專利名稱：快速評(píng)估納米材料對(duì)呼吸系統(tǒng)生物安全性的裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型屬于評(píng)估納米材料安全性領(lǐng)域，特別是指利用細(xì)胞表面微形貌及電生理記錄結(jié)果的變化來評(píng)估納米材料安全性的技術(shù)，即快速評(píng)估納米材料對(duì)呼吸系統(tǒng)生物安全性的裝置。
背景技術(shù)：
納米材料在其生產(chǎn)、運(yùn)輸、使用和處置的過程中極有可能進(jìn)入大氣環(huán)境，通過呼吸道為人體吸收后，很可能給人類健康帶來嚴(yán)重?fù)p害并成為許多重大疾病的誘因，因此也引起了人們對(duì)納米材料的生物安全性的關(guān)注。常用的納米材料包括納米aiO，Tio2，c6(l，Cuo等， 其已被廣泛應(yīng)用于量子器件、特種精細(xì)陶瓷、太陽能利用、環(huán)保催化劑、醫(yī)藥、化妝品等與人類生活相關(guān)的諸多方面。盡管已有文獻(xiàn)報(bào)道了這些納米材料對(duì)不同層次生物系統(tǒng)(如細(xì)菌、水生生物、高等植物、哺乳動(dòng)物等)的毒性效應(yīng)，借以初步探討其進(jìn)入生命體后的生物學(xué)效應(yīng)，但這些納米材料與生命細(xì)胞相互作用的內(nèi)在機(jī)制，尤其是對(duì)活體肺泡上皮細(xì)胞微觀膜結(jié)構(gòu)及生理功能損傷機(jī)理的研究，目前缺乏有力的技術(shù)手段予以利用。掃描離子電導(dǎo)顯微鏡技術(shù)(scanning ion conductance microscope, SI CM)是 1989年加州大學(xué)的Hansma在掃描隧道顯微鏡基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)而成，基本原理為掃描SICM技術(shù)依靠負(fù)反饋電路和壓電陶瓷控制掃描用玻璃微探針，使其與樣品表面間距離保持恒定，通過記錄玻璃微探針的掃描軌跡來繪制出樣品的表面形貌。但是由于當(dāng)時(shí)負(fù)反饋控制方法及精確定位技術(shù)的局限與不足，纖細(xì)的玻璃微滴管探針在掃描時(shí)經(jīng)常意外地與樣品接觸并導(dǎo)致針尖或樣品損壞，SICM技術(shù)在其發(fā)明后的很長一段時(shí)間僅適用于平坦的聚酯薄膜掃描成像。1997年倫敦帝國理工學(xué)院的Korchev教授等將SICM技術(shù)中的直流式負(fù)反饋控制改進(jìn)為交流調(diào)制式負(fù)反饋控制，使該技術(shù)真正實(shí)現(xiàn)了在生理液態(tài)培養(yǎng)條件下實(shí)時(shí)、非接觸式、 高分辨率對(duì)活體生物樣品表面三維微觀結(jié)構(gòu)的探測，如對(duì)細(xì)胞膜的納米尺度微結(jié)構(gòu)進(jìn)行成像，包括樹突突觸結(jié)構(gòu)、上皮細(xì)胞微絨毛和心肌細(xì)胞表面微結(jié)構(gòu)等，并使其逐步發(fā)展成為與原子力顯微鏡技術(shù)(atomic force microscopy，AFM) —樣廣泛應(yīng)用于納米生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的一種先進(jìn)的顯微探測技術(shù)。70年代德國馬普研究所Neher和Mkmarm在青蛙肌細(xì)胞上用雙電極電壓鉗方法首次記錄到單通道的離子電流，從而創(chuàng)建了膜片鉗技術(shù)，此技術(shù)逐漸發(fā)展成為獲得活細(xì)胞離子通道的特性和分布信息的主要實(shí)驗(yàn)方法，其應(yīng)用使人們對(duì)離子通道本質(zhì)的認(rèn)識(shí)有了質(zhì)的飛躍。利用膜片鉗系統(tǒng)通過軟件可采集探針電阻、膜靜息電位、細(xì)胞膜離子通道的電流等多種電生理信號(hào)，這為研究者探討細(xì)胞離子通道功能提供了一種簡便有效的方法。目前對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能檢測手段存在以下不足之處掃描電鏡雖然有很高的分辨率，但由于其對(duì)樣品導(dǎo)電性的要求使其無法對(duì)不導(dǎo)電的活體生物樣品進(jìn)行三維立體成像， 只能通過在樣品表面噴鍍或?yàn)R射導(dǎo)電(鉬金)材料的特殊樣品制備方法來實(shí)現(xiàn)，耗時(shí)費(fèi)力且制樣繁瑣復(fù)雜；原子力顯微鏡通過針尖與樣品間的相互作用力來負(fù)反饋控制針尖在樣品表面的掃描成像，不僅會(huì)對(duì)生物樣品表面產(chǎn)生或多或少的力作用，且導(dǎo)致柔軟生物樣品的成像困難，尤其是無法獲得肺泡上皮微絨毛的高分辨率成像；普通膜片鉗技術(shù)雖能評(píng)估細(xì)胞的生理功能，但由于其僅借助普通光學(xué)顯微鏡進(jìn)行探針定位，受光學(xué)衍射極限限制分辨率不足，難以將細(xì)胞生理功能變化與高分辨率的膜結(jié)構(gòu)聯(lián)系起來。此外，多數(shù)納米材料安全性的評(píng)估需進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，不僅成本高耗時(shí)長，且動(dòng)物個(gè)體差異較大，導(dǎo)致結(jié)果的可靠性及重復(fù)性不好。通過建立合適的細(xì)胞模型，利用SICM技術(shù)與膜片鉗技術(shù)的結(jié)合，使得在活體細(xì)胞上從結(jié)構(gòu)和功能兩方面共同探討納米材料的安全性成為可能。
(三)實(shí)用新型內(nèi)容本實(shí)用新型的目的在于設(shè)計(jì)一種從結(jié)構(gòu)和功能上快速評(píng)估納米材料對(duì)呼吸系統(tǒng)生物安全性的裝置，它針對(duì)現(xiàn)有對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的檢測手段的不足，提供一種利用掃描離子電導(dǎo)顯微鏡與膜片鉗技術(shù)結(jié)合的在活體細(xì)胞上對(duì)納米材料安全性進(jìn)行評(píng)估的簡便手段。本實(shí)用新型的技術(shù)方案快速評(píng)估納米材料對(duì)呼吸系統(tǒng)生物安全性的裝置，其特征在于它包括充滿電解液的玻璃微探針、置于玻璃微探針內(nèi)的Ag/AgCl電極、參比Ag/AgCl 電極、內(nèi)含細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿、膜片鉗前置電流功率放大器、膜片鉗數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換器、SICM負(fù)反饋掃描控制電路及SICM高精度XYZ三維壓電陶瓷掃描臺(tái)；所說的充滿電解液的玻璃微探針和參比Ag/AgCl電極均置于培養(yǎng)皿的細(xì)胞培養(yǎng)液中；所說的置于玻璃微探針內(nèi)的Ag/AgCl電極和參比Ag/AgCl電極分別與膜片鉗前置電流功率放大器連接；所說的膜片鉗前置電流功率放大器與膜片鉗數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換器連接；所說的膜片鉗數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換器與SICM負(fù)反饋掃描控制電路連接；所說SICM負(fù)反饋掃描控制電路與SICM高精度XYZ 三維壓電陶瓷掃描臺(tái)。上述所說的膜片鉗前置電流功率放大器采用美國Molecular Device公司的 Multiclamp700B 放大器。上述所說的膜片鉗數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換器采用美國Molecular Device公司的 Digidata 1440A數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換器。上述所說的SICM負(fù)反饋掃描控制電路及SICM高精度XYZ三維壓電陶瓷掃描臺(tái)均采用英國Ionscope公司的ICnano SICM非接觸式掃描離子電導(dǎo)顯微鏡系統(tǒng)。本實(shí)用新型的工作過程(1)得到適合于利用SICM技術(shù)進(jìn)行高分辨率掃描的玻璃微探針將拉制的掃描用玻璃微探針內(nèi)沖灌電極內(nèi)液，裝置于SICM系統(tǒng)中內(nèi)置Ag/AgCl電極的電極夾持器上，活體細(xì)胞浸潤于電極外液中，內(nèi)置參比Ag/AgCl電極；通過商用膜片鉗技術(shù)來測量此玻璃微探針的電阻，選用阻值 150ΜΩ用于后續(xù)掃描；(2)利用SICM技術(shù)對(duì)在生理?xiàng)l件下培養(yǎng)的活體細(xì)胞表面形貌進(jìn)行觀測以SICM放大器監(jiān)控流入玻璃微探針電流的變化，通過負(fù)反饋控制使得玻璃微探針與細(xì)胞保持恒定距離，玻璃微探針在細(xì)胞表面的軌跡即為正常生理?xiàng)l件下活體細(xì)胞的表面三維拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)；(3)利用SICM技術(shù)對(duì)加入納米材料下培養(yǎng)的活體細(xì)胞表面形貌進(jìn)行觀測以SICM放大器監(jiān)控流入玻璃微探針電流的變化，通過負(fù)反饋控制使得玻璃微探針與細(xì)胞保持恒定距離，此細(xì)胞仍為加入納米材料前所掃描的細(xì)胞，玻璃微探針在細(xì)胞表面的軌跡即為加入納米材料后活體細(xì)胞的表面三維拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)；利用SICM可得到納米材料作用前后活體細(xì)胞膜表面結(jié)構(gòu)的變化，即從細(xì)胞結(jié)構(gòu)的角度評(píng)估了納米材料的生物安全性；(4)得到適合于利用膜片鉗技術(shù)進(jìn)行離子通道電流記錄的玻璃微探針將拉制的掃描用玻璃微探針內(nèi)沖灌電極內(nèi)液，裝置于SICM系統(tǒng)中的電極夾持器上，電極夾持器內(nèi)置Ag/AgCl電極，細(xì)胞浸潤于電極外液中，內(nèi)置參比Ag/AgCl電極；通過商用膜片鉗技術(shù)來測量此玻璃微探針的電阻，選用阻值3 5ΜΩ用于后續(xù)離子通道電流的記錄；(5)利用膜片鉗技術(shù)記錄在生理?xiàng)l件下培養(yǎng)的活體細(xì)胞離子通道電流利用SICM 技術(shù)控制軟件將玻璃微探針準(zhǔn)確定位于細(xì)胞胞體上，關(guān)閉SICM負(fù)反饋控制，然后手動(dòng)控制玻璃微探針以垂直方向逐步接近細(xì)胞胞體，接近過程中通過電阻檢測軟件連續(xù)觀測探針阻值變化，直至電阻達(dá)到GQ即形成高阻抗封接；通過膜片鉗記錄軟件中ZAP功能或人工吮吸將玻璃微探針鉗制的膜片打破，此時(shí)形成全細(xì)胞記錄模式，即可得到生理?xiàng)l件下培養(yǎng)的活體細(xì)胞離子通道電流結(jié)果；(6)利用膜片鉗技術(shù)記錄在加入納米材料后活體細(xì)胞的離子通道電流在步驟(5)記錄的基礎(chǔ)上完成；具體過程為通過步驟(5)得到正常的細(xì)胞離子通道電流，在細(xì)胞外液中加入納米材料，采用與步驟( 相同的記錄步驟，即可得到加入納米材料后活體細(xì)胞的離子通道電流；利用膜片鉗技術(shù)可得到納米材料作用前后細(xì)胞膜離子通道電流的變化，即從細(xì)胞功能的角度評(píng)估了納米材料的生物安全性。上述所說的納米材料為納米&ι0、納米TiO2、納米C6tl或納米CuO。上述所說的步驟(5)中的電阻檢測軟件采用 Clampex 10. 2 軟件。本實(shí)用新型的優(yōu)越性1、本實(shí)用新型采用一種在生理液態(tài)培養(yǎng)條件下實(shí)時(shí)、非接觸式、高分辨率對(duì)活體生物樣品表面三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行探測的SICM技術(shù)，它可用于觀測在活體細(xì)胞上加入納米材料前后細(xì)胞表面微觀形貌的變化；對(duì)于納米材料影響活體細(xì)胞功能的研究，采用傳統(tǒng)的膜片鉗技術(shù)，通過記錄活體細(xì)胞在加入納米材料前后離子通道電流的變化來評(píng)估納米材料的生物安全性；2、利用SICM與膜片鉗技術(shù)相結(jié)合的手段較易實(shí)現(xiàn)、簡便快捷，更重要的是能夠直觀地從結(jié)構(gòu)和功能兩方面來評(píng)估納米材料的安全性。


圖1為本實(shí)用新型所涉快速評(píng)估納米材料對(duì)呼吸系統(tǒng)生物安全性的裝置的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2-A、圖2-B、圖2-C為本實(shí)用新型所涉利用膜片鉗技術(shù)記錄加入納米ZnO前后 A549細(xì)胞的離子通道電流圖，其中納米ZnO作用濃度為100mg/L(其中，圖2-A為記錄所用程序；圖2-B為加入納米ZnO前記錄的A549細(xì)胞離子通道電流圖；圖2-C為加入納米ZnO 后記錄的A549細(xì)胞離子通道電流圖)。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例快速評(píng)估納米材料對(duì)呼吸系統(tǒng)生物安全性的裝置(見圖1)，其特征在于它包括充滿電解液的玻璃微探針、置于玻璃微探針內(nèi)的Ag/AgCl電極、參比Ag/AgCl電極、 內(nèi)含細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿、膜片鉗前置電流功率放大器、膜片鉗數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換器、 SICM負(fù)反饋掃描控制電路及SICM高精度XYZ三維壓電陶瓷掃描臺(tái)；所說的充滿電解液的玻璃微探針和參比Ag/AgCl電極均置于培養(yǎng)皿的細(xì)胞培養(yǎng)液中；所說的置于玻璃微探針內(nèi)的Ag/AgCl電極和參比Ag/AgCl電極分別與膜片鉗前置電流功率放大器連接；所說的膜片鉗前置電流功率放大器與膜片鉗數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換器連接；所說的膜片鉗數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換器與SICM負(fù)反饋掃描控制電路連接；所說SICM負(fù)反饋掃描控制電路與SICM高精度XYZ三維壓電陶瓷掃描臺(tái)。上述所說的膜片鉗前置電流功率放大器采用美國Molecular Device公司的 Multiclamp 700B 放大器。上述所說的膜片鉗數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換器采用美國Molecular Device公司的 Digidata 1440A數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換器；上述所說的SICM負(fù)反饋掃描控制電路及SICM高精度XYZ三維壓電陶瓷掃描臺(tái)均采用英國Ionscope公司的ICnano SICM非接觸式掃描離子電導(dǎo)顯微鏡系統(tǒng)。一種快速評(píng)估納米材料對(duì)呼吸系統(tǒng)生物安全性的方法實(shí)驗(yàn)納米材料選用納米 ZnO,實(shí)驗(yàn)對(duì)象選用A549細(xì)胞株(人II型肺泡上皮細(xì)胞株)。SICM掃描實(shí)驗(yàn)細(xì)胞內(nèi)外液選用L 15培養(yǎng)基。將采用激光拉制儀拉制的掃描用玻璃微探針內(nèi)沖灌L15培養(yǎng)基，裝置于SICM系統(tǒng)中的電極夾持器上，將A549細(xì)胞也浸潤于 L15培養(yǎng)基中，通過商用膜片鉗技術(shù)測量此玻璃微探針的阻值 150ΜΩ ；通過SICM掃描軟件設(shè)定好掃描參數(shù)后，通過負(fù)反饋控制使得玻璃微探針逐漸接近A549細(xì)胞，并最終達(dá)到微探針與A549細(xì)胞保持恒定距離的狀態(tài)，同時(shí)應(yīng)監(jiān)控流入玻璃微探針電流的變化，以監(jiān)測整個(gè)接近過程的穩(wěn)定性。微探針達(dá)到in control狀態(tài)時(shí)，即可開始對(duì)A549細(xì)胞膜表面進(jìn)行掃描成像，其走過的軌跡即為正常A549細(xì)胞的表面三維拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。掃描完成后，加入納米 &ι0，其終濃度為100mg/L，作用時(shí)間為池。納米ZnO作用完畢后，用L15培養(yǎng)基將其洗脫， 通過負(fù)反饋控制使得玻璃微探針再次接近A549細(xì)胞并進(jìn)行掃描成像，即可得到100mg/L納米ZnO作用于A549細(xì)胞池時(shí)的表面三維拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。離子通道電流記錄時(shí)所用的細(xì)胞內(nèi)外液根據(jù)A549細(xì)胞生理特性而配制。將采用激光拉制儀拉制的膜片鉗記錄用玻璃微探針內(nèi)沖灌電極內(nèi)液，裝置于SICM系統(tǒng)中的電極夾持器上，將A549細(xì)胞浸潤于細(xì)胞外液中，通過商用膜片鉗技術(shù)測量此玻璃微探針的阻值3 5MΩ ；利用SICM負(fù)反饋控制軟件將玻璃微探針準(zhǔn)確定位于Α549細(xì)胞胞體上，關(guān)閉 SICM負(fù)反饋控制，然后手動(dòng)控制玻璃微探針以垂直方向逐步接近Α549細(xì)胞胞體，接近過程中連續(xù)觀測Clampex 10. 2軟件中的探針阻值變化，直至電阻達(dá)到GQ即形成高阻抗封接。 通過膜片鉗記錄軟件中ZAP功能或人工吮吸將玻璃微探針鉗制的膜片打破，此時(shí)形成全細(xì)胞記錄模式。實(shí)驗(yàn)中鉗制電位為_70mV，采樣頻率為10kHz，低通濾波頻率為2kHz，采用 ClampexlO. 2記錄電流所用的設(shè)置程序見圖2-A，即可得到正常A549細(xì)胞離子通道電流圖 (見圖2-B)；此基礎(chǔ)上，在細(xì)胞外液中加入納米&ι0，終濃度為100mg/L，采用的記錄參數(shù)同加藥前記錄參數(shù)，即可得到100mg/L納米ZnO作用于A549細(xì)胞后的離子通道電流圖(見圖 2-C)。利用SICM可得到納米ZnO作用前后A549細(xì)胞膜表面結(jié)構(gòu)的變化，即從細(xì)胞結(jié)構(gòu)的角度評(píng)估了納米材料的生物安全性；利用膜片鉗技術(shù)可得到納米SiO作用前后A549細(xì)胞膜離子通道電流的變化，即從細(xì)胞功能的角度評(píng)估了納米材料的生物安全性。
權(quán)利要求1.快速評(píng)估納米材料對(duì)呼吸系統(tǒng)生物安全性的裝置，其特征在于它包括充滿電解液的玻璃微探針、置于玻璃微探針內(nèi)的Ag/AgCl電極、參比Ag/AgCl電極、內(nèi)含細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿、膜片鉗前置電流功率放大器、膜片鉗數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換器、SICM負(fù)反饋掃描控制電路及SICM高精度XYZ三維壓電陶瓷掃描臺(tái)；所說的充滿電解液的玻璃微探針和參比Ag/ AgCl電極均置于培養(yǎng)皿的細(xì)胞培養(yǎng)液中；所說的置于玻璃微探針內(nèi)的Ag/AgCl電極和參比 Ag/AgCl電極分別與膜片鉗前置電流功率放大器連接；所說的膜片鉗前置電流功率放大器與膜片鉗數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換器連接；所說的膜片鉗數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換器與SICM負(fù)反饋掃描控制電路連接；所說SICM負(fù)反饋掃描控制電路與SICM高精度XYZ三維壓電陶瓷掃描臺(tái)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所說的快速評(píng)估納米材料對(duì)呼吸系統(tǒng)生物安全性的裝置，其特征在于所說的膜片鉗前置電流功率放大器采用美國Molecular Device公司的Multiclamp 700B放大器。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所說的快速評(píng)估納米材料對(duì)呼吸系統(tǒng)生物安全性的裝置，其特征在于所說的膜片鉗數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換器采用美國Molecular Device公司的Digidata 1440A數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換器。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所說的快速評(píng)估納米材料對(duì)呼吸系統(tǒng)生物安全性的裝置，其特征在于所說的SICM負(fù)反饋掃描控制電路及SICM高精度XYZ三維壓電陶瓷掃描臺(tái)均采用英國 Ionscope公司的ICnano SICM非接觸式掃描離子電導(dǎo)顯微鏡系統(tǒng)。
專利摘要快速評(píng)估納米材料對(duì)呼吸系統(tǒng)生物安全性的裝置，其特征在于它包括充滿電解液的玻璃微探針、置于玻璃微探針內(nèi)的Ag/AgCl電極、參比Ag/AgCl電極、內(nèi)含細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿、膜片鉗前置電流功率放大器、膜片鉗數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換器、SICM負(fù)反饋掃描控制電路及SICM高精度XYZ三維壓電陶瓷掃描臺(tái)；優(yōu)越性利用SICM與膜片鉗技術(shù)相結(jié)合的手段較易實(shí)現(xiàn)、簡便快捷，從結(jié)構(gòu)和功能兩方面來評(píng)估納米材料的安全性。
文檔編號(hào)G01N27/26GK201955323SQ20102057229
公開日2011年8月31日 申請(qǐng)日期2010年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月22日
發(fā)明者劉曉, 張彥軍, 楊茜 申請(qǐng)人:國家納米技術(shù)與工程研究院