專利名稱：一種檢測q熱立克次體抗體的蛋白懸浮芯片系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型涉及一種檢測Q熱立克次體抗體的蛋白懸浮芯片系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
伯氏考克斯體(Coxiella burnetii, Cb)俗稱Q熱立克次體，是人和動物Q熱的病原體，為革蘭氏染色陰性的嚴格胞內(nèi)寄生菌。急性Q熱常表現(xiàn)為發(fā)熱、頭痛、肌肉酸痛常伴有肺炎、肝炎等。慢性Q熱表現(xiàn)為心內(nèi)膜炎、肉芽腫性肝炎、骨髓炎等。近年來，Q熱性腦膜炎、腎小球腎炎、孕婦流產(chǎn)等亦有報道。免疫學(xué)方法酶聯(lián)免疫實驗(ELISA)中利用抗原與抗體特異性反應(yīng)來檢測抗原或抗體主要有由雙抗原夾心測抗體、雙抗體夾心測抗原、競爭法、間接法等。間接法測抗體的原理是特異性抗原結(jié)合到固相載體上，然后和待檢血清中的相應(yīng)抗體結(jié)合形成免疫復(fù)合物，洗滌后再加酶標記抗體與免疫復(fù)合物中的抗體結(jié)合形成酶標記抗體-抗體-固相抗原復(fù)合物，加底物顯色，判斷抗體含量。懸浮芯片(suspension array)也稱液相芯片，是20世紀70年代美國Luminex公司研制出的新一代生物芯片技術(shù)，利用帶編碼的微球體作為載體，流式細胞儀作為檢測平臺，對核酸、蛋白質(zhì)等生物分子進行大規(guī)模測定。目前，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于免疫分析、核酸研究、酶學(xué)分析、抗體篩選及受體與配體的識別分析等領(lǐng)域。目前發(fā)展的懸浮芯片主要是基于實驗室檢測方法的建立和方法評價及優(yōu)化，以縮短檢測時間，降低方法的檢測成本。但是懸浮芯片是否能夠檢測人血清中的Q熱立克次體抗體，其定量檢測能力如何，尚缺乏模型和評價。

實用新型內(nèi)容本實用新型的目的在于提供一種檢測Q熱立克次體病原體抗體的蛋白懸浮芯片系統(tǒng)，該芯片系統(tǒng)包括芯片基體、加液系統(tǒng)、懸浮芯片檢測儀和計算機，其中，芯片基體內(nèi)裝有相關(guān)緩沖溶液和待測抗體，相關(guān)緩沖液中設(shè)置有包被捕獲抗原的043號編碼微球，加液系統(tǒng)與芯片基體連通，以向芯片基體中加入生物素標記的二抗、熒光信號檢測物，懸浮芯片檢測儀包括微細管檢測通道和檢測激光，微細管檢測通道與芯片基體連通，該微細管檢測通道吸入反應(yīng)后的溶液、以使得每個編碼微球依次通過微細管檢測通道，檢測激光激發(fā)并識別編碼微球的顏色及其上待測物的熒光信號，計算機與懸浮芯片檢測儀相連，并記錄、分析懸浮芯片檢測儀的測量結(jié)果。進一步，所述相關(guān)緩沖溶液包括用于所述待測抗體稀釋的樣品稀釋液、稀釋所述編碼微球所用的微球稀釋液、稀釋所述生物素標記的二抗所用的抗體稀釋液、每個反應(yīng)之后洗滌編碼微球所用的微球清洗液、SA-PE稀釋液、檢測緩沖液。進一步，所述捕獲抗原優(yōu)選為Q熱立克次體coml蛋白。進一步，所述待測抗體為血清樣品。進一步，所述生物素標記的二抗優(yōu)選為Biotin-羊抗兔IgG和/或Biotin-羊抗AlgGo 進一步，所述熒光信號檢測物為鏈親和素-藻紅蛋白。進一步，所述芯片基體為96孔濾板或者微量離心管。進一步，所述檢測激光包括用激發(fā)所述編碼微球基質(zhì)中的顏色、識別編碼微球分類編碼以確定檢測項目的紅色激光，用于激發(fā)并識別待測分子的顏色信號、記錄信號強弱以檢測所述待測抗體的含量的綠色激光。經(jīng)過大量和深入的研究，對Q熱立克次體抗體的蛋白懸浮芯片制備及其檢測條件作了實質(zhì)性的改進和創(chuàng)新，其具有下列優(yōu)點1、抗原包被量的改進Q熱立克次體coml蛋白的包被量是成功檢測的關(guān)鍵，本實用新型對包被微球的抗原包被量進行實質(zhì)性優(yōu)化使血清樣本的檢測效果非常良好，并且包被懸浮芯片所需的抗原包被量很低，本實用新型的Q熱立克次體coml蛋白抗原包被量為0. 01 200 μ g/1. 25 X 106 個編碼微球或0. 002 800ng/2500 5000個微球/測試，而一般的ELISA試驗所需抗原的包被量為Iyg/測試。2、生物素標記的改進通常，標記抗體需要使用過量的生物素。理論上講，在檢測過程中，過量的生物素因未標記上抗體而不被微球上結(jié)合捕獲抗體的抗原連接，清洗時被抽濾掉，不會與隨后加入的SA-PE反應(yīng)，不影響檢測。但在實際檢測過程中，偶爾遇到過檢測信號可能過高的現(xiàn)象，因此建議生物素標記抗體后，盡量去除多余的生物素。以標記ang/mL的IgG(分子量 150，000) ImL溶液為例，需加入IOmM生物素溶液約27 μ L。3、檢測的靈敏度及動態(tài)范圍本實用新型的血清樣品Q熱立克次體抗體的蛋白懸浮芯片定量檢測方法和懸浮芯片的靈敏度為滴度0.000000003 ；并且懸浮芯片方法動態(tài)檢測范圍為1 4096000 1 16000。4、方法的特異性本實用新型通過選用Q熱立克次體的coml蛋白為包被抗原，以兔抗Q熱立克次體血清抗體為待測抗體，以生物素化-羊抗兔IgG為檢測物。本研究試驗證明，在存在兔抗圣路易斯腦炎NSl血清、兔抗天花血清、鼠抗西尼羅E血清、兔抗委內(nèi)瑞拉馬腦炎血清、兔抗馬秋波抗體、兔抗土拉抗體、兔抗登革熱血清、兔抗西方馬腦炎抗體、兔血清、大鼠血清、小鼠血清、BSA、酪蛋白、胰蛋白胨等干擾抗體或蛋白存在條件下本方法具有良好的特異性。5、樣品的檢測能力本實用新型評價了懸浮芯片方法對人血清的檢測能力。通過人血清的檢測，初步證實了該方法在檢測人血清中Q熱立克次體抗體的實用性。

圖1為本實用新型結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為包被有Q熱立克次體coml蛋白的043號微球檢測Q熱立克次體抗體示意圖1 ；圖3為包被有Q熱立克次體coml蛋白的043號微球檢測Q熱立克次體抗體示意圖2;圖4為蛋白懸浮芯片方法檢測兔抗Q熱立克次體IgG劑量-反應(yīng)標準曲線。
具體實施方式
如圖1至圖4所示，本實用新型一種檢測Q熱立克次體病原體抗體的蛋白懸浮芯片系統(tǒng)，包括芯片基體1、加液系統(tǒng)2、懸浮芯片檢測儀3和計算機4，其中，芯片基體1為96 孔濾板或者微量離心管，其內(nèi)裝有相關(guān)緩沖溶液和待測抗體，相關(guān)緩沖液中設(shè)置有043號編碼微球，編碼微球上包被有Q熱立克次體coml蛋白，用于捕獲待檢測血清樣品中的待測抗體，如果樣品中有Q熱立克次體抗體，Q熱立克次體抗體與編碼微球上的Q熱立克次體 coml蛋白結(jié)合，再加入帶有生物素標記的二抗，形成編碼微球-Q熱立克次體coml蛋白-Q 熱立克次體抗體-二抗-生物素復(fù)合物，最后加入鏈親和素-藻紅蛋白，鏈親和素與生物素結(jié)合，形成編碼微球-Q熱立克次體coml蛋白-Q熱立克次體抗體-二抗-生物素-鏈親和素-藻紅蛋白復(fù)合物，通過懸浮芯片檢測儀對藻紅蛋白熒光信號的檢測來達到對血清樣品中Q熱立克次體抗體的檢測，如果血清樣品中沒有Q熱立克次體抗體，包被有Q熱立克次體coml蛋白的編碼微球不會與后面加入的生物素標記的二抗、鏈親和素-藻紅蛋白結(jié)合， 最后通過懸浮芯片檢測儀器進行檢測時無熒光信號或應(yīng)該信號非常弱。上述芯片系統(tǒng)中，編碼微球在微球稀釋液，待測抗體在樣品稀釋液中，生物素標記的二抗在抗體稀釋液中，熒光信號檢測物在SA-PE稀釋液中，懸浮芯片檢測儀檢測時編碼微球復(fù)合物在檢測緩沖液中，每步結(jié)合之后均用微球清洗液洗滌微球，使得沒有結(jié)合的物質(zhì)清除體系。懸浮芯片的基本原理是利用聚苯乙烯(polystyrene)所制作的微球，包覆不同比例的紅光及紅外光發(fā)色劑，而產(chǎn)生100種不同比例顏色，作為100種獨特的色彩編號，每顆微球大小約5. 6 μ m，可依不同研究目的如免疫分析、核酸研究、酶分析、受體和配體識別分析等，并根據(jù)不同研究目的而標定特定抗體、核酸探針及各種受體探針。標記探針的微球與待測物在96孔板中進行反應(yīng)。反應(yīng)后，利用機器自動將反應(yīng)液吸起并通過一微細管檢測通道，每次僅允許一個微球通過檢測通道。檢測通道中設(shè)有兩道激光，一道為紅色，激發(fā)微球基質(zhì)中的顏色，識別微球分類編碼以確定檢測項目；一道為綠色，激發(fā)報告分子的顏色，記錄信號強弱以檢測待測物的含量。當待測樣本與特定微球的探針吸附在一起時，兩道激光所激發(fā)的光都可被檢測到。而若樣本中不含該標的物，則僅有微球中的激發(fā)光可被檢測到。 再通過機器與計算機自動統(tǒng)計分析兩道激光所激發(fā)的微球種類與數(shù)量，從而判定待測樣本中有幾種測試目標物在其中，得知測試樣本中有無待測病原存在，或同時存在有幾種至數(shù)十種病原。懸浮芯片技術(shù)由于利用微球在溶液中反應(yīng)，克服了片膜芯片在大分子檢測時受表面張力、空間效應(yīng)等對反應(yīng)動力學(xué)的影響，同時利用激光檢測技術(shù)，大大提高了樣品檢測的準確性和重復(fù)性，具有優(yōu)于片膜芯片的操作簡便、重復(fù)性好等特點。本實用新型一種檢測Q熱立克次體抗體的蛋白懸浮芯片系統(tǒng)，通過下面的具體實施方式
作進一步說明，但本實用新型不以任何方式受該實施例的限定。一、材料1.蛋白懸浮芯片的相關(guān)緩沖液(I)PBS 緩沖液(pH7. 4) =NaCl 137mmol/L ；KCl 2. 7mmol/L ；Na2HPO4IOmmo 1/L ；KH2PO4 2mmol/L0 用 800mL 蒸餾水溶解 8gNaCl，0. 2gKCl，1. 44gN￡i2HP04 和 0. 24g KH2PO40 用 HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7. 4，加水至1L。分裝后在121°C高壓滅菌20分鐘，或過濾除菌，保
存于室溫。(2)微球清洗液:PBS(ρΗ7· 4) ,0. 05% Tween-20。(3)微球活化緩沖液 IOOmM NaH2PO4 :3g NaH2PO4, 5N NaOH 1. 5mL，定容于 250mL， ρΗ6· 2。(4)微球包被緩沖液 0· 05Μ MES, pH5. 0 2. 44g MES，5N NaOH 0. 15mL，定容于 250mLo(5)微球保存液 PBS-TBN :PBS，0. 1 % BSA，0. 02 % Tween-20,0. 05 % 疊氮化物， ρΗ7· 4。(6)微球封閉液 PBS-BN =PBS, 1% BSA,0. 05%疊氮化物，ρΗ7· 4。(7)檢測緩沖液:PBS,1% BSA, ρΗ7· 4。(8)抗體稀釋液 PBS，ρΗ7· 4。。(9)微球稀釋液:PBS, 1 % BSA, ρΗ7· 4。(10)樣品稀釋液 PVX :PBS,0. 5% PVA,0. 8% PVP ；(11) SA-PE 稀釋液:PBS (ρΗ7· 4), 1% BSA02.抗原與抗體本實用新型所使用抗原Q熱立克次體coml蛋白，其可購自中國檢驗檢疫科學(xué)研究院衛(wèi)檢所。本實用新型所使用待測抗體為兔抗Q熱立克次體IgG，其可購自中國檢驗檢疫科學(xué)研究院衛(wèi)檢所，檢測抗體為生物素化羊抗兔IgG和生物素化羊抗兔IgG和羊抗人IgG，其可購自鼎國生物有限公司。二、待測樣品的制備1、目標分析物樣品的制備目標分析物為兔抗Q熱立克次體IgG，干擾樣品或作為方法特異性測試的樣品是目標檢測物外的其它抗體或其它蛋白質(zhì)，包括兔抗圣路易斯腦炎NSl血清、兔抗天花血清、 鼠抗西尼羅E血清、兔抗委內(nèi)瑞拉馬腦炎血清、兔抗馬秋波抗體、兔抗土拉抗體、兔抗登革熱血清、兔抗西方馬腦炎抗體、兔血清、大鼠血清、小鼠血清、BSA、酪蛋白、胰蛋白胨等。將上述待分析樣品均溶于樣品稀釋液液中，4°C保存。將待分析的兔抗Q熱立克次體血清用樣品稀釋液以4倍倍比系列稀釋為不同濃度樣品，以繪制樣品檢測劑量-反應(yīng)的標準曲線，其中幾個樣品濃度低于檢測的敏感度，高濃度樣品應(yīng)使編碼微球的結(jié)合位點處于飽和狀態(tài)。2、人血清樣本的處理將人血清樣本用樣品稀釋1 10稀釋，例如人血清樣本5 μ L加樣品稀釋液50 μ L 混勻后，作為待檢樣品進行懸浮芯片方法的檢測。實施例1、檢測Q熱立克次體抗體的蛋白懸浮芯片的制備1、捕獲抗原包被編碼微球本實用新型采用的043號編碼微球購自美國Bio-Rad公司，編碼微球用于標記可以捕獲Q熱立克次體抗體的Q熱立克次體coml蛋白抗原，即利用Q熱立克次體coml蛋白包被微球。A、編碼微球的活化取100 μ L (1. 25 X IO6個)編碼微球到1. 5mL離心管中，14000 X g離心，小心吸出并棄去上清液。加入100 μ L的微球清洗緩沖液懸浮，震蕩并超聲后14000 Xg離心，小心吸出并棄去上清液。加入100 μ L的微球活化緩沖液，接著先加入10 μ L新鮮配置的EDC(50mg/ mL)，再加入10 μ L新鮮配置的50mg/mL的Sulfo-NHS，高速震蕩30秒后用鋁箔包裹，在室溫震搖20分鐘。加入150 μ L的PBS (ρΗ7. 4)，震蕩后，14000 Xg離心，小心吸出并棄去上清液。加入100 μ L的PBS (ρΗ7. 4)懸浮編碼微球。B、用抗原包被編碼微球取捕獲抗原Q熱立克次體coml蛋白抗原1 100 μ g加入到活化后的編碼微球中，用PBS緩沖液定容至500 μ L，室溫震搖2小時。14000Xg離心，小心吸出并棄去上清液。用500 μ L的PBS緩沖液洗一次，14000 Xg離心，小心吸出并棄去上清液。加入250 μ L 的封閉緩沖液懸浮編碼微球，在室溫震搖30分鐘，14000 Xg離心，小心吸出并棄去上清液。 加入500 μ L的微球保存液洗滌編碼微球，16000 Xg離心，小心吸出并棄去上清液。最后用 150 μ L的微球保存液懸浮編碼微球，于4°C避光保存?zhèn)溆?。C、包被微球的計數(shù)吸取適量微球，稀釋后，用血球計數(shù)板(0. 10mm;l/400mm2)在普通顯微鏡下計數(shù)。 根據(jù)公式(每個大格數(shù)Xio4X稀釋倍數(shù)X體積(mL))計算微球數(shù)量。2、檢測抗體標記生物素A、生物素的標記分別配制好濃度為IOmM生物素溶液和^iig/mL的待標記抗體溶液，將計算好體積的生物素加入到待標記抗體溶液中，在室溫震搖30分鐘(或冰上2小時)，過柱脫鹽后分裝，-20°C凍存?zhèn)溆?。B、抗體的用量以標記2mg/mL的IgG (分子量150，000) ImL溶液為例，需加入IOmM生物素溶液約 27 μ 1。實施例2、懸浮芯片制備法條件的優(yōu)化1、微球包被抗原包被量的選擇分另Ij以 1μ g、5y g、10y g、15y g、20y g、25y g、30y g、35y g、40y g、45y g、 50 μ g、100 μ g的量包被100 μ L編碼為043號的微球。經(jīng)檢測效果比較，以1 100 μ g/1. 25 X IO6個編碼微球即0. 2 400ng/2500 5000個微球/包被效果最好，顯微鏡下計數(shù)后避光冷藏保存待用。如圖1所示，包被Q熱立克次體coml蛋白抗原的043號微球均落在其正確檢測區(qū)域內(nèi)，并且獲得高信噪比結(jié)果(MFI值遠大于2000)，說明優(yōu)化的懸浮芯片檢測系統(tǒng)可成功用于Q熱立克次體抗體的檢測。2、生物素化抗體的優(yōu)化本實用新型分別用氨基活性的生物素，例如LC-酰胼(hydrazide)-生物素和羧基活性的生物素，例如Sulfo-NHS-生物素和SH-活性的生物素標記檢測抗體，經(jīng)質(zhì)控過程檢測效果比較，本實驗中Sulfo-NHS-生物素標記檢測抗體檢測效果較好，檢測效果的方法采用本領(lǐng)域的常規(guī)方法或安裝制造商的產(chǎn)品說明書所述的方法。
7[0074]本實用新型中經(jīng)過試驗驗證，發(fā)現(xiàn)ang/mL生物素化的羊抗兔抗體以1 500稀釋作為檢測抗體進行檢測兔血清中Q熱立克次體抗體，檢測結(jié)果顯示生物素化檢測抗體 Bio-羊抗兔抗體可獲得高檢測值和低背景值的檢測效果；2mg/mL生物素化羊抗人抗體以1 2500稀釋作為檢測人血清中Q熱立克次體抗體，檢測結(jié)果顯示生物素化檢測抗體 Bio-羊抗人抗體可獲得高檢測值和低背景值的檢測效果。實施例3、樣品的制備、檢測及結(jié)果判定1、待測樣品制備用樣品稀釋液將待測樣本配置為不同濃度樣本進行蛋白懸浮芯片檢測。2、樣品的檢測及結(jié)果判定檢測過程全部反應(yīng)均在96孔濾板上進行，檢測過程如下1)每孔加入50 μ L含相應(yīng)編碼微球的工作溶液，用清洗液洗滌并用真空泵抽濾；2)加入50 μ L檢測樣品，混勻后室溫避光震搖30分鐘，用清洗液洗滌并抽濾；3)加入50 μ L適當濃度的用抗體稀釋液稀釋后的生物素化抗體，混勻后室溫避光震搖30分鐘，洗液洗滌并真空泵抽濾；4)加入50 μ L的SA-PE，混勻后室溫避光震搖10分鐘。洗液洗滌并真空泵抽濾；5)加入125 μ L的檢測緩沖液，經(jīng)蝸旋重懸混勻；6)用懸浮芯片系統(tǒng)讀取MFI數(shù)值并分析數(shù)據(jù)。3、檢測結(jié)果判定根據(jù)試驗研究結(jié)果與相關(guān)研究報道，本實用新型定義蛋白懸浮芯片方法檢測Q熱立克次體抗體的最低檢出限(L0D值)為檢測熒光強度臨界值(Cutoff)對應(yīng)的檢測物濃度。其中，Cutoff的定義是采用空白對照樣品(Blank)熒光檢測信號MFI均值加3倍標準差(SD)JP Cutoff值為=MFI (空白對照)+3倍標準差。若檢測結(jié)果高于Cutoff對應(yīng)熒光強度值則判定為Q熱立克次體抗體檢測結(jié)果陽性；若檢測結(jié)果低于Cutoff對應(yīng)熒光強度值則判定為Q熱立克次體抗體檢測結(jié)果陰性。實施例4、懸浮芯片對Q熱立克次體coml蛋白抗原的特異性試驗應(yīng)用懸浮芯片檢測方法分別對兔抗Q熱立克次體coml抗體、兔抗圣路易斯腦炎 NSl血清、兔抗天花血清、鼠抗西尼羅E血清、兔抗委內(nèi)瑞拉馬腦炎血清、兔抗馬秋波抗體、 兔抗土拉抗體、兔抗登革熱血清、兔抗西方馬腦炎抗體、兔血清、大鼠血清、小鼠血清、BSA、 酪蛋白、胰蛋白胨等進行檢測，根據(jù)實施例3中檢測結(jié)果判定標準，僅兔抗Q熱立克次體IgG 為陽性，其余干擾抗體或蛋白均為陰性。說明本實用新型所建立的Q熱立克次體抗體的懸浮芯片檢測方法與其它測試抗體均不發(fā)生交叉反應(yīng)或非特異反應(yīng)。實施例5、對血清樣品中Q熱立克次體抗體的懸浮芯片定量檢測1、兔抗Q熱立克次體抗體標準曲線樣品制備用樣品稀釋液將兔抗Q熱立克次體抗體標準品由免疫兔血清以4倍倍比梯度稀釋成系列濃度樣品。2、劑量-反應(yīng)標準曲線的繪制按照實施例3中的檢測方法檢測上述系列濃度樣品，并根據(jù)懸浮芯片系統(tǒng)檢測結(jié)果繪制劑量-反應(yīng)標準曲線(如圖2所示)。其中，X軸代表血清抗體滴度，Y軸代表懸浮芯片儀檢測的熒光值(MFI)。每個數(shù)據(jù)代表3次的檢測結(jié)果平均值，坐標軸以對數(shù)-對數(shù)關(guān)系設(shè)定，圖2中兔抗Q熱立克次體的血清分別為做4倍倍比稀釋范圍為Sl :1 262144000, S2 1 65536000,S3 1 16384000，S4 1 4096000, S5 1 1024000, S6 1 256000， S7 1 64000, S8 1 16000, S9 1 4000, SlO 1 1000。懸浮芯片系統(tǒng)根據(jù)檢測結(jié)果擬合兔抗Q熱立克次體IgG劑量-反應(yīng)標準曲線方程為FI = 1. 57935+(22140. 2-1. 57935) / [1+(Conc/1. 2242Ε-005Γ3 27062]0 Μ733、本實用新型懸浮芯片法檢測血清中兔抗Q熱立克次體IgG的靈敏度和動態(tài)范圍根據(jù)最低檢出限定義和劑量-反應(yīng)標準曲線方程，本實用新型即蛋白懸浮芯片方法檢測兔抗Q熱立克次體IgG的靈敏度為0. 000000003 (Cutoff = 28. 168，MFI (空白對照平均值)=27，標準差=1.68)。本實用新型定義最高檢出限為使編碼微球的結(jié)合位點處于飽和狀態(tài)的檢測物濃度。根據(jù)標準曲線隨著兔抗Q熱立克次體coml抗體濃度的升高，其對應(yīng)的MFI值也隨之遞增，當兔抗Q熱立克次體coml抗體滴度超過1 16000時，抗原抗體的免疫反應(yīng)未達到飽和狀態(tài)，MFI值還沒進入平臺期，說明樣品中的待檢物濃度還沒達到使MFI值飽和的濃度，需要高濃度的樣品再檢測，但受樣品滴度只能達到1 16000的限制未能確定最高檢測限，但可初步判定本實用新型即懸浮芯片定量檢測兔抗Q熱立克次體血清的動態(tài)范圍為 1 4096000 1 16000。實施例6、人血清樣品的檢測1、人血清樣品的準備將人血清樣品用樣品稀釋液1 10稀釋(人血清樣本5 μ L加樣品稀釋液50 μ L 混勻)后用于蛋白懸浮芯片檢測。2、人血清樣品的檢測1)每孔加入50 μ L含相應(yīng)編碼微球的工作溶液，用清洗液洗滌并用真空泵抽濾；2)加入50 μ L待檢測人血清樣品，混勻后室溫避光震搖30分鐘，用清洗液洗滌并抽濾；3)加入50 μ L適當濃度的用抗體稀釋液稀釋后的生物素化羊抗人抗體，混勻后室溫避光震搖30分鐘，洗液洗滌并真空泵抽濾；4)加入50 μ L的SA-PE，混勻后室溫避光震搖10分鐘。洗液洗滌并真空泵抽濾；5)加入125 μ L的檢測緩沖液，經(jīng)蝸旋重懸混勻；6)用懸浮芯片系統(tǒng)讀取MFI數(shù)值，根據(jù)標準曲線，確定待檢測人血清中Q熱立克次體抗體的濃度。經(jīng)過多次重復(fù)試驗，生物素化羊抗人IgG稀釋比例選用1 2500稀釋，SA-PE稀釋比例選用1 300稀釋，經(jīng)過對94份人血清的檢測，所得的MFI值的均值與其標準差的3 倍之和為作為判斷陰陽性的界值，即Cutoff值為1971，檢測得到的MFI值如果大于1971， 即血清中的Q熱立克次體抗體濃度過高，可視為Q熱立克次體抗體陽性可能被Q熱立克次體病毒感染，如果MFI值小于1971，即血清中的Q熱立克次體抗體濃度低正常值可判斷為Q 熱立克次體抗體陰性，未感染Q熱立克次體病原體或Q熱立克次體病原體隱性攜帶者。
權(quán)利要求1.一種檢測Q熱立克次體病原體抗體的蛋白懸浮芯片系統(tǒng)，其特征在于，該芯片系統(tǒng)包括芯片基體、加液系統(tǒng)、懸浮芯片檢測儀和計算機，其中，芯片基體內(nèi)裝有043號編碼微球，加液系統(tǒng)與芯片基體連通，以向芯片基體中加入生物素標記的二抗、熒光信號檢測物， 懸浮芯片檢測儀包括微細管檢測通道和檢測激光，微細管檢測通道與芯片基體連通，該微細管檢測通道吸入反應(yīng)后的溶液、以使得每個編碼微球依次通過微細管檢測通道，檢測激光激發(fā)并識別編碼微球的顏色及其上待測物的熒光信號，計算機與懸浮芯片檢測儀相連， 并記錄、分析懸浮芯片檢測儀的測量結(jié)果。
2.如權(quán)利要求1所述的蛋白懸浮芯片系統(tǒng)，其特征在于，所述捕獲抗原優(yōu)選為Q熱立克次體coml蛋白。
3.如權(quán)利要求1所述的蛋白懸浮芯片系統(tǒng)，其特征在于，所述熒光信號檢測物為鏈親和素-藻紅蛋白。
4.如權(quán)利要求1所述的蛋白懸浮芯片系統(tǒng)，其特征在于，所述芯片基體為96孔濾板或者微量離心管。
5.如權(quán)利要求1所述的蛋白懸浮芯片系統(tǒng)，其特征在于，所述檢測激光包括用激發(fā)所述編碼微球基質(zhì)中的顏色、識別編碼微球分類編碼以確定檢測項目的紅色激光，用于激發(fā)并識別待測分子的顏色信號、記錄信號強弱以檢測所述待測抗體的含量的綠色激光。
專利摘要本實用新型公開了一種檢測Q熱立克次體病原體抗體的蛋白懸浮芯片系統(tǒng)，包括芯片基體、加液系統(tǒng)、懸浮芯片檢測儀和計算機，芯片基體內(nèi)裝有相關(guān)緩沖溶液和待測抗體，相關(guān)緩沖液中設(shè)置有043號編碼微球，編碼微球上包被捕獲抗原，加液系統(tǒng)依次向芯片基體中加入生物素標記的二抗、熒光信號檢測物，懸浮芯片檢測儀包括微細管檢測通道和檢測激光，編碼微球依次通過微細管檢測通道，檢測激光激發(fā)并識別編碼微球的顏色及其上待測物的顏色，計算機與懸浮芯片檢測儀相連，并記錄、分析懸浮芯片檢測儀的測量結(jié)果。懸浮芯片技術(shù)利用微球在溶液中反應(yīng)，利用激光檢測技術(shù)，提高了樣品檢測的準確性和重復(fù)性，具有優(yōu)于片膜芯片的操作簡便、重復(fù)性好等特點。
文檔編號G01N33/543GK202024995SQ20102068423
公開日2011年11月2日 申請日期2010年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月28日
發(fā)明者張樂, 楊宇, 楊永莉, 王靜 申請人:中國檢驗檢疫科學(xué)研究院