專利名稱：一種基于熒光淬滅原理的免疫反應(yīng)分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，更具體地涉及一種基于熒光淬滅原理的免疫檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
在檢測(cè)領(lǐng)域中，常常需要對(duì)各類抗原或抗體進(jìn)行定性或定量檢測(cè)?，F(xiàn)有技術(shù)中，已經(jīng)以“雙抗夾心”為基礎(chǔ)衍生出多種免疫反應(yīng)分析方法，如放射免疫法、酶聯(lián)免疫法、化學(xué)發(fā)光法、時(shí)間分辨熒光法和熒光免疫法等，可用于確定病原微生物，對(duì)人體的特異性蛋白定量檢測(cè)從而對(duì)疾病進(jìn)行輔助診斷或監(jiān)測(cè)等等，用途非常廣泛。這類免疫反應(yīng)分析方法的通常作法是將捕獲抗體固定于固相載體，然后與抗原 (目標(biāo)蛋白)反應(yīng)，洗滌后再與標(biāo)記抗體反應(yīng)，洗滌，加入底物檢測(cè)光信號(hào)或直接檢測(cè)熒光信號(hào)。雖然上述方法的自動(dòng)化免去了人工洗滌的煩瑣，但液體與固體之間非均相反應(yīng)的缺陷常常導(dǎo)致反應(yīng)不夠均勻以及反應(yīng)不夠快速。中國專利申請(qǐng)CN200510030659. 2公開了一種免疫膠體金粒子熒光淬滅的測(cè)量方法，該方法包括將目標(biāo)物即被測(cè)物的抗體或抗原連接在微小顆?；蛭⒖咨闲纬晒滔噍d體， 加入被測(cè)樣品，再加入過量膠體金標(biāo)記物，樣品中的目標(biāo)物與固定在微顆?；蛭⒖装迳系目贵w或抗原進(jìn)行免疫反應(yīng)，形成抗原抗體的固相載體復(fù)合物即結(jié)合物，及未反應(yīng)的膠體金標(biāo)記物即游離物，分離結(jié)合物與游離的膠體金標(biāo)記物，在游離物中加入熒光物質(zhì)，使得熒光信號(hào)淬滅，信號(hào)淬滅的程度與體系中游離的金標(biāo)記物量相關(guān)，游離物的量與目標(biāo)物的量相關(guān)，從而對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行定量檢測(cè)。然而，該方法的熒光淬滅的機(jī)制都是共振能量轉(zhuǎn)移，要求熒光基團(tuán)與淬滅劑基團(tuán)必須近距離(<20nm)接觸且共混于一個(gè)溶液體系。此外，該方法仍然存在流程不易自動(dòng)化、熒光物質(zhì)無法重復(fù)使用、和成本偏高等缺點(diǎn)。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)一種操作簡便(例如，不必洗滌)，并且反應(yīng)均勻和/或快速的檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種在檢測(cè)過程中不必人工洗滌、操作簡便且反應(yīng)均勻和 /或快速的檢測(cè)方法。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種檢測(cè)待測(cè)物存在與否和/或數(shù)量的免疫分析方法，包括步驟
(a)提供一檢測(cè)溶液和一熒光物質(zhì)溶液，其中所述的檢測(cè)溶液和一熒光物質(zhì)溶液是相互獨(dú)立的，所述檢測(cè)溶液中含有標(biāo)記有淬滅劑的、針對(duì)所述的待測(cè)物的第一結(jié)合物，所述的熒光物質(zhì)溶液中含有在受到激發(fā)光線照射時(shí)能夠產(chǎn)生熒光的熒光物質(zhì)；
(b)將待測(cè)物或含待測(cè)物的樣品加入檢測(cè)溶液，從而形成“第一結(jié)合物-待測(cè)物”二元復(fù)合物；
(C)將針對(duì)所述的待測(cè)物的第二結(jié)合物加入步驟(b)的檢測(cè)溶液中，從而形成“第一結(jié)合物-待測(cè)物-第二結(jié)合物”三元復(fù)合物，其中所述的第一結(jié)合物和第二結(jié)合物可同時(shí)結(jié)合于所述待測(cè)物；
(d)從步驟(C)的檢測(cè)溶液中捕獲或分離出所述的三元復(fù)合物，從而使得所述三元復(fù)合物與檢測(cè)溶液的液相分開；
(e)用可激發(fā)熒光物質(zhì)產(chǎn)生熒光的光線照射步驟(d)檢測(cè)溶液，使得所述光線透過檢測(cè)溶液并照射到與檢測(cè)溶液相互獨(dú)立的熒光物質(zhì)溶液，從而使得熒光物質(zhì)溶液產(chǎn)生熒光； 和
(f)檢測(cè)步驟(e)產(chǎn)生的熒光，從而確定待測(cè)物存在與否和/或數(shù)量。在另一優(yōu)選例中，所述的待測(cè)物包括蛋白、核酸。在另一優(yōu)選例中，所述的待測(cè)物是腫瘤標(biāo)志物、病毒蛋白等。在另一優(yōu)選例中，所述腫瘤標(biāo)志物選自下組甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原125(CA125)、糖抗原19-9 (CA19-9)、總前列腺特異性抗原(PSA)、游離前列腺特異性抗原(f-PSA)、神經(jīng)原特異性烯醇化酶(NSE)、糖鏈抗原(CAM2)、癌抗原(CA15-3)、人絨毛膜促性腺激素(β-HCG)。在另一優(yōu)選例中，所述的熒光物質(zhì)選自下組熒光素、羧基熒光素、2-甲氧基熒光素、4，5_ 二甲氧基熒光素、羅丹明、藻紅蛋白、量子點(diǎn)、或其組合。在另一優(yōu)選例中，所述的淬滅劑為膠體金。在另一優(yōu)選例中，所述的淬滅劑是平均粒徑為10-70nm的膠體金顆粒。在另一優(yōu)選例中，在步驟(f)中，檢測(cè)熒光物質(zhì)溶液產(chǎn)生的且透射通過所述檢測(cè)溶液的熒光。在另一優(yōu)選例中，在步驟(f)中還包括將熒光的測(cè)量值與標(biāo)準(zhǔn)曲線或?qū)φ者M(jìn)行比較，從而確定待測(cè)物的數(shù)量。在另一優(yōu)選例中，所述的待測(cè)物是抗原，且所述的第一結(jié)合物和第二結(jié)合物是可同時(shí)結(jié)合于所述抗原的抗體。在另一優(yōu)選例中，所述的待測(cè)物是抗體，所述的第一結(jié)合物是可與所述抗體結(jié)合的抗原，而所述的第二結(jié)合物是針對(duì)所述檢測(cè)物(抗體)的抗體，反之亦然。例如，當(dāng)待測(cè)物是某種人抗體時(shí)，第一結(jié)合物是該人抗體所針對(duì)的抗原，而第二結(jié)合物是抗該人抗體的鼠源或兔源抗體。在另一優(yōu)選例中，所述的光線是激光器產(chǎn)生的。在另一優(yōu)選例中，在步驟(e)中，所述的可激發(fā)熒光物質(zhì)產(chǎn)生熒光的光線，透射通過檢測(cè)溶液的光程為0. 1-50厘米。在另一優(yōu)選例中，所述的光程為0. 5-10厘米，更佳地為1. 0-5. 0厘米。在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括用已知濃度的待測(cè)物標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測(cè)量，從而制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的步驟。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種用于檢測(cè)待測(cè)物存在與否和/或數(shù)量的免疫分析檢測(cè)裝置，所述的裝置包括
(a)第一容器，所述的第一容器用于放置檢測(cè)溶液，所述檢測(cè)溶液中含有標(biāo)記有淬滅劑的、針對(duì)所述的待測(cè)物的第一結(jié)合物；
(b)第二容器，所述的第二容器用于放置熒光物質(zhì)溶液，所述的熒光物質(zhì)溶液中含有在受到激發(fā)光線照射時(shí)能夠產(chǎn)生熒光的熒光物質(zhì)；
(C)用于產(chǎn)生激發(fā)光線的光源，所述的光源可發(fā)出透射所述第一容器并照射到所述第二容器的激發(fā)光線，從而使得所述熒光物質(zhì)產(chǎn)生熒光；和 (d)用于檢測(cè)熒光的檢測(cè)器。在另一優(yōu)選例中，所述的光源是激光器。應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再
--累述。


圖1顯示了本發(fā)明方法的基本原理。圖2顯示了在本發(fā)明方法中，標(biāo)記了淬滅劑的抗體與目標(biāo)蛋白形成“二元復(fù)合物” 的步驟。圖3顯示了在本發(fā)明方法中，加入適量的經(jīng)標(biāo)記修飾后具備捕獲和分離功能的抗體，從而形成“夾心復(fù)合物”的步驟。圖4顯示了在本發(fā)明方法中，采用適宜的方法將捕獲抗體及含捕獲抗體的“夾心復(fù)合物”分離去除后進(jìn)行檢測(cè)的步驟。圖5顯示了本發(fā)明一個(gè)實(shí)例中得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中χ軸為濃度(單位ng/ml)，y 軸為F1VFcm的比值(i=l 5)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次開發(fā)了一種基于熒光淬滅原理的液溶膠均相免疫反應(yīng)體系和檢測(cè)方法。在本發(fā)明的檢測(cè)方法中，熒光物質(zhì)與淬滅劑不接觸，完全相互獨(dú)立地分開，從而使得本發(fā)明提供的免疫分析方法具有極其顯著的優(yōu)點(diǎn)，其中包括反應(yīng)在液溶膠均相反應(yīng)體系中進(jìn)行，因此反應(yīng)均勻迅速；全過程無需洗滌；可根據(jù)實(shí)際需要方便地調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度，且定量準(zhǔn)確；熒光物質(zhì)重復(fù)使用，降低了試劑成本。檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明檢測(cè)方法的基本原理如圖1所示。左側(cè)圖中目標(biāo)檢測(cè)物的紫外可見吸收光譜與熒光物質(zhì)的激發(fā)或熒光光譜重疊，則激發(fā)光和熒光被吸收，熒光被淬滅，此時(shí)的熒光強(qiáng)度計(jì)為你，該目標(biāo)檢測(cè)物為該熒光物質(zhì)的淬滅劑；
若右側(cè)圖中淬滅劑的濃度為0或相對(duì)減少，則對(duì)熒光物質(zhì)的淬滅程度降低，熒光較增強(qiáng)，記為Fl ；
根據(jù)Beer-Lambert定律，在淬滅劑濃度一定的情況下，增加液層的厚度，透光率降低， 則淬滅程度增加，對(duì)淬滅劑的檢測(cè)靈敏度將隨之提高。接著，結(jié)合圖2、3和4，進(jìn)一步闡述本發(fā)明的一個(gè)定量檢測(cè)目標(biāo)蛋白實(shí)例的各步
馬聚ο圖2顯示了標(biāo)記了淬滅劑的抗體(第一抗體)與目標(biāo)蛋白形成“二元復(fù)合物”的過程。具體地，在圖2中，Stdl 5是檢測(cè)目標(biāo)蛋白的標(biāo)準(zhǔn)系，Stdl中沒有目標(biāo)蛋白，未形成“二元復(fù)合物”。隨著目標(biāo)蛋白的濃度逐漸增加， 5中“二元復(fù)合物”的數(shù)量隨之增加，但其中淬滅劑的量并未改變。圖3顯示了加入適量的經(jīng)標(biāo)記修飾后具備捕獲和分離功能的抗體(第二抗體)，形成“夾心復(fù)合物”。具體地，在加入了針對(duì)目標(biāo)蛋白的、可分離的捕獲抗體(第二抗體)后， 在反應(yīng)體系中形成“標(biāo)記淬滅劑的第一抗體-目標(biāo)蛋白-可分離的第二抗體”三元的“夾心復(fù)合物”。一種特別優(yōu)選的可分離的捕獲抗體是與磁性微球偶聯(lián)的捕獲抗體。該捕獲抗體可通過磁場(chǎng)進(jìn)行分離。另一類特別優(yōu)選的可分離的捕獲抗體是與生物素偶聯(lián)的捕獲抗體。該捕獲抗體可通過生物素-親和素的結(jié)合而進(jìn)行分離。圖4顯示了采用適宜的方法將捕獲抗體及含捕獲抗體的“夾心復(fù)合物”分離去除后進(jìn)行檢測(cè)。與圖2進(jìn)行對(duì)比，隨著目標(biāo)蛋白量的增加， 5中標(biāo)記了淬滅劑的抗體隨之減少，熒光淬滅減弱，相應(yīng)地?zé)晒庑盘?hào)依次增強(qiáng)。在另一優(yōu)選例中，本發(fā)明方法中還包括制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并將檢測(cè)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，從而獲得測(cè)量值。例如，標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作可采用以下方法
將對(duì)應(yīng)于目標(biāo)蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的第一個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)溶液與標(biāo)記了淬滅劑的抗體混勻 (形成“目標(biāo)蛋白-標(biāo)記淬滅劑的第一抗體”的二元復(fù)合物)，加入圖2所示上方容器中 (Stdl)(該上方容器與下方含熒光物質(zhì)溶液容器是相互獨(dú)立或分離的)，并確保激發(fā)光能透過該上方容器照射到下方的熒光物質(zhì)溶液，測(cè)定熒光強(qiáng)度，記為Fch1 ；
向所述上方容器的溶液中加入經(jīng)標(biāo)記修飾后具備捕獲和分離功能的抗體(例如，連于磁性納米顆粒的二抗)(見圖3的Ml) ”，從而形成“標(biāo)記淬滅劑的第一抗體-目標(biāo)蛋白-可分離的第二抗體”三元的“夾心復(fù)合物”。在該過程中，但溶液體積保持或基本保持不變；
使“標(biāo)記淬滅劑的第一抗體-目標(biāo)蛋白-可分離的第二抗體”三元復(fù)合物與溶液完全分離，并使溶液返回“2. 2.1”下第1步的容器中(圖4 Stdl)，測(cè)定熒光強(qiáng)度，記為Fh ； 計(jì)算F1V Fch1的比值；
同樣操作，分別得到目標(biāo)蛋白標(biāo)準(zhǔn)系其他點(diǎn)Fw/ ^^(1=2-5)的比值，以標(biāo)準(zhǔn)系各點(diǎn)濃度值對(duì)F1V、力=1 5)比值作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。應(yīng)理解，為了方便起見，在附圖中將第一容器和第二容器的位置畫為上方容器和下方容器，然而第一容器和第二容器也可以水平放置或傾斜放置。同樣操作，得到樣本的F1/ Ftl，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出樣本中目標(biāo)蛋白的含量。熒光物質(zhì)
可用于本發(fā)明的熒光物質(zhì)沒有特別限制，激發(fā)或發(fā)射光譜與淬滅劑(如膠體金)的可見吸收光譜全部或部分重疊的熒光物質(zhì)均適用于本發(fā)明提供的檢測(cè)方法。代表性的熒光物質(zhì)包括(但并不限于)熒光素、羧基熒光素、2-甲氧基熒光素、4， 5-二甲氧基熒光素、羅丹明、藻紅蛋白、量子點(diǎn)、或其組合，只要所述熒光物質(zhì)的激發(fā)或發(fā)射光譜與淬滅劑的吸收光譜重疊(或部分重疊)即可。淬滅劑
如本文所用，術(shù)語“淬滅劑”和“淬滅劑”可互換使用，都指可衰減熒光物質(zhì)所發(fā)射熒光的物質(zhì)。
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針對(duì)待測(cè)物的結(jié)合物(如抗體)可用各種本領(lǐng)域已知的淬滅劑進(jìn)行標(biāo)記?？捎糜诒景l(fā)明的淬滅劑沒有特別限制，代表性的淬滅劑包括(但并不限于)膠體金。一種特別優(yōu)選的淬滅劑是膠體金，尤其是粒徑為20-40nm的膠體金。應(yīng)理解，熒光物質(zhì)與淬滅劑宜相互對(duì)應(yīng)。例如，當(dāng)選用藻紅蛋白(PE)時(shí)，因其最大發(fā)射波長為575nm，與30nm膠體金的吸收光譜部分重疊，因此可以將藻紅蛋白與30nm膠體金配對(duì)使用。在另一優(yōu)選例中，本發(fā)明優(yōu)選膠體金進(jìn)行標(biāo)記，其中膠體金標(biāo)記方法是本領(lǐng)域的成熟技術(shù)。捕獲抗體和固相載體
本領(lǐng)域通常是將捕獲抗體固定于固相載體，從而使該捕獲抗體具備分離“夾心復(fù)合物” 的功能，常用的固相載體有玻片、膜片、酶標(biāo)板和各種微球。也可將捕獲抗體用生物素(biotin)標(biāo)記，形成“夾心復(fù)合物”后再與鏈親和素 (Streptavidin)包被的固相載體結(jié)合，從而具備分離的功能。在本發(fā)明中，優(yōu)選的固相載體是納米級(jí)或亞納米級(jí)的微球或微顆粒。通常，其平均粒徑小于200nm，較佳地小于150nm，更佳地小于150nm。代表性的微球或顆粒包括(但并不限于)磁性微球、聚丙烯酰胺微球、聚苯乙烯微球、玻璃微球、聚丙烯微球、硅橡膠微球、纖維素微球、交聯(lián)葡聚糖微球、或其組合。光源
在本發(fā)明方法中，光源用于提供某一發(fā)射波長的光線，從而激發(fā)熒光物質(zhì)發(fā)出熒光。在本發(fā)明中，可選用任何可以提供合適波長的光源。一種優(yōu)選的光源是激光光源。 激光光源可用本領(lǐng)域常規(guī)的方法和設(shè)備(如激光器)產(chǎn)生。代表性的激光器例子包括(但并不限于)光纖激光器等。半導(dǎo)體激光器、氦氖激光器、氬離子激光器、光纖激光器。還包括波長可選的激光器、多波長激光器和雙波長激光器等。在優(yōu)選例中，光源提供的光線宜包含熒光物質(zhì)的激發(fā)波長，或者與熒光物質(zhì)的激發(fā)波長相同或幾乎重疊。激光器產(chǎn)生的激光波長與激光介質(zhì)有關(guān)，常見的激光波長見下表
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)待測(cè)物存在與否和/或數(shù)量的免疫分析方法，其特征在于，包括步驟(a)提供一檢測(cè)溶液和一熒光物質(zhì)溶液，其中所述的檢測(cè)溶液和一熒光物質(zhì)溶液是相互獨(dú)立的，所述檢測(cè)溶液中含有標(biāo)記有淬滅劑的、針對(duì)所述的待測(cè)物的第一結(jié)合物，所述的熒光物質(zhì)溶液中含有在受到激發(fā)光線照射時(shí)能夠產(chǎn)生熒光的熒光物質(zhì)；(b)將待測(cè)物或含待測(cè)物的樣品加入檢測(cè)溶液，從而形成“第一結(jié)合物-待測(cè)物”二元復(fù)合物；(c)將針對(duì)所述的待測(cè)物的第二結(jié)合物加入步驟(b)的檢測(cè)溶液中，從而形成“第一結(jié)合物-待測(cè)物-第二結(jié)合物”三元復(fù)合物，其中所述的第一結(jié)合物和第二結(jié)合物可同時(shí)結(jié)合于所述待測(cè)物；(d)從步驟(c)的檢測(cè)溶液中捕獲或分離出所述的三元復(fù)合物，從而使得所述三元復(fù)合物與檢測(cè)溶液的液相分開；(e)用可激發(fā)熒光物質(zhì)產(chǎn)生熒光的光線照射步驟(d)檢測(cè)溶液，使得所述光線透過檢測(cè)溶液并照射到與檢測(cè)溶液相互獨(dú)立的熒光物質(zhì)溶液，從而使得熒光物質(zhì)溶液產(chǎn)生熒光；(f)檢測(cè)步驟(e)產(chǎn)生的熒光，從而確定待測(cè)物存在與否和/或數(shù)量。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的待測(cè)物包括蛋白、核酸。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的熒光物質(zhì)選自下組熒光素、羧基熒光素、2-甲氧基熒光素、4，5_ 二甲氧基熒光素、羅丹明、藻紅蛋白、量子點(diǎn)、或其組合。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的淬滅劑為膠體金。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(f)中，檢測(cè)熒光物質(zhì)溶液產(chǎn)生的且透射通過所述檢測(cè)溶液的熒光。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(f)中還包括將熒光的測(cè)量值與標(biāo)準(zhǔn)曲線或?qū)φ者M(jìn)行比較，從而確定待測(cè)物的數(shù)量。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的待測(cè)物是抗原，且所述的第一結(jié)合物和第二結(jié)合物是可同時(shí)結(jié)合于所述抗原的抗體。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(e)中，所述的可激發(fā)熒光物質(zhì)產(chǎn)生熒光的光線，透射通過檢測(cè)溶液的光程為0. 1-50厘米。
9.一種用于檢測(cè)待測(cè)物存在與否和/或數(shù)量的免疫分析檢測(cè)裝置，其特征在于，所述的裝置包括(a)第一容器，所述的第一容器用于放置檢測(cè)溶液，所述檢測(cè)溶液中含有標(biāo)記有淬滅劑的、針對(duì)所述的待測(cè)物的第一結(jié)合物；(b)第二容器，所述的第二容器用于放置熒光物質(zhì)溶液，所述的熒光物質(zhì)溶液中含有在受到激發(fā)光線照射時(shí)能夠產(chǎn)生熒光的熒光物質(zhì)；(c)用于產(chǎn)生激發(fā)光線的光源，所述的光源可發(fā)出透射所述第一容器并照射到所述第二容器的激發(fā)光線，從而使得所述熒光物質(zhì)產(chǎn)生熒光；和(d)用于檢測(cè)熒光的檢測(cè)器。
10.如權(quán)利要求9所述的裝置，其特征在于，所述的光源是激光器。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種基于熒光淬滅原理的免疫反應(yīng)分析方法。具體地，本發(fā)明提供了一種在熒光物質(zhì)與淬滅劑相互獨(dú)立且不接觸情況下，進(jìn)行免疫檢測(cè)的方法，本發(fā)明方法的免疫反應(yīng)在液溶膠均相反應(yīng)體系中進(jìn)行，因此反應(yīng)均勻迅速、全過程無需洗滌、可調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度、定量準(zhǔn)確、熒光物質(zhì)可重復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/542GK102401829SQ20101028458
公開日2012年4月4日 申請(qǐng)日期2010年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月17日
發(fā)明者周曉燕, 李久彤 申請(qǐng)人:龐磊, 李久彤