專利名稱：篩選抑制目標(biāo)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的候選新藥以開發(fā)一類藥物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種篩選抑制蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的物質(zhì)的方法，更具體地涉及一種篩選抑制蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的方法，所述方法包括使用一種蛋白質(zhì)芯片，該芯片上固定有包含溶膠-凝膠材料與蛋白質(zhì)的混合物的位點(diǎn)。
背景技術(shù)：
眾所周知，開發(fā)低分子量的抑制蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的抑制劑存在許多問題，但由于它們的重要性，人們不斷嘗試著開發(fā)低分子量的可抑制蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的物質(zhì)，并且已經(jīng)報(bào)道了幾個(gè)成功的實(shí)例(Nature Reviews Drug Discovery，3 :853， 2004)。開發(fā)新藥的方法通常包括構(gòu)建特定的分析系統(tǒng)和使用該分析系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)十到數(shù)百萬個(gè)化合物文庫的高通量篩選。這些方法主要用于跨國制藥公司，由于待分析的化合物數(shù)量或高速篩選系統(tǒng)的構(gòu)建等的各種限制，它們難以應(yīng)用于小型實(shí)驗(yàn)室。為了構(gòu)建一種新的用于篩選相對(duì)小型的數(shù)萬個(gè)化合物文庫(如天然物質(zhì)文庫)的高通量篩選系統(tǒng)，有必要在短時(shí)間內(nèi)以低成本驗(yàn)證這一概念。此外，對(duì)于學(xué)校和研究所等小型和中型實(shí)驗(yàn)室來說，需要的策略是用新概念的分析系統(tǒng)和篩選系統(tǒng)來獲得先導(dǎo)化合物。因此，需要用先前的由廉價(jià)聚合物構(gòu)建而成的芯片系統(tǒng)來建立新的藥物篩選方法，其適合基于芯片的篩選，可用于數(shù)量少的樣品，從而確保原創(chuàng)技術(shù)。這將有助于加強(qiáng)新藥開發(fā)行業(yè)的基礎(chǔ)建設(shè)。相應(yīng)地，本發(fā)明人廣泛致力于基于芯片的用于篩選蛋白質(zhì)_蛋白質(zhì)相互作用的抑制劑的方法，該方法甚至可有利地用于基于實(shí)驗(yàn)室的小型實(shí)驗(yàn)。結(jié)果，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)使用點(diǎn)樣帶有溶膠-凝膠材料與蛋白質(zhì)混合物的芯片，用現(xiàn)有的抗體分析方法很容易篩選出蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的抑制劑，從而完成本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種基于芯片的篩選抑制蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的物質(zhì)的方法，其中蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用可用簡(jiǎn)便易行的方式分析。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供一種篩選抑制蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的物質(zhì)的方法，所述方法包括步驟(a)制造蛋白質(zhì)芯片，所述蛋白質(zhì)芯片上固定有包含溶膠-凝膠材料與蛋白質(zhì)的混合物的位點(diǎn)；(b)在存在抑制蛋白質(zhì)之間結(jié)合的候選物質(zhì)的情況下，使所述蛋白質(zhì)芯片與能和所述芯片上固定的蛋白質(zhì)相結(jié)合的蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)；和(c)測(cè)量所述芯片上固定的蛋白質(zhì)與能和所述固定的蛋白質(zhì)相結(jié)合的蛋白質(zhì)之間的結(jié)合，如果與不存在所述候選物質(zhì)的情況下相比，測(cè)得蛋白質(zhì)之間的結(jié)合受到抑制，則選擇所述候選物質(zhì)作為抑制蛋白質(zhì)_蛋白質(zhì)相互作用的物質(zhì)。從以下詳細(xì)說明及所附權(quán)利要求將更明確本發(fā)明的其他特點(diǎn)和實(shí)施方式。


圖1顯示細(xì)胞周期蛋白T(Cyclin Τ)之間的結(jié)構(gòu)同源性。圖2顯示用于檢測(cè)重組CDK9和 CyclinT在Ε. coli BL21中的表達(dá)而進(jìn)行的 SDS-PAGE的結(jié)果。圖3顯示重組人⑶Κ9的表達(dá)模式及其純化工藝。圖4顯示重組人CyclinT的表達(dá)模式及其純化工藝。圖5是顯示測(cè)定在溶膠-凝膠芯片上⑶Κ9和人CyclinTl之間相互作用的方法示意圖。圖6顯示在溶膠_凝膠芯片上蛋白質(zhì)_蛋白質(zhì)結(jié)合的分析結(jié)果。圖7顯示在溶膠_凝膠芯片上用4種天然物質(zhì)進(jìn)行初步測(cè)試的結(jié)果。圖8顯示在溶膠_凝膠芯片上進(jìn)行測(cè)試以確立分析條件的結(jié)果。圖9顯示依賴于溶膠_凝膠材料組分的分析結(jié)果。圖10顯示依賴于溶膠_凝膠材料的組分的分析結(jié)果。圖11顯示天然物質(zhì)文庫對(duì)抑制CKD9和人CyclinTl間相互作用所產(chǎn)生的影響的
分析結(jié)果。圖12顯示依賴于溶膠-凝膠材料的組分的BSA信號(hào)的分析結(jié)果。圖13顯示依賴于溶膠-凝膠材料的組分的BSA信號(hào)的分析結(jié)果。圖14顯示構(gòu)建用于分析抑制蛋白質(zhì)_蛋白質(zhì)相互作用的天然物質(zhì)篩選系統(tǒng)的工藝。圖15顯示在低密度芯片上3種天然物質(zhì)對(duì)抑制⑶Κ9和人CyclinTl間相互作用所產(chǎn)生的影響的分析結(jié)果。圖16是顯示CyclinTl和⑶Κ9間相互作用機(jī)制的示意圖。圖17是顯示SELEX方法構(gòu)建CyclinTl適體的示意圖。圖18是顯示CyclinTl適體的作用機(jī)制的示意圖。圖19顯示在溶膠-凝膠芯片上適體和CyclinTl間結(jié)合的分析結(jié)果。
具體實(shí)施例方式除非另有定義，本發(fā)明使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語的含義與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義相同。通常，本發(fā)明使用的命名及下述實(shí)驗(yàn)方法都是本領(lǐng)域公知的或常用的。一方面，本發(fā)明針對(duì)一種篩選抑制蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的物質(zhì)的方法，所述方法包括步驟(a)制造蛋白質(zhì)芯片，所述蛋白質(zhì)芯片上固定有包含溶膠-凝膠材料與蛋白質(zhì)的混合物的位點(diǎn)；(b)在存在抑制蛋白質(zhì)之間結(jié)合的候選物質(zhì)的情況下，使所述蛋白質(zhì)芯片與能和所述芯片上固定的蛋白質(zhì)相結(jié)合的蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)；和(c)測(cè)量所述芯片上固定的蛋白質(zhì)與能和所述固定的蛋白質(zhì)相結(jié)合的蛋白質(zhì)之間的結(jié)合，如果與不存在所述候選物質(zhì)的情況下相比，測(cè)得蛋白質(zhì)之間的結(jié)合受到抑制，則選擇所述候選物質(zhì)作為抑制蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的物質(zhì)。在本發(fā)明中，候選物質(zhì)優(yōu)選地選自天然物質(zhì)、化合物和適體。在本發(fā)明篩選方法的步驟(C)中，優(yōu)選使用蛋白質(zhì)抗體來分析蛋白質(zhì)之間的結(jié)合，所述蛋白質(zhì)抗體是能和蛋白質(zhì)芯片上固定的蛋白質(zhì)相結(jié)合的蛋白質(zhì)的抗體。在本發(fā)明中，所述位點(diǎn)優(yōu)選固定在96孔板上。在本發(fā)明中，固定在蛋白質(zhì)芯片上的蛋白質(zhì)優(yōu)選為CyclinTl，并且能和蛋白質(zhì)芯片上固定的蛋白質(zhì)相結(jié)合的蛋白質(zhì)優(yōu)選為 CDK9。在本發(fā)明中，選擇 候選物質(zhì)作為抑制蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的物質(zhì)的步驟(C) 中，如果所述候選物質(zhì)與芯片上固定的蛋白質(zhì)結(jié)合，抑制了所述蛋白質(zhì)芯片上固定的蛋白質(zhì)與所述能和該固定的蛋白質(zhì)相結(jié)合的蛋白質(zhì)之間的結(jié)合，則選擇所述候選物質(zhì)作為抑制物質(zhì)。例如，CyclinTl是一種與⑶K9相互作用的蛋白質(zhì)。當(dāng)候選物質(zhì)和⑶K9可以在固定有CyclinTl的蛋白質(zhì)芯片上相互反應(yīng)時(shí)，如果候選物質(zhì)與CyclinTl結(jié)合，抑制了⑶K9 與CyclinTl之間的結(jié)合，則可以選擇該候選物質(zhì)作為抑制CyclinTl與⑶K9之間相互作用的物質(zhì)。在此，相互作用的抑制可通過用CDK9抗體處理該蛋白質(zhì)芯片，然后用熒光材料 (如Cy3)標(biāo)記的與CDK9抗體相抗的二級(jí)抗體處理來進(jìn)行分析。換言之，如果與不存在候選物質(zhì)的情況相比，以候選物質(zhì)處理時(shí)CDK9抗體信號(hào)減弱，則可以選擇該候選物質(zhì)作為抑制 CyclinTl-CDK9相互作用的物質(zhì)。在本發(fā)明中，溶膠-凝膠物質(zhì)優(yōu)選地包括17. 5重量份的TM0S、5_15重量份的MTMS 禾口 0-15重量份的GPTMOS。在本發(fā)明中，為了建立新藥篩選技術(shù)并檢驗(yàn)從中篩選的候選群體以發(fā)掘抑制蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的新型天然物質(zhì)，建構(gòu)了基于芯片的篩選系統(tǒng)，用于篩選抑制蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的物質(zhì)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，建立了能夠分析CyclinT/⑶K9相互作用的基于芯片的系統(tǒng)，從而篩選CyclinT/CDK9的候選抑制劑。具體地，如圖5所示，將溶膠-凝膠材料與 CyclinT的混合物點(diǎn)樣于基底上以制造蛋白質(zhì)芯片。使所述蛋白質(zhì)芯片不僅與CyclinT/ CDK9相互作用的候選抑制劑(如放線菌培養(yǎng)提取物、真菌培養(yǎng)提取物、植物提取物或適體) 反應(yīng)，而且與⑶K9反應(yīng)，然后使之依次與⑶K9抗體和Cy3-標(biāo)記的二級(jí)抗體反應(yīng)。然后掃描芯片，分析位點(diǎn)上是否出現(xiàn)信號(hào)。將在位點(diǎn)上反應(yīng)不顯示信號(hào)的物質(zhì)確定為抑制劑物質(zhì)。
實(shí)施例以下參考實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然理解，這些實(shí)施例僅是舉例說明的目的，不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1 :Cyclin T基因和⑶K9基因的克隆以及Cyclin T和CDK9的擴(kuò)增Cyclin T蛋白是高度同源的蛋白，它含有保守區(qū)，稱為“細(xì)胞周期蛋白盒”，已知與 CDK9結(jié)合。人Cyclin T (GenBank#NM_001240)的細(xì)胞周期蛋白盒包含266個(gè)氨基酸，由SEQ ID NO 1 的核苷酸序列表示(圖 1)。人 CDK9 (GenBankifflCOO 1968)如 SEQ ID NO 2 所示。用人cDNA混合物作為PCR擴(kuò)增CDK9的模板，用HEK293細(xì)胞和HeLa細(xì)胞的1 1 的混合物作為PCR擴(kuò)增人Cyclin Tl的模板。在PCR擴(kuò)增中，使用以下引物 SEQ ID NO 3 GAATTCATGGCGAAGCAGTACGACTC (人 CDK9 正向引物；含有 EcoRI 位
占). /、、、 /
SEQ ID NO 4 CTCGAGGAAGACGCGCTCAAACTCC (人CDK9 反向引物；含有XhoI 位點(diǎn))；SEQ ID NO :5 :GAATTCATGGAGGGAGAGAGGAAGAACA(人 Cyclin Tl 正向引物；含有 EcoRI 位點(diǎn))；SEQ ID NO 6 :GTCGACAGCCTCGCATGCCCTCCAA(人 Cyclin Tl 反向引物；含有 SalI 位點(diǎn))O將人⑶K9和人Cyclin Tl基 自進(jìn)行擴(kuò)增，通過TA-克隆連接到T載體中 (Promega，USA)，然后轉(zhuǎn)化到E. coli DH5 α中。從轉(zhuǎn)化的克隆體中純化質(zhì)粒，并通過電泳確認(rèn)克隆基因并測(cè)序以確定核苷酸序列。將該克隆基因分別克隆到pET28a載體(Novagen， USA)中，然后將其轉(zhuǎn)化到Ε. coli BL21細(xì)胞中。培養(yǎng)分別以人CDK9基因和人Cyclin Tl基因轉(zhuǎn)化的E. coli BL21細(xì)胞，并用IPTG 誘導(dǎo)細(xì)胞中各種基因的表達(dá)，之后再培養(yǎng)并收集該細(xì)菌細(xì)胞。通過SDS-PAGE分析細(xì)胞中各種基因的表達(dá)(圖2)。將細(xì)菌細(xì)胞系分別添加到并懸浮于IOmL含有PMSF的His-tag結(jié)合液中，并超聲裂解。細(xì)胞裂解液分別涂布His tag樹脂來分別純化人⑶K9基因和人Cyclin Tl基因，并進(jìn)行SDS-PAGE以分析人⑶K9蛋白和人Cyclin Tl蛋白是否被充分表達(dá)(圖3和圖4)。實(shí)施例2 分析芯片上蛋白質(zhì)與抑制劑之間的相互作用為了分析溶膠-凝膠芯片上⑶K9與人Cyclin Tl之間的相互作用，通過圖5所示的方法分析該芯片上蛋白質(zhì)之間的結(jié)合。將人CycIinTl 和 CDK9 各 50ng 與溶膠-凝膠材料組分 1 (25. 0% TMOS、7. 5% MTMS 和5% GPTM0S)混合，并經(jīng)點(diǎn)樣儀點(diǎn)樣和固定在96孔板上。為了防止無親和性的物質(zhì)粘到芯片上，將板用含有脫脂奶的結(jié)合液封閉，然后使其與1 500稀釋的可結(jié)合CDK9的抗-CDK9 抗體在室溫下反應(yīng)1小時(shí)。為了考察掃描儀中的信號(hào)，將板與1 1000稀釋的cy3-標(biāo)記的二級(jí)抗體在室溫下反應(yīng)1小時(shí)，然后掃描板以分析各種蛋白質(zhì)的信號(hào)(圖6)。結(jié)果，如圖6所見，出現(xiàn)了表示⑶K9與抗-⑶K9之間結(jié)合的弱信號(hào)。在常規(guī)篩選天然物質(zhì)文庫之前，選擇四種天然物質(zhì)并建立基于芯片的分析系統(tǒng)的條件。因?yàn)閺纳鲜鼋Y(jié)果可以看出⑶K9的信號(hào)弱，所以將人Cyclin Tl和⑶K9各150ng(3 倍于以上所用的50ng)與溶膠-凝膠材料組分2 (25. 0% TM0S、7. 5% MTMS和15% GPTM0S) 混合并固定在96孔板上。將板用含有脫脂奶的結(jié)合液封閉，然后使其與⑶K9 (50ng/rxn體積50 μ 1)反應(yīng)， 然后沖洗。然后，將板與1 500稀釋的抗-CDK9抗體在室溫下反應(yīng)1小時(shí)并沖洗，之后將它與1 1000稀釋的cy3-標(biāo)記的二級(jí)抗體在室溫下反應(yīng)1小時(shí)并沖洗。然后，掃描板并分析各種蛋白質(zhì)的信號(hào)。結(jié)果，如圖7所見，在僅允許抗-⑶K9抗體反應(yīng)的孔中出現(xiàn)了⑶K9點(diǎn)的信號(hào)，而在允許CDK9以及抗-CDK9抗體反應(yīng)的孔中沒有出現(xiàn)信號(hào)。為此，在篩選天然物質(zhì)文庫之前， 先進(jìn)行測(cè)試分析芯片上⑶K9與人Cyclin Tl之間的結(jié)合。將180ng人Cyclin Tl 和 150ng CDK9 與溶膠-凝膠材料組分 1 (25. 0% TM0S、7. 5% MTMS和5%GPTM0S)混合并點(diǎn)樣于96孔板上。然后，將板用含有脫脂奶的結(jié)合液封閉，然后使其與⑶K9反應(yīng)(50ng/rXn體積50 μ 1)并沖洗。然后，將板與1 500稀釋的抗-⑶Κ9 抗體在室溫下反應(yīng)1小時(shí)并沖洗，之后將它與1 1000稀釋的cy3-標(biāo)記的二級(jí)抗體在室溫下反應(yīng)1小時(shí)并沖洗。然后，掃描板并 分析各種蛋白質(zhì)的信號(hào)。結(jié)果，如圖8所見，信號(hào)不僅出現(xiàn)在允許⑶K9以及抗-⑶K9抗體反應(yīng)的2號(hào)孔中， 而且出現(xiàn)在未固定任何物質(zhì)的陰性位點(diǎn)中，而在允許抗-CDK9抗體以及二級(jí)抗體反應(yīng)的1 號(hào)和4號(hào)孔中很少或沒有出現(xiàn)信號(hào)。當(dāng)重復(fù)相同的試驗(yàn)時(shí)，除了陽性位點(diǎn)外，所有位點(diǎn)中都沒有出現(xiàn)信號(hào)。基于以上兩項(xiàng)試驗(yàn)的結(jié)果和圖4的結(jié)果，結(jié)論認(rèn)為，測(cè)試結(jié)果不是恒定的，因?yàn)槿苣z_凝膠材料的組分不適合用于這些蛋白。為此，首選要選擇適合的溶膠_凝膠材料組分。 因?yàn)樾盘?hào)出現(xiàn)在陰性位點(diǎn)中，所以認(rèn)為所述板沒有被充分封閉，因此在隨后的測(cè)試中將封閉時(shí)間從1小時(shí)增加到2小時(shí)。實(shí)施例3 溶膠_凝膠材料的選擇為了選擇適用于固定和分析所述蛋白的溶膠-凝膠材料，分別將具有實(shí)施例2 中使用的組分 1 (25. 0 % TMOS、7. 5 % MTMS 和 5 % GPTM0S)和組分 2(25. 0 % TMOS、7. 5 % MTMS和15% GPTM0S)(孔徑比組分2_9大，因此有利于分析大分子)的兩種溶膠材料用 CDK9 (150ng/ll μ 1溶膠-凝膠材料)、人Cyclin Tl (180ng/ll μ 1溶膠-凝膠材料)、陽性對(duì)照和陰性對(duì)照分別固定，如圖9所示。然后，以與實(shí)施例2相同的方式，將所述溶膠_凝膠材料分別用抗體處理并掃描。結(jié)果，如圖9所示，組分2中⑶Κ9與抗-⑶Κ9相互結(jié)合，顯示出信號(hào)，而抗-⑶Κ9 不與人Cyclin Tl結(jié)合。為此，在隨后的實(shí)施例中使用溶膠-凝膠材料組分2。此外，將溶膠-凝膠芯片與⑶Κ9反應(yīng)，以便考察⑶Κ9是否與芯片上的人Cyclin Tl結(jié)合。將圖9所示的溶膠-凝膠芯片用脫脂奶緩沖液封閉，之后使其與CDK9(60ng/rxn 體積60 μ 1)反應(yīng)并沖洗。然后，將它與1 500稀釋的可結(jié)合⑶Κ9的抗-⑶Κ9抗體在室溫下反應(yīng)1小時(shí)，隨后沖洗。然后，將它與1 1000稀釋的Cy3-標(biāo)記的二級(jí)抗體在室溫下反應(yīng)1小時(shí)并掃描。結(jié)果，如圖10可見，在組分1中，甚至在陰性位點(diǎn)中也有信號(hào)出現(xiàn)，而在組分2 中，信號(hào)在人Cyclin Tl與⑶K9相互結(jié)合的位點(diǎn)中可見。此外，在未使⑶K9反應(yīng)的孔中， 抗-CDK9不與人Cyclin Tl結(jié)合。從上述結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，組分1適用于分析蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。此外，用基于芯片的分析系統(tǒng)確認(rèn)芯片上⑶K9與人Cyclin Tl之間的結(jié)合。實(shí)施例4 用基于芯片的分析系統(tǒng)篩選天然物質(zhì)文庫用實(shí)施例2和3中建立的用于蛋白質(zhì)_蛋白質(zhì)相互作用的基于芯片的分析系統(tǒng)， 篩選天然物質(zhì)文庫。天然物質(zhì)文庫包含21種放線菌培養(yǎng)提取物，40種真菌培養(yǎng)提取物和 19種植物提取物，它們可從韓國生命科學(xué)與生物技術(shù)研究院(KRIBB)獲得。將各種放線菌培養(yǎng)提取物溶于1 1的丙酮和水中，將各種植物提取物溶于水中，濃度為5mg/mL。首先，選擇放線菌培養(yǎng)提取物#15、真菌培養(yǎng)提取物(培養(yǎng)基A) #25、真菌培養(yǎng)提取物(培養(yǎng)基B)#55和植物提取物#411，用于基于芯片的分析。將1 100稀釋的各種天然物質(zhì)提取物1 μ 1、人Cyclin Tl和⑶Κ9 (對(duì)照)各150ng，與溶膠-凝膠材料組分2混合， 以制成體積11 μ 1。然后，將混合物分別固定在96孔板上。將板用脫脂奶緩沖液封閉，之后使之與⑶Κ9 (60ng/rxn體積60 μ 1)反應(yīng)并沖洗。 然后，將板與1 500稀釋的可結(jié)合⑶Κ9的抗-⑶Κ9抗體在室溫下反應(yīng)1小時(shí)，隨后沖洗。然后，將板與1 1000稀釋的cy3標(biāo)記的二級(jí)抗體在室溫下反應(yīng)1小時(shí)。結(jié)果，如圖11可見，即使在未允許⑶K9反應(yīng)的孔中也出現(xiàn)人Cyclin Tl的信號(hào)，不過認(rèn)為這種信號(hào)是看似信號(hào)的背景，因?yàn)槿苣z-凝膠位點(diǎn)是在干燥過長的時(shí)間后才掃描 。 為此，在干燥恒定的時(shí)間后掃描位點(diǎn)。實(shí)施例5 基于芯片分析系統(tǒng)的溶膠_凝膠材料的改進(jìn)為了改變?nèi)苣z-凝膠的配方以尋找能夠最易發(fā)生⑶K9與CyclinTl的相互作用的組分，改變組分1中三種硅酸鹽單體與緩沖液的組分，以制備具有與組分1不同孔徑的新組分。為了分析各種組分中蛋白質(zhì)_蛋白質(zhì)相互作用，將BSA與各種組分的溶膠_凝膠材料混合，并點(diǎn)樣于96孔板上。具體地，將500ng/yl BSA與各種組分的溶膠-凝膠材料混合，并點(diǎn)樣于96孔板上。為了分析信號(hào)，將板與1 500稀釋的Cy3-抗-BSA反應(yīng)1小時(shí)，然后沖洗并掃描。結(jié)果，如圖12 所見，組分 T 和組分 3(25. 0% TM0S、7. 5% MTMS,0% GPTM0S，2_9C) 中的信號(hào)要比最初的組分1 (2-9)強(qiáng)，并且剩余組分的溶膠_凝膠位點(diǎn)在分析期間從孔上脫罔。組分3(2-9C)和組分1(2-9)用于固定BSA并以上述相同的方式進(jìn)行分析，分析各自的信號(hào)。結(jié)果，可以看出，組分3的信號(hào)比組分1的信號(hào)清晰(圖13)。實(shí)施例6 用基于芯片的分析篩選天然物質(zhì)如圖14所示，用實(shí)施例5中確定的組合物建立蛋白-蛋白相互作用分析系統(tǒng)，用于完整篩選天然物質(zhì)?；谶x擇的三種天然物質(zhì)制造低密度芯片并進(jìn)行測(cè)試。結(jié)果，如圖 15所示，當(dāng)僅允許抗-CDK9以及二級(jí)抗體反應(yīng)時(shí)，信號(hào)僅在CDK9和天然物質(zhì)固定的位點(diǎn)中出現(xiàn)，而當(dāng)允許⑶K9、抗-⑶K9以及二級(jí)抗體反應(yīng)時(shí)，信號(hào)可在⑶K9、天然物質(zhì)和人Cyclin Tl固定的位點(diǎn)中出現(xiàn)，但觀察到該信號(hào)較弱。由此可見，在天然物質(zhì)中，放線菌培養(yǎng)提取物#15、真菌培養(yǎng)提取物(培養(yǎng)基 A) #25、真菌培養(yǎng)提取物(培養(yǎng)基B) #55和植物提取物#411對(duì)CDK9與人Cyclin Tl之間的結(jié)合影響較弱。實(shí)施例7 抑制⑶K9與Cyclin Tl之間相互作用的核酸標(biāo)記物的開發(fā)為了證實(shí)本發(fā)明的基于芯片的系統(tǒng)是否可用于開發(fā)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的抑制劑，使用該基于芯片的系統(tǒng)制備適體并測(cè)試。當(dāng)⑶K9與CyclinTl在體內(nèi)相互結(jié)合時(shí)，蛋白質(zhì)中的T與CyclinTl的C末端區(qū)域結(jié)合，當(dāng)發(fā)生細(xì)胞分裂時(shí)RNA聚合酶也在此結(jié)合(圖16)。通過刪除與⑶K9結(jié)合的CyclinT 的細(xì)胞周期蛋白盒的C-末端區(qū)域來制備新蛋白，并用SELEX法制備它的RNA適體。用于制備該適體的模板如下模板GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATT-N40-AGATAGTAAGTGCAATCT具體地，制備具有40-bp隨機(jī)序列的單鏈，通過PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行反向轉(zhuǎn)錄，由此制備復(fù)雜度IO15的RNA文庫。用過濾結(jié)合分析技術(shù)，將CyclinTl固定在硝酸纖維膜上，該膜上容易結(jié)合蛋白質(zhì)，但不結(jié)合DNA和RNA。
具體地，將RNA文庫與目標(biāo)蛋白CyclinT以1 1的比例混合并使之反應(yīng)2小時(shí)。 然后，將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上并過濾，洗掉不與蛋白質(zhì)結(jié)合的RNA分子。將蛋白質(zhì)-RNA從膜上洗脫并用PCI處理，然后從乙醇中沉淀，從而獲得RNA。將獲得的RNA通過 PCR擴(kuò)增并進(jìn)行反向轉(zhuǎn)錄，從而制備新文庫，將通過SELEX進(jìn)行分析。以上過程重復(fù)8次，從而獲得Cyclin T的適體(圖17)。將適體克隆到TA克隆載體中，然后從中收集克隆體并測(cè)序以確定適體序列(SEQ ID NO 7-10)，并且確定適體的二級(jí)結(jié)構(gòu)。此處使用的引物如下SEQ ID NO 7 UUACAGAACAACCAACGUCGCUCCGGGUACUUCUUCAUCGSEQ ID NO 8 ACCATCGCGGAAGTCCAGTCTGCCATCAAAATCCGAAGTGSEQ ID NO 9 AATTCTCTCTCTTCATAATATTCCGGCGTCTACATCCACTSEQ ID NO: 10:CACGCGTTCAACCCCCGGAATTTAGCAATAGCAGATTACG可以看出，該適體將與CyclinIl的N-末端區(qū)域結(jié)合，以抑制CyclinIl與⑶K9之間的相互作用，以便抑制RNA聚合酶的結(jié)合，從而抑制細(xì)胞的增殖(圖18)。使用溶膠-凝膠2-9C組分，固定CyclinTl，并用CyclinTl分析與適體的結(jié)合。具體地，將四種Cy3-標(biāo)記的適體分別在固定CyclinTl的孔中反應(yīng)2小時(shí)。沖洗并掃描反應(yīng)產(chǎn)物，從而分析該適體是否與CyclinTl結(jié)合(圖19)。具體地，CyclinTl (lmg/lml)與溶膠-凝膠組分3混合并點(diǎn)樣于96孔板上，由此制成其上固定有CyclinTl的芯片。將板的每個(gè)孔依次與⑶K9、抗-⑶K9以及Cy3_標(biāo)記的二級(jí)抗體反應(yīng)，隨后沖洗。結(jié)果，在不與CyclinTl結(jié)合的適體所在的孔中，溶膠凝膠中的CyclinTl與⑶K9 相互結(jié)合顯示信號(hào)，而在適體與CyclinTl結(jié)合的孔中，沒有觀察到信號(hào)。該結(jié)果說明，本發(fā)明的基于芯片的篩選系統(tǒng)可以用于篩選蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的抑制劑。工業(yè)應(yīng)用性如上所述，本發(fā)明的蛋白芯片可以容易地用溶膠-凝膠材料在96孔板中制備，由此可以容易地從天然文庫中篩選抑制蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的抑制劑。雖然已經(jīng)針對(duì)具體特征對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)描述，然而本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯可知， 該描述僅是優(yōu)選的實(shí)施方式，并不限制本發(fā)明的范圍，因此，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)范圍將通過所附權(quán)利要求及其等同體來限定。
權(quán)利要求
1.一種篩選抑制蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的物質(zhì)的方法，所述方法包括步驟(a)制造蛋白質(zhì)芯片，所述蛋白質(zhì)芯片上固定有包含溶膠-凝膠材料與蛋白質(zhì)的混合物的位點(diǎn)；(b)在存在抑制蛋白質(zhì)之間結(jié)合的候選物質(zhì)的情況下，使所述蛋白質(zhì)芯片與能和所述芯片上固定的蛋白質(zhì)相結(jié)合的蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)；和(c)測(cè)量所述芯片上固定的蛋白質(zhì)與能和所述固定的蛋白質(zhì)相結(jié)合的蛋白質(zhì)之間的結(jié)合，如果與不存在所述候選物質(zhì)的情況下相比，測(cè)得蛋白質(zhì)之間的結(jié)合受到抑制，則選擇所述候選物質(zhì)作為抑制蛋白質(zhì)_蛋白質(zhì)相互作用的物質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述候選物質(zhì)選自天然的物質(zhì)、化合物和適體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述步驟(c)中蛋白質(zhì)之間的結(jié)合是用所述蛋白質(zhì)的抗體來分析，所述蛋白質(zhì)的抗體是能與蛋白質(zhì)芯片上固定的蛋白質(zhì)相結(jié)合的蛋白質(zhì)的抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述位點(diǎn)是固定在96孔板上。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述蛋白質(zhì)芯片上固定的蛋白質(zhì)是CyclinTl，并且所述能與蛋白芯片上固定的蛋白質(zhì)結(jié)合的蛋白質(zhì)是CDK9。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，所述溶膠-凝膠物質(zhì)包括17.5重量份的TM0S、5-15重量份的MTMS禾口 0-15重量份的GPTMOS。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種篩選抑制蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的物質(zhì)的方法，更具體地涉及一種篩選抑制蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的物質(zhì)的方法，所述方法包括使用一種固定有包含溶膠-凝膠材料與蛋白質(zhì)的混合物的位點(diǎn)的蛋白質(zhì)芯片。根據(jù)本發(fā)明，蛋白質(zhì)芯片可以容易地用溶膠-凝膠材料在96孔板中制造，從而可以容易地從天然物質(zhì)的文庫中篩選抑制蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的抑制劑。
文檔編號(hào)G01N33/15GK102449476SQ201080023581
公開日2012年5月9日 申請(qǐng)日期2010年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月28日
發(fā)明者金邵妍 申請(qǐng)人:東國大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力團(tuán)