為經(jīng)過修飾從而包含硫醇(SH)基團(tuán)的化合物。所述硫醇基團(tuán)使得接頭分子共價(jià)偶聯(lián)至金屬表面。因此，在本發(fā)明方法包括的實(shí)施方式中，拉曼活性分子接頭通過共價(jià)相互作用附著至襯底表面。術(shù)語“分析物”、“靶化合物”、“靶分子”或“靶”在本文中可互換使用，是指可通過結(jié)合至結(jié)合分子而在分析中被檢測的任何物質(zhì)；在一個(gè)實(shí)施方式中，上述物質(zhì)可存在于樣品中。因此，分析物可為存在其天然抗體或可制備出其抗體的任何物質(zhì)，但不限于此。例如，分析物可為抗原、蛋白、多肽、核酸、半抗原、碳水化合物、脂質(zhì)、細(xì)胞或任何其它各種生物或非生物的分子、復(fù)合物或其組合。通常，分析物將會(huì)是來源于生物來源(如細(xì)菌樣品、真菌樣品、病毒樣品、植物樣品或動(dòng)物樣品)的蛋白、肽、碳水化合物或脂質(zhì)。此外，然而，靶還可以是小的有機(jī)化合物，例如藥物、藥物代謝物、染料或在樣品中存在的其它小分子。
本文所使用的術(shù)語“樣品”是指一份材料，通常是指來源于生物材料的生物基質(zhì)、水性溶液或水性懸浮液。通過本發(fā)明的方法對(duì)分析物的存在進(jìn)行分析的樣品包括例如細(xì)胞、組織、勻漿、裂解物、提取物和經(jīng)純化或部分純化的蛋白、和其它生物分子；以及上述物質(zhì)的混合物。典型地用于本發(fā)明方法中的樣品的非限制性實(shí)例包括人和動(dòng)物的體液，如全血、血清、血漿、腦脊液、痰液、支氣管沖洗液、支氣管吸出物、尿、精液、淋巴液，以及呼吸道、腸道和生殖泌尿道的各種外分泌物、淚、唾液、乳汁、白血球、骨髓瘤等；生物流體，如細(xì)胞培養(yǎng)物上清液；可固定或未固定的組織標(biāo)本；以及可固定或未固定的細(xì)胞標(biāo)本。本發(fā)明方法中使用的樣品將基于分析形式以及待分析的組織、細(xì)胞、提取物或其它材料(特別是生物材料)的性質(zhì)而變化。對(duì)來自細(xì)胞或樣品的蛋白提取物進(jìn)行制備的方法是本領(lǐng)域公知的，并可被容易地修改，從而得到與本發(fā)明的方法相容的樣品。對(duì)體液的檢測也可以在體內(nèi)進(jìn)行，即，在不用首先收集樣品的情況下進(jìn)行?！半摹狈褐竿ㄟ^肽鍵連接的氨基酸短鏈。一般情況下，肽包括具有約2-100個(gè)、更典型地約4-50個(gè)、最常見約6-20個(gè)氨基酸的氨基酸鏈?！岸嚯摹狈褐竿ǔ１入母L的、單獨(dú)的直鏈或支鏈氨基酸序列。“多肽”通常在長度上包含至少約20-1000個(gè)氨基酸、更典型地至少約100-600個(gè)氨基酸、通常至少約200到約500個(gè)氨基酸。包括在內(nèi)的還有一種具體氨基酸的均聚物，例如聚賴氨酸?！暗鞍住卑▎螚l多肽，還包括多條多肽鏈的復(fù)合物，所述多條多肽鏈可以相同或不同。蛋白中的多條鏈可通過二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)和四級(jí)結(jié)構(gòu)以及氨基酸序列一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，多條鏈可以例如通過二硫鍵連在一起，并且可包含合成后修飾，例如但不限于糖基化作用、磷酸化作用、截短或其它加工。舉例來說，諸如IgG蛋白的抗體一般由通過二硫鍵連在一起的四條多肽鏈(SP，兩條重鏈和兩條輕鏈)組成。此外，蛋白可包含另外的組分，例如關(guān)聯(lián)金屬(associatedmetal)(例如，鐵、銅和硫)或其它部分。肽、多肽和蛋白的定義包括但不限于生物學(xué)上的活性和非活性形式；變性和天然形式；以及其變體形式、修飾形式、截短形式、雜交形式和嵌合形式。
術(shù)語“接觸”或“孵育”在本文中可互換使用，通常是指使一種組分、試劑、分析物或樣品接近另一種。例如，接觸可包括將包含分析物結(jié)合蛋白或其綴合物的溶液與樣品混合。包含一種組分、試劑、分析物或樣品的溶液還可包含其它組分或試劑、如二甲基亞砜(DMSO)或去污劑，所述其它組分或試劑促進(jìn)混合、相互作用、攝取或?qū)M分、試劑、分析物和/或樣品之間的接觸有利的其它物理或化學(xué)現(xiàn)象。本文所使用的術(shù)語“檢測”是指證實(shí)給定分子的存在的方法。實(shí)現(xiàn)這一目的所使用的技術(shù)是表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)。所述檢測還可以是定量的，S卩，包括將被檢測信號(hào)與分析物的量相關(guān)聯(lián)。檢測包括體外檢測和體內(nèi)檢測。本文所使用的術(shù)語“半抗原”是指能夠被抗體識(shí)別的、小的蛋白質(zhì)抗原決定簇或非蛋白抗原決定簇。一般情況下，除部分較大的物質(zhì)種類之外，半抗原并不會(huì)在動(dòng)物體內(nèi)誘發(fā)抗體形成。例如，小的肽半抗原常常偶聯(lián)至載體蛋白、如鑰孔戚血藍(lán)蛋白(keyhole limpethemocyanin),從而產(chǎn)生抗半抗原抗體應(yīng)答?！翱乖笔悄軌蛟趧?dòng)物體內(nèi)引起抗體應(yīng)答并被所得到的抗體識(shí)別的大分子?？乖桶肟乖瓋烧呔辽僖粋€(gè)抗原決定簇或“表位”，所述抗原決定簇或“表位”是抗原或半抗 原結(jié)合至抗體的區(qū)域。一般情況下，半抗原上的表位為整個(gè)分子。本發(fā)明的方法還可以是用于檢測多于一種分析物、即兩種或多種不同分析物的多元方法。這通常需要在接觸步驟中使用多于一種的分析物結(jié)合分子，從而使各分析物均被特異性的分析物結(jié)合分子所結(jié)合。通過使用產(chǎn)生不同SERS信號(hào)的不同拉曼活性接頭分子，可對(duì)由眾多不同的“分析物結(jié)合分子分析物”復(fù)合物得到的信號(hào)進(jìn)行解析。金屬襯底表面可由貴金屬或銅制成。本文所使用的“貴金屬”涉及選自于由釕、銠、銀、鈀、鋨、銥、鉬和金所組成的組的金屬，優(yōu)選銀和金。襯底可以是納米顆粒，例如包被有如上定義的貴金屬或銅的納米顆?；蛘哂扇缟隙x的貴金屬或銅組成的納米顆粒。該納米顆?？砂挥秀y膜，或可以是用檸檬酸鹽穩(wěn)定化的金納米顆粒。本文所使用的“納米顆?！鄙婕俺叽缭贗-IOOnm之間的顆粒。本發(fā)明還涵蓋了用于使用表面增強(qiáng)拉曼光譜對(duì)分析物進(jìn)行檢測的綴合物，其中，這些綴合物包含如上所定義的分析物結(jié)合分子、拉曼活性接頭分子和金屬襯底。本文所使用的術(shù)語“綴合物”是指已連接在一起的兩個(gè)或多個(gè)分子。分子相互之間的連接可以是共價(jià)或非共價(jià)的，但優(yōu)選是共價(jià)的。在這類綴合物的一個(gè)實(shí)施方式中，分析物結(jié)合分子共價(jià)偶聯(lián)至拉曼活性接頭分子，并且拉曼活性接頭分子共價(jià)附著至金屬襯底。這些綴合物可以是檢測給定分析物的試劑盒的一部分，或者綴合物組分可以與偶聯(lián)劑一起形試劑盒的一部分，這要求在使用前形成綴合物。本發(fā)明還涉及使用表面增強(qiáng)拉曼光譜對(duì)分析物進(jìn)行檢測的生物傳感器，所述生物傳感器包含一種或多種上述綴合物、特別是納米顆粒綴合物。所述生物傳感器可進(jìn)一步包含具有納米顆粒的襯底，該納米顆粒附著至或粘著至所述襯底。所述生物傳感器可被配置用于體內(nèi)和/或體外用途。這類生物傳感器的用途是本發(fā)明的又一方面。這一用途可以是體內(nèi)或體外用途，并可包括使生物傳感器與包含分析物的介質(zhì)(例如樣品或體液)接觸，然后由所述傳感器檢測SERS信號(hào)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，生物傳感器被配置用于允許對(duì)多于一種的分析物進(jìn)行檢測的多元方法。圖Ia中示出了本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式。在這一特定的實(shí)施方式中，將為靶向感興趣的特異性分析物選擇的抗體(可以如上文所定義)借助于拉曼活性分子接頭錨定在SERS活性金屬納米結(jié)構(gòu)表面上。在圖中示意性地展示的接頭僅僅用作實(shí)例，并非是限制性的。還可使用處于某種適當(dāng)排布的、不包含芳香環(huán)或包含多個(gè)芳香環(huán)的接頭分子。為確?？贵w牢固地附著至納米結(jié)構(gòu)，通過適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)反應(yīng)(例如通過由零長度偶聯(lián)劑I-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)形成酰胺鍵)使抗體共價(jià)連接到接頭分子的一端，同時(shí)接頭分子的另一端通過硫醇基團(tuán)共價(jià)附著至金屬納米結(jié)構(gòu)，從而使抗體錨定至納米結(jié)構(gòu)。雖然可用其它合適的化合物代替不同的組分，但是這一分子排布對(duì)于當(dāng)前的傳感器體系的運(yùn)行是決定性的。本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)觀察到并證明由于與結(jié)合相關(guān)的應(yīng)力，抗原分子與其抗體的結(jié)合可誘導(dǎo)兩個(gè)成員(即，抗體和接頭分子)的結(jié)構(gòu)變化。不希望受任何具體理論的束縛，假定眾多因子可產(chǎn)生這一與結(jié)合相關(guān)的應(yīng)力。例如，在兩個(gè)偶極類分子(dipole likemolecules)之間的靜電排斥和空間相互作用可產(chǎn)生應(yīng)力。同時(shí)還表明，盡管靜電排斥和立體排斥能發(fā)揮作用，構(gòu)型熵能夠取代(supersede)這些作用力并引起分子的重新定向/構(gòu)型，隨后產(chǎn)生應(yīng)力。此外，鄰近的結(jié)合分子間的水合作用力也可產(chǎn)生應(yīng)力。發(fā)明人現(xiàn)在出人 意料地發(fā)現(xiàn)，可利用這些作用力來檢測抗原/抗體結(jié)合事件。在圖Ib和Ic中示意性地示出了這一發(fā)明構(gòu)思更精細(xì)的圖片。在圖Ib給出的實(shí)例中，一開始使抗體/接頭構(gòu)建體以特定的角度定向。一旦抗原結(jié)合至抗體，誘導(dǎo)出排斥力引起抗體/接頭構(gòu)建體的重新定向，所述排斥力本質(zhì)上可以是立體排斥力、靜電排斥力、水合作用排斥力、熵排斥力。這一重新定向作用隨后產(chǎn)生彎曲應(yīng)力，并引起接頭分子的內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化。由于接頭分子鄰近SERS-活性表面，這一重新定向作用誘導(dǎo)的分子內(nèi)結(jié)構(gòu)變化可借助于SERS光譜分析進(jìn)行檢測。在圖Ic所述的另一實(shí)施例中，一開始使抗體/接頭構(gòu)建體相對(duì)于SERS-活性表面正常定向。一旦結(jié)合至抗原，鄰近抗原分子間的排斥力弓I起抗體/接頭構(gòu)建體的重新定向，隨后在接頭結(jié)構(gòu)內(nèi)產(chǎn)生彎曲應(yīng)力。正如在第一實(shí)例中，這一應(yīng)力還可通過SERS光譜分析進(jìn)行間接測定。對(duì)于當(dāng)前的實(shí)施方式，對(duì)結(jié)合事件的檢測很明顯可以不需要洗滌步驟，這是因?yàn)闃悠方橘|(zhì)內(nèi)未結(jié)合的抗原或或污染物并沒有處于SERS活性表面上的等離子體激元近場可及的范圍內(nèi)，因而它們的拉曼信號(hào)不會(huì)被放大，因此與接頭信號(hào)相比可以忽略不計(jì)。當(dāng)前設(shè)計(jì)提供的另一優(yōu)點(diǎn)是接頭的拉曼光譜的獨(dú)特性，這使得對(duì)拉曼本底加以區(qū)別，從而改進(jìn)了整個(gè)體系的敏感性。在圖2a中示出了當(dāng)前發(fā)明的另一實(shí)施方式。這一實(shí)施方式涉及高度多元的基于SERS的納米級(jí)應(yīng)力傳感器用于蛋白檢測。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，因?yàn)闆]有顯著的光譜重疊，這一傳感器可以比在先的熒光檢測方法更加小型化。SERS光譜中窄的峰寬意味著可將信號(hào)串?dāng)_(signal crosstalk)減至最少,從而允許同時(shí)測量將于單個(gè)激光光斑內(nèi)進(jìn)行的多個(gè)結(jié)合事件。因此，當(dāng)前的設(shè)計(jì)對(duì)于高度多元的感應(yīng)平臺(tái)而言是可擴(kuò)展的。在這一具體實(shí)施方式
中，感應(yīng)區(qū)被進(jìn)一步分成數(shù)個(gè)區(qū)域，各區(qū)域荷載有特異性的抗體/接頭構(gòu)建體。舉例來說，在圖2a中示出了三種不同的抗體/接頭構(gòu)建體。應(yīng)當(dāng)注意的是，三種抗體/接頭構(gòu)建體中的每種都是由不同的抗體和接頭分子組成，從而使每個(gè)感應(yīng)區(qū)可同時(shí)靶向高達(dá)3種抗原。在這一具體實(shí)施方式
的一方面，感應(yīng)區(qū)內(nèi)的各子區(qū)域(sub-regions)不需要在尺寸上與激光光斑相仿。事實(shí)上，各子區(qū)域可比激光光斑更小，從而使得在單個(gè)激光光斑內(nèi)可同時(shí)探測多于一個(gè)的事件(參見圖2a右側(cè)的圖)。這可以通過以下事實(shí)成為可能不同接頭分子的SERS光譜通常不會(huì)顯著地重疊，因此可在計(jì)算上加以區(qū)分。事實(shí)上，只要接頭的SERS光譜可加以區(qū)分，可由一個(gè)單獨(dú)的激光光斑同時(shí)探測多于三個(gè)的結(jié)合事件。因此，這一實(shí)施方式為高度多元蛋白感應(yīng)體系提供了可能性。其它實(shí)施方式在下述非限制性實(shí)施例的范圍之中。實(shí)施例實(shí)施例I :化學(xué)品從Sigma Aldrich得到6-巰基嘌呤(6-MP) —水合物和1_乙基-3-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)。分別從Invitrogen和IstBASE得到甘氨酸和磷酸鹽緩沖鹽水(PBS，pH7.4)。經(jīng)純化的小鼠抗人p53 (0. 5mg/ml)和重組人p53 (10 y g，處于100 y L中)購自BD Biosciences Pharmingen。在這一實(shí)驗(yàn)中的使用的金SERS襯底通過電子束微影術(shù)(e-beam lithography)制造。

實(shí)施例2 :將6-MP偶聯(lián)至SERS襯底將15. 2mg的6_巰基嘌呤(6-MP)溶于PBS中，制得約IOmM的溶液。將潔凈的Au頂E襯底浸入這一溶液中Ih,然后用去離子水沖洗并放置至干燥。在用6-MP處理前和處理后，得到拉曼光譜。實(shí)施例3 :將抗人p53固定至6-MP包被的SERS襯底上向0.5ml PBS中加入L抗人p53。通過將2. 4mg EDC溶于20ml PBS中，制備650 ii M的EDC溶液。向處于PBS中的抗人p53中加入5 y L的EDC溶液。將6-MP包被的SERS襯底在室溫下浸入這一溶液中2h，之后用PBS將該襯底徹底洗滌并簡單地干燥。實(shí)施例4: SERS測量向20 ii L的PBS中加入2 ii L的p53。將這一溶液在室溫下加至襯底并孵育30min。然后進(jìn)行SERS測量。之后，將襯底用去離子水徹底沖洗，并在PBS中進(jìn)行SERS測量。在圖3中示出了實(shí)驗(yàn)設(shè)備的方案。簡單來說，使用中性密度濾光片(Edmund Inc.)將IOmW的He-Ne 632. 8nm激光減弱至約5mW。將同時(shí)起到光束擴(kuò)展器和空間濾光片作用的一組鏡片用于生產(chǎn)7mm (0)的均勻光束。經(jīng)由分色鏡(dichroic mirror)并通過Olympus40X、0. 90NA顯微鏡物鏡，將所得到的光束聚焦至SERS應(yīng)力傳感器的感應(yīng)區(qū)上。通過雙面膠帶將襯底固定至載玻片上。將20yL p53溶液滴加至襯底上，用蓋玻片覆蓋，然后放置到拉曼系統(tǒng)的顯微鏡載物臺(tái)上。樣品上的激光功率經(jīng)測量為6mW。對(duì)于從200CHT1到2000CHT1收集的所有拉曼光譜，在實(shí)驗(yàn)中所使用的采集時(shí)間為10s。通過同一物鏡收集在傳感器上生成的拉曼信號(hào)，然后聚焦進(jìn)入400 Pm光學(xué)纖維(Ocean Optics, Inc.)，所述光學(xué)纖維將信號(hào)遞送至單級(jí)的單色器(DoongWo, Inc.)。在這一研究中使用的光柵為600g/mm, (XD檢測器(ANDOR Inc.)工作溫度被設(shè)定為_60°C。將ANDOR軟件用于獲取拉曼光譜和控制分光光度計(jì)。使用由拉曼系統(tǒng)制造商提供的Wire 3. 0軟件對(duì)原始的SERS光譜進(jìn)行處理。首先進(jìn)行直線基線扣除，移除任何本底熒光。使用50%高斯曲線進(jìn)行主峰的曲線擬合，確定中心峰位置并測定峰寬和峰強(qiáng)度。在圖4中示出了來源于6-MP應(yīng)力傳感器的示例性SERS光譜。很顯然，由于抗體偶聯(lián)至傳感器表面以及分析物結(jié)合作用，沒有新的峰形成，并且三條光譜的形狀大體上類似。這是因?yàn)榈鞍资侨醯睦⑸潴w；隨著分析物和金屬納米結(jié)構(gòu)的分離增加，SERS中的增強(qiáng)效應(yīng)快速衰減。因此，來自抗P53抗體和p53抗原的貢獻(xiàn)在與6-MP光譜一起時(shí)將并不顯著。對(duì)p53加入前后的SERS峰位置進(jìn)行曲線擬合，在表I中列出了中心波數(shù)。當(dāng)加入p53時(shí)，在 433cm \ 620cm \ 866cm 1^lOOOcm 1和1290cm 1處的各峰顯不出顯著的正向位移，其中 86601^1和 lOOOcnT1處的各峰表現(xiàn)出 0. 45%的最大位移百分比。對(duì)于 153601^1和1571CHT1處的峰，還觀察到了顯著的負(fù)向位移。為理解光譜位移，有必要重溫下拉曼散射的理論，并且理解通過其能級(jí)測定的、光與分子的相互作用。存在著兩種類型的能級(jí)與電子運(yùn)動(dòng)有關(guān)的電子能級(jí)；和與分子中的原子運(yùn)動(dòng)有關(guān)的振動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)或平動(dòng)能級(jí)。各電子能級(jí)具有其振動(dòng)能級(jí)子集(subset)。不同于光的吸收，拉曼散射并不要求入射光子的能量與躍遷到下一電子能級(jí)的能量相重合。取而代之的是，入射光子在能量方面通常要低得多，并且將分子從基態(tài)振動(dòng)能級(jí)激發(fā)到中間虛能級(jí)。所述虛能級(jí)并不穩(wěn)定，光子散射的同時(shí)分子返回到除基態(tài)外的較低振動(dòng)能級(jí)。散射光子的能量對(duì)應(yīng)于入射光子的能量與在振動(dòng)能級(jí)間躍遷的能量之差(拉曼位移)。因此，分子中的振動(dòng)是拉曼效應(yīng)的來源。通過組成原子之間的 化學(xué)鍵將這些振動(dòng)束縛在分子中。因此，在當(dāng)前實(shí)驗(yàn)中觀察到的峰位移暗示了當(dāng)使P53結(jié)合到固定化抗P53抗體時(shí)，壓縮或拉伸了 6-MP內(nèi)的某些鍵。當(dāng)鍵被壓縮或被束縛時(shí)，振動(dòng)頻率增加，產(chǎn)生較高的拉曼位移。對(duì)于被拉伸或未束縛的鍵來說反之亦然。從表I中可觀察到，具有上移作用(upshift)的鍵是使6-MP結(jié)合至金襯底的鍵(S-Au)以及結(jié)合至抗p53的鍵(N9)。同時(shí)，具有最大上移作用(165011-1和 lOOOcnT1)的峰對(duì)應(yīng)于S-Au振動(dòng)。這可進(jìn)行以下解釋=S-Au鍵成為6-MP與襯底的主要連接，因此，當(dāng)p53結(jié)合時(shí)S-Au鍵經(jīng)歷了最大的壓縮作用。表I :位移峰的波段分配
—_ (cm'1)I ————分配—
上移 433.54(v)S-C6, (br)pyrim
620.42(<J)C8-H(op), (rf)NS-H865.99(br)pyrim, (S)S-Au
1000 04: ⑷ S-Au
._ 12go—(v)N1-C2-N3
i、.摔1536.02~(v)N7-C8,⑷C8-H, (5)Ni-H一
1571.92 +—(v)C2-N1, (v)C6-C5-C4, (J)NS-H縮寫詞v :拉伸振動(dòng)；br :環(huán)呼吸振動(dòng)；6 :變形振動(dòng)；op :平面外；pyrim :卩密唳。通過繪制865CHT1、lOOOcnT1和1290CHT1處的峰位移隨p53濃度的變化情況，構(gòu)建對(duì)當(dāng)前傳感器的響應(yīng)曲線。在圖5中示出了所述曲線。這三個(gè)峰之所以被人為選定監(jiān)測p53抗P53結(jié)合事件，僅僅是因?yàn)榫哂凶铒@著的上移作用和相對(duì)大的強(qiáng)度。應(yīng)當(dāng)理解的是，還可以使用其它的結(jié)合敏感峰。從圖5中可以看出，當(dāng)前的傳感器甚至在低至IOnM的濃度下還能對(duì)P53抗原進(jìn)行響應(yīng)。
在存在和不存在P53的情況下，于沖洗前后對(duì)潔凈的襯底、6-MP包被的襯底、抗P536-MP包被的襯底重復(fù)進(jìn)行SERS測量。使用100%功率、IOs采集和I次積累作為設(shè)定，在傳感器表面上的三個(gè)光斑處(A、B和C)對(duì)潔凈的Au IME襯底進(jìn)行分析。在圖6中示出結(jié)果。之后，將襯底用6-MP包被，用10%功率、30s采集和2次積累進(jìn)行SERS測量(參見圖7)。下一步，使用EDC交聯(lián)劑通過6-MP將抗p53抗體綴合至表面。接下來，以10%功率、30s采集和2次積累進(jìn)行生物傳感器的進(jìn)一步的SERS光譜分析。在圖8和圖12中示出了結(jié)果，其中，圖8顯示出三次測量的光譜疊加曲線圖，而圖12a)-c)單獨(dú)地顯示出各光譜，并包含峰的波數(shù)。此后，將P53加入到傳感器中，并在10%功率、30s采集和2次積累下記錄SERS光譜(參見圖9和圖13)。然后，用去離子水對(duì)表面進(jìn)行徹底沖洗，并加入PBS。使用下述參數(shù)得到SERS光譜10%功率、30s采集和2次積累。圖10和圖14顯示出這些記錄的結(jié)果。顯而易見的是，當(dāng)向傳感器表面添加抗P53和p53時(shí)，沒有觀察到新的峰。這在圖11中尤其明顯，圖11表示由位置A的分析貫穿整個(gè)過程而得到的光譜的累積曲線圖。圖15表示在抗體綴合、P53添加和傳感器表面沖洗之后，由三次測量得到的光譜的累積曲線圖。當(dāng)p53結(jié)合至已固定在Au IME襯底上的抗p53抗體時(shí)，觀察到了大的拉曼位移(參見圖 15)。對(duì)應(yīng)于 vC8-H+vN7-C8+vN9_C8、a C5-N7-C8+S N9-C8+a C6-S、a S-H 和 a C2-H+ 8 C8-H+ a N1-C2-N3+ 8 N9-H 的 866、 947、 1000 和 1292 峰顯示出 I-ScnT1 最顯著的位移。這些表示6-MP和襯底和/或抗體之間的鍵。當(dāng)用去離子水對(duì)襯底進(jìn)行沖洗并在PBS中取得拉曼光譜時(shí)，光譜十分類似于用P53孵育前的起始光譜(參見圖12、圖14和圖15)。本文所述的發(fā)明可適宜地在缺少本文未特別公開的任意單個(gè)要素或多個(gè)要素、單個(gè)限制因素或多個(gè)限制因素時(shí)加以實(shí)施。因此，例如，術(shù)語“包含/包括/含有”(comprising/including/containing)等應(yīng)該開放地及非限制性地理解。此外,本文使用的術(shù)語和表述被用作描述性的術(shù)語，而非限制性的術(shù)語，所述術(shù)語和表述的使用并不旨在排除這些術(shù)語和表述顯示或記載的特征的任何等同特征或其一部分，但是應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，在本發(fā)明請(qǐng)求保護(hù)的范圍內(nèi)的任何修改都是可以的。因此，應(yīng)當(dāng)明白，盡管已通過優(yōu)選的實(shí)施方式和可選的特征具體公開了本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員仍可以采用此處所公開的其所包含的本發(fā)明的修改和變化，并且這些修改和變化被視為落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。將所引用的全部文獻(xiàn)的內(nèi)容以引用的方式整體并入本文。本文已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了寬泛和一般性的描述。落入該一般性公開內(nèi)容的每種范圍較窄的形式和下位群組也構(gòu)成本發(fā)明的一部分。這包括了利用但書和否定式限定從大類中排除了任何主題的本發(fā)明的上位說明，無論本文中是否對(duì)所排除的材料進(jìn)行了具體敘述。其它實(shí)施方式也落入下述權(quán)利要求和非限制性實(shí)施例內(nèi)。此外,一旦本發(fā)明的特征和方面是以馬庫什組的方式進(jìn)行描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明也因此將以馬庫什組中任意的單個(gè)成員或成員亞組的方式進(jìn)行描述。
權(quán)利要求
1.使用表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)對(duì)一種或多種分析物進(jìn)行檢測的方法，所述方法包括 -使一種或多種分析物與至少一種分析物結(jié)合分子相接觸，所述分析物結(jié)合分子通過拉曼活性分子接頭附著至使拉曼散射增強(qiáng)的金屬襯底表面；以及 -對(duì)來自所述復(fù)合體的表面增強(qiáng)拉曼信號(hào)進(jìn)行檢測。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其中，所述復(fù)合體的表面增強(qiáng)拉曼信號(hào)與分析物的量相關(guān)。
3.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其中，所述一種或多種分析物包含于樣品中，并且所述檢測在體外進(jìn)行。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其中，在包含所述分析物的體液中對(duì)所述一種或多種分析物進(jìn)行檢測。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述體液選自于由血漿、血清、血液、淋巴液、liquor和尿所組成的組。
6.如權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的方法,其中，所述一種或多種分析物選自于由蛋白、肽、核酸、碳水化合物、脂質(zhì)、細(xì)胞、病毒、小分子、或半抗原所組成的組。
7.如權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述至少一種分析物結(jié)合分子特異性地結(jié)合所述一種或多種分析物。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述至少一種分析物結(jié)合分子選自于由抗體、抗體片段或抗體樣分子所組成的組。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述至少一種分析物結(jié)合分子為單克隆抗體或多克隆抗體。
10.如權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述方法為用于檢測多于一種分析物的多元方法，其中在接觸步驟中使用多于一種的分析物結(jié)合分子。
11.如權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述至少一種分析物結(jié)合分子共價(jià)偶聯(lián)至通過共價(jià)相互作用附著至所述襯底表面的拉曼活性分子接頭。
12.如權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述拉曼活性分子接頭化合物選自于由下列物質(zhì)所組成的組6_巰基嘌呤、8-氮雜-腺嘌呤、N-苯甲?；汆堰?、2-巰基-苯并咪唑、4-氨基-吡唑[3，4-d]嘧唆、玉米素、亞甲基藍(lán)、9-氨基-吖唆、溴化乙錠、俾斯麥棕Y、N-芐基-氨基嘌呤、硫堇醋酸鹽、3，6- 二氨基吖啶、6-氰基嘌呤、4-氨基-5-咪唑-甲酰胺鹽酸鹽、1，3-二亞氨基異吲哚啉、羅丹明6G、結(jié)晶紫、堿性品紅、苯胺藍(lán)二銨鹽、N-[(3-(苯胺基亞甲基)-2-氯-I-環(huán)己烯-I-基)亞甲基]苯胺單鹽酸鹽、0-(7-氮雜苯并三唑-I-基)-N, N，N’，N’ -四甲基脲鎗六氟磷酸鹽、9-氨基芴鹽酸鹽、堿性藍(lán)、1，8- 二氨基-4，5- 二羥基蒽醌、原黃素半硫酸鹽水合物、2-氨基-1，I, 3-三氰基丙烯、變胺藍(lán)RT鹽、·4，5, 6-二氨基喃唳硫酸鹽、2-氨基-苯并噻唑、二聚氰胺、3-(3-卩比唳基甲基氨基)丙腈、磺胺嘧啶銀(I)、吖啶黃素、4-氨基-6-巰基吡唑[3，4-d]嘧啶、2-氨基嘌呤、腺嘌呤硫醇FAD氟腺嘌呤、4-氨基-6-巰基吡唑[3，4-d]嘧啶、羅丹明110、腺嘌呤、5-氨基-2-巰基苯并咪唑、吖啶橙鹽酸鹽、醋酸甲酚紫、中性吖啶黃素、溴甲菲唆、5，10，15，20-四(N-甲基-4-卩比啶基)卟啉四(對(duì)甲苯磺酸鹽)、5，10，15，20-四(4-三甲基氨基苯基)卟啉四(對(duì)甲苯磺酸鹽)、3，5- 二氨基吖啶鹽酸鹽、碘化丙啶(3，8- 二氨基-5-(3- 二乙基氨基丙基)-6-苯基菲啶鎗鹽碘化甲碘化物)、反式-4-[4-( 二甲基氨基)苯乙烯基]-I-甲基吡啶鎗碘化物；以及4-((4-( 二甲基氨基)苯基)偶氮基)苯甲酸、其琥珀酰亞胺酯；或上述物質(zhì)的衍生物。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述拉曼活性分子接頭為含有硫醇基團(tuán)的化合物。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中，所述拉曼活性分子接頭為6-巰基嘌呤。
15.如權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述至少一種分析物結(jié)合分子通過形成酰胺鍵而共價(jià)偶聯(lián)至所述拉曼活性分子接頭。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中，I-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺被用作偶聯(lián)劑。
17.如權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述金屬襯底表面由貴金屬或銅制成。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中，所述貴金屬選自于由銀和金所組成的組。
19.如權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述襯底為納米顆粒。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中，所述納米顆粒包被有貴金屬或由貴金屬組成。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中，所述貴金屬選自于由銀和金所組成的組。
22.如權(quán)利要求20或21所述的方法，其中，所述納米顆粒包被有銀膜。
23.如權(quán)利要求20-22中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述納米顆粒為用檸檬酸鹽穩(wěn)定化的金納米顆粒。
24.使用表面增強(qiáng)拉曼光譜對(duì)分析物進(jìn)行檢測的綴合物，所述綴合物包含分析物結(jié)合分子、拉曼活性接頭分子和金屬襯底，其中，所述分析物結(jié)合分子共價(jià)偶聯(lián)至所述拉曼活性接頭分子，所述拉曼活性接頭分子共價(jià)附著至所述金屬襯底。
25.如權(quán)利要求24所述的綴合物，其中，所述分析物結(jié)合分子選自于由抗體、抗體片段或抗體樣分子所組成的組。
26.如權(quán)利要求25所述的綴合物，其中，所述分析物結(jié)合分子為單克隆抗體或多克隆抗體。
27.如權(quán)利要求24-26中任一項(xiàng)所述的綴合物，其中，所述拉曼活性分子接頭化合物選自于由下列物質(zhì)所組成的組6_巰基嘌呤、8-氮雜-腺嘌呤、N-苯甲?；汆堰?、2-巰基-苯并咪唑、4-氨基-吡唑[3，4-d]嘧啶、玉米素、亞甲基藍(lán)、9-氨基-吖啶、溴化乙錠、俾斯麥棕Y、N-芐基-氨基嘌呤、硫堇醋酸鹽、3，6- 二氨基吖啶、6-氰基嘌呤、4-氨基-5-咪唑-甲酰胺鹽酸鹽、1，3-二亞氨基異吲哚啉、羅丹明6G、結(jié)晶紫、堿性品紅、苯胺藍(lán)二銨鹽、N-[(3-(苯胺基亞甲基)-2-氯-I-環(huán)己烯-I-基)亞甲基]苯胺單鹽酸鹽、O-(7-氮雜苯并三唑-I-基)-N, N，N’，N’ -四甲基脲鎗六氟磷酸鹽、9-氨基芴鹽酸鹽、堿性藍(lán)、1，8- 二氨基-4，5- 二羥基蒽醌、原黃素半硫酸鹽水合物、2-氨基-1，I, 3-三氰基丙烯、變胺藍(lán)RT鹽、.4，5, 6-二氨基喃唳硫酸鹽、2-氨基-苯并噻唑、二聚氰胺、3-(3-卩比唳基甲基氨基)丙腈、磺胺嘧啶銀(I)、吖啶黃素、4-氨基-6-巰基吡唑[3，4-d]嘧啶、2-氨基嘌呤、腺嘌呤硫醇FAD氟腺嘌呤、4-氨基-6-巰基吡唑[3，4-d]嘧啶、羅丹明110、腺嘌呤、5-氨基-2-巰基苯并咪唑、吖啶橙鹽酸鹽、醋酸甲酚紫、中性吖啶黃素、溴甲菲唆、5，10，15，20-四(N-甲基-4-吡啶基)卟啉四(對(duì)甲苯磺酸鹽)、5，10，15，20-四(4-三甲基氨基苯基)卟啉四(對(duì)甲苯磺酸鹽)、3，5- 二氨基吖啶鹽酸鹽、碘化丙啶(3，8- 二氨基-5-(3- 二乙基氨基丙基)-6-苯基菲啶鎗磺化甲碘化物)、反式-4-[4-( 二甲基氨基)苯乙烯基]-I-甲基吡啶鹽碘化物；以及4-((4-( 二甲基氨基)苯基)偶氮基)苯甲酸、其琥珀酰亞胺酯；或上述物質(zhì)的衍生物。
28.如權(quán)利要求27所述的綴合物，其中，所述拉曼活性分子接頭為含有硫醇基團(tuán)的化合物。
29.如權(quán)利要求24-28中任一項(xiàng)所述的綴合物，其中，所述分析物結(jié)合分子通過形成酰胺鍵共價(jià)偶聯(lián)至所述拉曼活性分子接頭。
30.如權(quán)利要求29所述的綴合物，其中，I-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺被用作偶聯(lián)劑。
31.如權(quán)利要求24-30中任一項(xiàng)所述的綴合物，其中，所述金屬襯底由貴金屬或銅制成，或者包被有貴金屬或銅。
32.如權(quán)利要求31所述的綴合物，其中，所述貴金屬選自于由銀和金所組成的組。
33.如權(quán)利要求24-32中任一項(xiàng)所述的綴合物，其中，所述金屬襯底為納米顆粒。
34.如權(quán)利要求33所述的綴合物，其中，所述納米顆粒包被有銀膜。
35.如權(quán)利要求33所述的綴合物，其中，所述納米顆粒為用檸檬酸鹽穩(wěn)定化的金納米顆粒。
36.使用表面增強(qiáng)拉曼光譜對(duì)分析物進(jìn)行檢測的生物傳感器，所述生物傳感器包含一種或多種權(quán)利要求24-35任一項(xiàng)所述的綴合物。
37.如權(quán)利要求36所述的生物傳感器，所述生物傳感器進(jìn)一步包含襯底，其中所述納米顆粒附著至所述襯底。
38.如權(quán)利要求36或37所述的生物傳感器，其中，所述生物傳感器被配置用于體內(nèi)和/或體外用途。
39.如權(quán)利要求36-38中任一項(xiàng)所述的生物傳感器，其中，所述分析物為蛋白、肽、核酸、小分子或半抗原。
40.權(quán)利要求36-39中任一項(xiàng)所述的生物傳感器在分析物檢測中的用途。
41.如權(quán)利要求40所述的用途，其中，所述檢測在體內(nèi)進(jìn)行。
42.如權(quán)利要求40所述的用途，其中，所述檢測在體外進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)對(duì)分析物進(jìn)行檢測的方法，所述方法包括使分析物與至少一種分析物結(jié)合分子相接觸，所述分析物結(jié)合分子通過拉曼活性分子接頭附著至使拉曼散射增強(qiáng)的金屬襯底表面；以及對(duì)來自所述復(fù)合體的表面增強(qiáng)拉曼信號(hào)進(jìn)行檢測。另一方面，本發(fā)明涉及適用于所發(fā)明的基于SERS的分析物檢測方法的綴合物和生物傳感器。
文檔編號(hào)G01N33/53GK102812348SQ201080059252
公開日2012年12月5日 申請(qǐng)日期2010年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月22日
發(fā)明者許健威, 奧利沃·馬利尼 申請(qǐng)人:新加坡科技研究局