專利名稱：一種磷酸根敏感膜及其制備、使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于電化學(xué)生物傳感器及其制備技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種磷酸根敏感膜及其制備、使用方法，即以硝酸纖維素膜為基體的麥芽糖磷酸化酶-葡萄糖氧化酶雙酶磷酸根敏感膜，檢測磷酸根。
背景技術(shù)：
磷酸根含量是影響發(fā)酵過程及其產(chǎn)品質(zhì)量的重要因素，食品中磷酸根含量是食品營養(yǎng)衛(wèi)生檢驗(yàn)檢疫的重要指標(biāo)，因此快速、準(zhǔn)確檢測磷酸根在發(fā)酵及食品工業(yè)中具有重要意義。檢測磷酸根的方法有多種，如比色法、比濁法、重量法、離子色譜法等，但比色法、比濁法、重量法等方法的檢測精度、靈敏度不夠高且操作過程繁瑣，而離子色譜法需要昂貴的儀器設(shè)備。近年來，人們開始研究用酶電極檢測磷酸根，具有簡單、快速、選擇性高等優(yōu)點(diǎn)。研究人員已開發(fā)出多種可以應(yīng)用于磷酸根檢測的酶電極體系，其中較有代表性的是丙酮酸氧化酶體系和麥芽糖磷酸化酶體系。在文獻(xiàn)(I)AnalyticalBiochemistry，2005，343 :263-267 中，Roger C. H. Kwan 等人采用Nafion溶液將丙酮酸氧化酶固定在絲網(wǎng)印刷電極上制備了磷酸根生物傳感器，該傳感器需要在測試緩沖溶液中添加黃素腺嘌呤二核苷酸、輔羧酶和MgCl2作為輔助因子，丙酮酸作為反應(yīng)底物。研究表明，最佳測試條件下磷酸根線性響應(yīng)范圍為7. 5 625 μ mol/L, 檢測限為3. 6 μ mol/L,靈敏度為523. 89nA/ (mmol/L)，響應(yīng)時(shí)間為2秒，持續(xù)操作12小時(shí)電流保持85%。該磷酸根生物傳感器的線性響應(yīng)范圍較寬，響應(yīng)迅速，操作穩(wěn)定性能良好，但由于測試緩沖溶液構(gòu)成復(fù)雜，因此測試樣品的種類受到限制，該傳感器主要適用于人體唾液的檢測。另外，丙酮酸氧化酶及反應(yīng)輔助因子都是昂貴的生化藥品，因此成本很高。麥芽糖磷酸化酶體系所使用的酶價(jià)格較低，在成本上具有一定優(yōu)勢。在文獻(xiàn)(2) Analytica ChimicaActa, 1995，309 :47-52 中，N. Conrath 等人用戊二酸作為交聯(lián)劑將麥芽糖磷酸化酶、葡萄糖氧化酶、牛血清蛋白固定于銅紡膜上，在檸檬酸緩沖溶液中檢測磷酸根未取得預(yù)期效果，只有再加入變旋酶或/與酸性磷酸酶，組裝成三酶、四酶生物傳感器，才實(shí)現(xiàn)了對(duì)磷酸根的檢測。其中性能最佳的四酶傳感器的線性響應(yīng)范圍為0. 1 1 μ mol/L。 該文獻(xiàn)研制的磷酸根生物傳感器靈敏度較高，達(dá)到4. 4 μ A/ (mmol/L)，但該體系使用酶的種類較多，基體膜較為昂貴，制備過程較繁瑣，成本較高。在文獻(xiàn)(3)Enzyme and Microbial Technology，1997，21 :413-420 中，Stephan HUwel等人用戊二醛作為交聯(lián)劑將麥芽糖磷酸化酶、葡萄糖氧化酶、牛血清蛋白固定在鉬電極上構(gòu)成了磷酸根生物傳感器，該傳感器在PH = 6. 5，36°C的最佳測試條件下的線性響應(yīng)范圍為0. 5 lOymol/L，檢測限為0. 1 μ mol/L，響應(yīng)時(shí)間為4分鐘，6小時(shí)內(nèi)酶活性不損失。但由于酶直接固定在電極上，導(dǎo)致電極不宜更換，測試成本高。在文獻(xiàn)(4)Analytica Chimica Acta, 2001,443 1-8 中，Christine Mousty 等人采用戊二醛為交聯(lián)劑將麥芽糖磷酸化酶、變旋酶、葡萄糖氧化酶固定在無機(jī)鋰皂石黏土上，制備了磷酸根生物傳感器。研究結(jié)果表明，PH = 6. 5，40°C的最佳測試條件下線性響應(yīng)范圍為1 50 μ mol/L,靈敏度為10. 3 μ A/ (mmol/L)，持續(xù)操作8小時(shí)電流保持90%，貯存2周后電流響應(yīng)能夠保持穩(wěn)定。磷酸根生物傳感器的線性響應(yīng)范圍較寬，儲(chǔ)存性能良好，相對(duì)前人工作在性能上有較大的提升，但是酶直接固定在電極上，導(dǎo)致電極不宜更換，測試成本高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種磷酸根敏感膜及其制備、使用方法，即以硝酸纖維素膜為基體的麥芽糖磷酸化酶-葡萄糖氧化酶雙酶磷酸根敏感膜并檢測磷酸根。利用硝酸纖維素膜良好的化學(xué)穩(wěn)定性及熱穩(wěn)定性、較大的孔隙率、較均勻的孔徑分布以及良好的生物相容性等性能優(yōu)勢，有效地保持麥芽糖磷酸化酶、葡萄糖氧化酶的活性，提高生物傳感器的靈敏度、線性響應(yīng)范圍及穩(wěn)定性等，從而提高生物傳感器的綜合性能指標(biāo)。同時(shí)本發(fā)明采用在測試緩沖溶液中添加2-羥基吡啶的方法催化反應(yīng)中間產(chǎn)物α -葡萄糖變旋，起到了替代變旋酶的作用，實(shí)現(xiàn)了二酶體系對(duì)于磷酸根的檢測。本發(fā)明磷酸根敏感膜由硝酸纖維素膜基體、麥芽糖磷酸化酶、葡萄糖氧化酶及固定酶的高分子物質(zhì)戊二醛構(gòu)成。其中，硝酸纖維素膜為硝酸纖維素微孔濾膜，其平均孔徑為 0. 20 1. 20 μ m,厚度為50 150 μ m ；麥芽糖磷酸化酶的負(fù)載量為9. 0 28. 0活力單位 (U)/cm2 ；葡萄糖氧化酶的負(fù)載量為7. 0 32. OU/cm2 ；戊二醛是由戊二醛水溶液蒸氣交聯(lián)引入的。本發(fā)明磷酸根敏感膜的制備方法是將硝酸纖維素膜浸入pH值為6. 5的 0. 05mol/L磷酸緩沖溶液中處理6 18小時(shí)后取出，用高純氮?dú)獯蹈?；將處理后的硝酸纖維素膜粘在0形橡膠圈上，將麥芽糖磷酸化酶-葡萄糖氧化酶雙酶混合溶液滴在該硝酸纖維素膜上，在溫度為0 8°C的冰箱中干燥0. 5 2小時(shí)；隨后用戊二醛水溶液蒸氣在0 8°C的條件下交聯(lián)6 12小時(shí)，再將酶膜浸入pH值為6. 5的0. 05mol/L磷酸緩沖溶液中， 以洗去結(jié)合不牢固的酶，制成磷酸根敏感膜，保存在溫度為0 8°C的冰箱中備用。其中pH 值為6. 5的0. 05mol/L磷酸緩沖溶液的溶劑為二次蒸餾水；麥芽糖磷酸化酶_葡萄糖氧化酶雙酶混合溶液的溶劑為pH = 6. 5的0. 05mol/L磷酸緩沖溶液，溶質(zhì)為0. 1 0. 5U/ μ L 麥芽糖磷酸化酶和0. 1 0. 5U/y L葡萄糖氧化酶；用于產(chǎn)生戊二醛蒸氣的是質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 50%的戊二醛水溶液，溶劑為二次蒸餾水。本發(fā)明磷酸根敏感膜測試樣品中磷酸根的方法為將磷酸根敏感膜套在鉬電極頂端作為工作電極，鉬絲電極作為對(duì)電極，Ag/AgCl電極作為參比電極，組成三電極體系；將該三電極體系置于PH值為6. 5的測試緩沖溶液中，將電位設(shè)定在0. 6V(vs. Ag/AgCl)，采用計(jì)時(shí)電流方法測試磷酸根敏感膜對(duì)磷酸根離子的響應(yīng)電流，記錄i_t曲線，根據(jù)i_t曲線繪制響應(yīng)電流與磷酸根濃度關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，利用此標(biāo)準(zhǔn)工作曲線進(jìn)行待測樣品中磷酸根濃度的定量檢測。其中測試緩沖溶液是在pH = 6. 5的0. lmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液中添加反應(yīng)底物麥芽糖及葡萄糖變旋催化劑2-羥基吡啶得到的，麥芽糖濃度為1 40mmol/L，2-羥基吡啶的濃度為100 500mmol/L。本發(fā)明的效果可以從使用本發(fā)明磷酸根敏感膜制作的電化學(xué)生物傳感器看出采用i-t方法測試傳感器對(duì)磷酸根的響應(yīng)電流，結(jié)果如

圖1所示，響應(yīng)時(shí)間3分鐘；由圖2可以看出，磷酸根敏感膜對(duì)磷酸根的線性響應(yīng)范圍為0. 5 6. Ommol/L,響應(yīng)靈敏度為4. 24nA/ (mmol/L)，對(duì)本發(fā)明的磷酸根敏感膜進(jìn)行連續(xù)操作9小時(shí)，響應(yīng)信號(hào)保持98. 3%。本發(fā)明磷酸根生物傳感器與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)的對(duì)比如表1所示。表1.磷酸根傳感器性能比較
權(quán)利要求
1.一種磷酸根敏感膜，其特征在于該磷酸根敏感膜由硝酸纖維素膜基體、麥芽糖磷酸化酶、葡萄糖氧化酶及固定酶的高分子物質(zhì)戊二醛構(gòu)成；其中，硝酸纖維素膜為硝酸纖維素微孔濾膜，其平均孔徑為0. 20 1. 20 μ m，厚度為50 150 μ m ；麥芽糖磷酸化酶的負(fù)載量為9. 0 28. 0活力單位(U)/cm2 ；葡萄糖氧化酶的負(fù)載量為7. 0 32. OU/cm2 ；戊二醛是由戊二醛水溶液蒸氣交聯(lián)弓丨入的。
2.一種制備權(quán)利要求1所述的磷酸根敏感膜的方法，其特征在于，工藝步驟為將硝酸纖維素膜浸入PH值為6. 5的0. 05mol/L磷酸緩沖溶液中處理6 12小時(shí)后取出，用高純氮?dú)獯蹈?；將處理后的硝酸纖維素膜粘在0形橡膠圈上，將麥芽糖磷酸化酶-葡萄糖氧化酶雙酶混合溶液滴在該硝酸纖維素膜上，在溫度為0 8°C的冰箱中干燥0. 5 2小時(shí)；隨后用戊二醛水溶液蒸氣在0 8°C的條件下交聯(lián)6 18小時(shí)，再將酶膜浸入pH值為6. 5 的0. 05mol/L磷酸緩沖溶液中，以洗去結(jié)合不牢固的酶，制成磷酸根敏感膜，保存在溫度為 0 8°C的冰箱中備用。所述的硝酸纖維素膜為硝酸纖維素微孔濾膜，其平均孔徑為0. 20 1. 20 μ m,厚度為 50 150 μ m ；麥芽糖磷酸化酶的負(fù)載量為9. 0 觀.0活力單位(U)/cm2 ；葡萄糖氧化酶的負(fù)載量為7.0 32. OU/cm2。
3.按照權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于pH值為6.5的0. 05mol/L磷酸緩沖溶液的溶劑為二次蒸餾水；麥芽糖磷酸化酶-葡萄糖氧化酶雙酶混合溶液的溶劑為pH = 6. 5的 0. 05mol/L磷酸緩沖溶液，溶質(zhì)為0. 1 0. 5U/ μ L麥芽糖磷酸化酶和0. 1 0. 5U/ μ L葡萄糖氧化酶；用于產(chǎn)生戊二醛蒸氣的是質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的戊二醛水溶液，溶劑為二次蒸餾水。
4.一種權(quán)利要求1所述磷酸根敏感膜的使用方法，其特征為用于樣品中磷酸根的定量檢測，測試方法為將磷酸根敏感膜套在鉬電極頂端作為工作電極，鉬絲電極作為對(duì)電極，Ag/AgCl電極作為參比電極，組成三電極體系；將該三電極體系置于pH值為6. 5的測試緩沖溶液中，將電位設(shè)定在0. 6V(vs. Ag/AgCl)，采用計(jì)時(shí)電流方法測試磷酸根敏感膜對(duì)磷酸根離子的響應(yīng)電流，記錄i_t曲線，根據(jù)i_t曲線繪制響應(yīng)電流與磷酸根濃度關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，利用此標(biāo)準(zhǔn)工作曲線進(jìn)行待測樣品中磷酸根濃度的定量檢測；其中測試緩沖溶液是在pH = 6. 5的0. lmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液中添加反應(yīng)底物麥芽糖及葡萄糖變旋催化劑2-羥基吡啶得到的，麥芽糖濃度為1 40mmol/L，2-羥基吡啶的濃度為100 500mmol/L。
全文摘要
一種磷酸根敏感膜及其制備、使用方法，屬于電化學(xué)生物傳感器及其制備技術(shù)領(lǐng)域。該磷酸根敏感膜由硝酸纖維素膜基體、麥芽糖磷酸化酶、葡萄糖氧化酶及固定酶的高分子物質(zhì)戊二醛構(gòu)成。測試緩沖溶液由反應(yīng)底物麥芽糖、葡萄糖變旋催化劑2-羥基吡啶、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液組成。本發(fā)明磷酸根生物傳感器只使用兩種酶就實(shí)現(xiàn)了磷酸根的檢測，便于制備和條件優(yōu)化，同時(shí)又具有較寬的線性響應(yīng)范圍和較好的操作穩(wěn)定性，尤其適合在發(fā)酵工業(yè)和食品檢驗(yàn)等領(lǐng)域中使用。
文檔編號(hào)G01N27/49GK102153772SQ20101057404
公開日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2010年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月6日
發(fā)明者張楠喆, 楊文勝 申請(qǐng)人:北京化工大學(xué)