專利名稱：Spon2的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及SP0N2的新用途。
背景技術(shù)：
前列腺癌是北美國家男性中最常見的惡性腫瘤之一，2008年美國新確診為前列腺癌的患者占該年新確診為惡性腫瘤患者的25%。在我國，隨著人口結(jié)構(gòu)逐步老齡化，前列腺癌的發(fā)病率也在逐年增高。腫瘤血清標(biāo)志物的是目前研究的熱點。理想的腫瘤血清標(biāo)志物應(yīng)該有如下的特點能夠區(qū)分高危與健康人群，能夠用于腫瘤的診斷，方法簡單、成本低廉，能夠用于腫瘤的臨床分期評估，能夠用于腫瘤的治療效果評估，能夠用于預(yù)測腫瘤的轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)。PSA是目前應(yīng)用最為廣泛的前列腺癌血清標(biāo)志物。盡管PSA篩查帶來了諸多好處， 但近年來也飽受爭議和質(zhì)疑。近些年來，發(fā)現(xiàn)PSA檢測的對前列腺癌的特異性較差，良性前列腺增生和前列腺炎患者的血清PSA也會有所升高。除此之外，血清PSA水平在4 IOng/ ml之間屬于灰區(qū)，難以區(qū)分前列腺的良性病變與惡性病變。還有一些標(biāo)志物，或者臨床應(yīng)用較為局限，或者效果不是很理想。尋找能夠替代PSA或彌補PSA缺陷的血清診斷標(biāo)志物是十分必要的。脊椎蛋白2(SP0N2，Spondin-2，Mindin，DIL-l)屬細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)類，因在癌變與非癌變的肺泡細(xì)胞中差異表達(dá)而得名。脊椎蛋白2的氨基酸序列為SEQ ID NO :1。前列腺特異性抗原(PSA)的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種抗脊椎蛋白2的抗體、檢測脊椎蛋白2的試劑盒的新用途?？辜棺档鞍?的抗體的新用途為抗脊椎蛋白2的抗體在制備用于輔助診斷前列腺癌的試劑盒中的應(yīng)用。所述抗脊椎蛋白2的抗體為抗脊椎蛋白2的單克隆抗體和/或抗脊椎蛋白2的多克隆抗體；所述抗脊椎蛋白2的單克隆抗體為鼠來源的抗脊椎蛋白2的單克隆抗體；所述抗脊椎蛋白2的多克隆抗體為羊來源的抗脊椎蛋白2的多克隆抗體。上述抗體均是從商業(yè)途徑得到的抗體，或經(jīng)過細(xì)胞體外培養(yǎng)得到的抗體；羊來源的抗脊椎蛋白2的多克隆抗體具體可購自R&D公司，產(chǎn)品目錄號為AF-2609 ；鼠來源的抗脊椎蛋白2的單克隆抗體具體可購自Abnova公司，產(chǎn)品目錄號為H00010417-M01J。檢測脊椎蛋白2的試劑盒的新用途是檢測脊椎蛋白2的試劑盒在制備用于輔助診斷前列腺癌的試劑盒中的應(yīng)用。檢測脊椎蛋白2的試劑盒為檢測脊椎蛋白2的酶聯(lián)免疫試劑盒或檢測脊椎蛋白2 的免疫組化試劑盒。
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脊椎蛋白2在設(shè)計和/或制備用于輔助診斷前列腺癌的試劑盒中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。上述任一所述檢測脊椎蛋白2的酶聯(lián)免疫試劑盒在制備用于輔助診斷前列腺癌的試劑盒中的應(yīng)用中，所述前列腺癌為如下1)或2)所示DGleason評分為4 6分的前列腺癌、Gleason評分為7分的前列腺癌、Gleason 評分為8分的前列腺癌或Gleason評分為9 10分的前列腺癌；2)前列腺特異性抗原陰性的前列腺癌；檢測脊椎蛋白2的試劑盒檢測脊椎蛋白2的免疫組化試劑盒在制備用于輔助診斷前列腺癌的試劑盒中的應(yīng)用中，所述前列腺癌為如下I或II或III所示I、Gleason評分為7 8分的前列腺癌或Gleason評分彡6分的前列腺癌；II、WHO評分為2級的前列腺癌；
III、有轉(zhuǎn)移灶的前列腺癌。上述任一所述檢測脊椎蛋白2的酶聯(lián)免疫試劑盒在制備用于輔助診斷前列腺癌的試劑盒中的應(yīng)用中，所述前列腺特異性抗原陰性為血清中前列腺特異性抗原濃度小于等于 10ng/mlo上述任一所述檢測脊椎蛋白2的酶聯(lián)免疫試劑盒在制備用于輔助診斷前列腺癌的試劑盒中的應(yīng)用中，所述檢測脊椎蛋白2的酶聯(lián)免疫試劑盒由鼠來源的抗脊椎蛋白2的單克隆抗體、羊來源的抗脊椎蛋白2的多克隆抗體、標(biāo)準(zhǔn)品溶液、包被緩沖液、封閉液、洗滌緩沖液、終止液、底物溶液和酶標(biāo)抗體組成；所述包被緩沖液由碳酸鈉、碳酸氫鈉和水組成；所述碳酸鈉在所述包被緩沖液中的濃度為1. 59g/L，所述碳酸氫鈉在所述包被緩沖液中的濃度為2. 93g/L ；所述洗滌緩沖液由氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、Tween 20和水組成； 氯化鈉在所述洗滌緩沖液中的濃度是8g/L，氯化鉀在所述洗滌緩沖液中的濃度是0. 2g/L， 磷酸氫二鈉在所述洗滌緩沖液中的濃度是1. 44g g/L，磷酸二氫鉀在所述洗滌緩沖液中的濃度是0. Mg/L，Tween 20在所述洗滌緩沖液中的濃度是0. 1 % (體積百分比)；所述封閉液由所述洗滌緩沖液和牛血清白蛋白組成，牛血清白蛋白在所述封閉液中的濃度為10g/L ；所述終止液為2M的硫酸水溶液；所述酶標(biāo)抗體為HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體；所述標(biāo)準(zhǔn)品溶液為所述封閉液與所述脊椎蛋白2組成脊椎蛋白2濃度不同的如下溶液100，50，25，12. 5,6. 3,3. 1 和 1. 6ng/ml。上述檢測脊椎蛋白2的酶聯(lián)免疫試劑盒和免疫組化試劑盒還可從商業(yè)途徑得到； 上述檢測脊椎蛋白2的免疫組化試劑盒具體可為山羊二步法免疫組化試劑盒，具體可以購自中杉金橋生物公司，產(chǎn)品目錄號為PV-9003。上述任一所述檢測脊椎蛋白2的酶聯(lián)免疫試劑盒在制備用于輔助診斷前列腺癌的試劑盒中的應(yīng)用中，所述檢測脊椎蛋白2的酶聯(lián)免疫試劑盒中，所述包被緩沖液與所述羊來源的抗脊椎蛋白2的多克隆抗體組成抗體濃度為630ng/ml的溶液；所述封閉液與鼠來源的抗脊椎蛋白2的單克隆抗體組成抗體濃度為5ug/ml的溶液；所述封閉液與酶標(biāo)抗體組成酶標(biāo)抗體濃度為80ng/ml的溶液；
所述脊椎蛋白2的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示；所述前列腺特異性抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。本發(fā)明的另一個目的是提供一種用于輔助診斷前列腺癌的酶聯(lián)免疫試劑盒。本發(fā)明所提供的用于輔助診斷前列腺癌的酶聯(lián)免疫試劑盒由以下物質(zhì)組成上述任一所述抗脊椎蛋白2的抗體、標(biāo)準(zhǔn)品溶液、包被緩沖液、封閉液、洗滌緩沖液、終止液和酶標(biāo)抗體。上述酶聯(lián)免疫試劑盒中，所述抗體為鼠來源的抗脊椎蛋白2的單克隆抗體和羊來源的抗脊椎蛋白2的多克隆抗體；所述包被緩沖液由碳酸鈉、碳酸氫鈉和水組成；所述碳酸鈉在所述包被緩沖液中的濃度為1. 59g/L，所述碳酸氫鈉在所述包被緩沖液中的濃度為2. 93g/L ；所述洗滌緩沖液由氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、Tween 20和水組成； 氯化鈉在所述洗滌緩沖液中的濃度是8g/L，氯化鉀在所述洗滌緩沖液中的濃度是0. 2g/L， 磷酸氫二鈉在所述洗滌緩沖液中的濃度是1.44g g/L，磷酸二氫鉀在所述洗滌緩沖液中的濃度是0. 24g/L, Tween 20在所述洗滌緩沖液中的濃度是0. (體積百分比)；所述封閉液由所述洗滌緩沖液和牛血清白蛋白組成，牛血清白蛋白在所述封閉液中的濃度為10g/L ；所述終止液為2M的硫酸水溶液；所述酶標(biāo)抗體為HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體；所述標(biāo)準(zhǔn)品溶液為所述封閉液與所述脊椎蛋白2組成脊椎蛋白2濃度不同的如下溶液100，50，25，12. 5,6. 3,3. 1 和 1. 6ng/ml。上述任一所述酶聯(lián)免疫試劑盒中，所述包被緩沖液與所述羊來源的抗脊椎蛋白2 的多克隆抗體組成抗體濃度為630ng/ml的溶液；所述封閉液與鼠來源的抗脊椎蛋白2的單克隆抗體組成抗體濃度為5ug/ml的溶液；所述封閉液與酶標(biāo)抗體組成酶標(biāo)抗體濃度為 80ng/ml的溶液。實驗證明，用檢測SP0N2的酶聯(lián)免疫試劑盒對13例正常人，4例良性前列腺增生， 72例前列腺癌患者血清中的SP0N2進行檢測，結(jié)果前列腺癌患者中SP0N2的含量顯著高于正常人或良性前列腺增生者，表明通過檢測血清中SP0N2的含量可以診斷前列腺癌；尤其突出的是，SP0N2在Gleason評分4 6分的前列腺癌患者血清中的含量與正常人差異極顯著，SP0N2在PSA水平小于lOng/ml前列腺癌患者血清中的含量與正常人差異極顯著，證明用SP0N2診斷前列腺癌精確度更高更準(zhǔn)確。實驗還證明，用檢測SP0N2的免疫組化試劑盒對10例正常和前列腺癌旁組織、19 例良性前列腺增生和44例前列腺癌組織檢測。結(jié)果SP0N2在前列腺癌組織中明顯比正常組織和良性前列腺增生組織中陽性率升高，表達(dá)增強；更突出的是，SP0N2在診斷Gleason 評分(7 8)、WH0分級2級的前列腺癌、發(fā)生轉(zhuǎn)移的前列腺癌組織中染色增強更為顯著，前列腺癌中SP0N2的染色強度與PSA呈正相關(guān)，但其表達(dá)與良性病變差異明顯，遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于PSA。 證明用SP0N2診斷前列腺癌精確度更高更準(zhǔn)確。


圖1為雙夾心ELISA法檢測SP0N2濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
圖2為SP0N2在前列腺癌患者血清中較正常人和良性前列腺增生患者明顯上調(diào)。 橫線代表中位數(shù)值，差異用Willcoxon Two-Sample Test進行統(tǒng)計分析。圖3為SP0N2有助于血清PSA水平小于lOng/ml前列腺癌患者的診斷。圖4為半定量RT-PCR證實SP0N2僅在AR陽性的前列腺癌細(xì)胞系中表達(dá)。圖5為胞外蛋白Wfestern Blot證實SP0N2僅在AR陽性的前列腺癌細(xì)胞系中表達(dá)。圖6為前列腺癌患者的組織標(biāo)本中PSA的染色強度和SP0N2的染色強度呈正相關(guān)。P值用Spearman相關(guān)進行計算。(r = Spearman相關(guān)系數(shù))。圖7為SP0N2和PSA在正常前列腺組織，良性前列腺增生組織和不同Gleason評分、不同WHO分級和 Μ分期的前列腺癌組織中的表達(dá)。用HE染色作為參照，照片所示為連續(xù)切片的組織芯片上同一個組織點的同一位置。
具體實施方式
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得
下述實施例中使用的培養(yǎng)基、抗體、化學(xué)試劑如下
名稱產(chǎn)地貨號
氯化鈉國產(chǎn)分析純
氯化鉀國產(chǎn)分析純
磷酸氫二鈉國產(chǎn)分析純
磷酸二氫鉀國產(chǎn)分析純
Tween 20國產(chǎn)分析純
HRP標(biāo)記山羊抗小鼠中杉金橋ZB-2305
IgG(H+L)
SP0N2羊多克隆抗體R&D公司AF-2609
(Anti-human Mindin
Antibody)
山羊二步法免疫組化試劑盒中杉金橋生物PV-9003
免疫組化專用磷酸鹽緩沖液中杉金橋生物ZLI-9061
(0. OlM PH = 7. 2 7. 4)
檸檬酸鹽抗原修復(fù)液(0.01中杉金橋生物ZLI9064
M PH = 6. 0)
DAB顯色試劑盒中杉金橋生物ZLI-9031
前列腺癌組織芯片陜西超英生物科技(編號 PR807)
二甲苯國產(chǎn)分析純
中性樹膠國產(chǎn)分析純
蘇木素中杉金橋生物ZLI-9610
氨水國產(chǎn)分析純
碳酸氫鈉國產(chǎn)分析純
牛血清清蛋白(BSA)美國Proliant公司RF101
可溶性單組分TMB底物溶天根科技PA107-01
液
濃硫酸國產(chǎn)分析純
SP0N2鼠單克隆抗體AbnovaH00010417-M01J
(SP0N2 monoclonal
antibody (MOlJ), clone 3C6)
SP0N2 標(biāo)準(zhǔn)品(SP0N2AbnovaH00010417-P01
Recombinant Protein(POl))
PSA羊多克隆抗體R&D公司AF1344
(Anti-human Kallikrein
3/PSA Antibody)
下述實施例中使用的主要儀器設(shè)備如下
免疫組化筆中杉金橋生物ZLI-9305
96孔酶標(biāo)板CorningCostar 9018
1X70熒光倒置顯微鏡Olympus
酶聯(lián)檢測儀Bio-Rad
實施例1、用于診斷前列腺癌的試劑盒
本實施例中，檢測樣本中SP0N2或PSA的含量值均用M(Qk)表示，M表示樣本中
SP0N2含量的中位數(shù)表示樣本中SP0N2含量的四分位數(shù)間距，即( =上四分位數(shù)值與下四分位數(shù)值之差的絕對值。一、試劑盒組成1、包被抗體羊來源的抗脊椎蛋白2的多克隆抗體(SP0N2羊多克隆抗體)。2、結(jié)合抗體鼠來源的抗脊椎蛋白2的單克隆抗體(SP0N2鼠單克隆抗體)。3、標(biāo)準(zhǔn)品脊椎蛋白2。封閉液與脊椎蛋白2組成脊椎蛋白2濃度不同的如下溶液100，50，25，12. 5,6. 3,3. 1 和 1. 6ng/ml。4、包被緩沖液由碳酸鈉、碳酸氫鈉和水組成；所述碳酸鈉在所述包被緩沖液中的濃度為1. 59g/L，所述碳酸氫鈉在所述包被緩沖液中的濃度為2. 93g/L ；5、洗滌緩沖液由氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、Tween 20和水組成； 氯化鈉在所述洗滌緩沖液中的濃度是8g/L，氯化鉀在所述洗滌緩沖液中的濃度是0. 2g/L， 磷酸氫二鈉在所述洗滌緩沖液中的濃度是1. 44g/L，磷酸二氫鉀在所述洗滌緩沖液中的濃度是0. Mg/L，Tween 20在所述洗滌緩沖液中的濃度是0. 1 % (體積百分比)；6、封閉液由所述洗滌緩沖液和牛血清白蛋白組成，牛血清白蛋白在所述封閉液中的濃度為10g/L。7、終止液2M的硫酸水溶液；8、底物溶液的組成四甲基聯(lián)苯胺(3，3，，5，5，-Tetramethylbenzidine, TMB)的水溶液。9、酶標(biāo)抗體HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體。10、如下溶液1)包被抗體的溶液由包被緩沖液與包被抗體組成，包被抗體在溶液中的濃度為630ng/ml ；2)結(jié)合抗體的溶液由封閉液與結(jié)合抗體組成，結(jié)合抗體在溶液中的濃度為5ug/ ml ；3)酶標(biāo)抗體的溶液由封閉液與酶標(biāo)抗體組成，酶標(biāo)抗體在溶液中的濃度為 80ng/ml。二、試劑盒制備碳酸鹽包被緩沖液按照如下方法配制向900ml去離子水中加入1. 59g碳酸鈉和 2. 93g碳酸氫鈉，去離子水定容至1L。ELISA洗滌緩沖液(PBST)按照如下方法配制向900ml蒸餾水中加入8g氯化鈉， 0. 2g氯化鉀，1. 44g磷酸氫二鈉，0. 24g磷酸二氫鉀，調(diào)PH值至7. 4，用蒸餾水定容至1L，高壓滅菌后冷卻至室溫，加入0. (體積百分比)Tween 20試劑混勻后使用。ELISA封閉液向上述ELISA洗滌緩沖液加入IOg牛血清白蛋白(BSA)，用ELISA 洗滌緩沖液定容至1L。ELISA反應(yīng)終止液2M硫酸水溶液。三、試劑盒的應(yīng)用(一)SP0N2雙夾心ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立1、用碳酸鹽包被緩沖液稀釋SP0N2羊多克隆抗體(Anti-human Mindin Antibody) 630ng/ml，置于酶聯(lián)板中每孔100 μ 1 4°C包被過夜；2、用ELISA洗滌緩沖液洗酶聯(lián)板3次；3、加入 ELISA 封閉液 100 μ 1 每孔，37°C 2h ；4、用 ELISA 封閉液梯度稀釋 SP0N2 標(biāo)準(zhǔn)品(SP0N2 Recombinant Protein(POl)) 濃度分別為100，50，25，12. 5，6. 3，3. 1和1. 6ng/ml，取未加標(biāo)準(zhǔn)品的ELISA封閉液作為空白對照，每個濃度做兩個重復(fù)。每孔100 μ 1置于酶聯(lián)板中，37°C 2h ；5、用ELISA洗滌緩沖液洗酶聯(lián)板3次；6、用 ELISA封閉液稀釋 SP0N2 鼠單克隆抗體(SP0N2monoclonal antibody (MOlJ)， clone 3C6)至 5μ g/ml，每孔 100 μ 1 置于酶聯(lián)板中，37°C 2h ；7、用ELISA洗滌緩沖液洗酶聯(lián)板3次；8、用ELISA封閉液稀釋HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG (H+L)至80ng/ml，每孔100 μ 1置于酶聯(lián)板中，37 °C 2h ；9、用ELISA洗滌緩沖液洗酶聯(lián)板3次；10、每孔加入100 μ 1可溶性TMB單組分底物溶液，避光15_20min ；11、加入ELISA中止液每孔100 μ 1中止反應(yīng)；12、讀取每孔450nm光吸收讀數(shù)，減去570nm光吸收讀數(shù)，即為該孔讀數(shù)，取兩個孔的平均值作為該濃度的讀數(shù)；13、每個濃度的讀數(shù)減去空白對照讀數(shù)后，取對數(shù)，與標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)擬合線性關(guān)系。獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1 所示。Y=L 5763x+2. 5237，R2 = 0. 9768.( 二)用建立的雙夾心ELISA法檢測患者血清檢測89份人血清標(biāo)本，包括13例正常老年人(Normal)，4例良性前列腺增生患者(BPH)，72例前列腺癌患者的血清(PCa)。血清標(biāo)本的采取均經(jīng)過患者和正常老年人的同
辰、ο檢測方法如下1、用碳酸鹽包被緩沖液稀釋SP0N2羊多克隆抗體(Anti-human Mindin Antibody) 630ng/ml，置于酶聯(lián)板中每孔100 μ 1 4°C包被過夜；2、用ELISA洗滌緩沖液洗酶聯(lián)板3次；3、加入 ELISA 封閉液 100 μ 1 每孔，37°C 2h ；4、按待測血清ELISA封閉液=1 2稀釋待測血清，取未加標(biāo)準(zhǔn)品的ELISA封閉液作為空白對照。每孔100μ 1置于酶聯(lián)板中，37°C 2h ；5、用ELISA洗滌緩沖液洗酶聯(lián)板3次；6、用 ELISA封閉液稀釋 SP0N2 鼠單克隆抗體(SP0N2monoclonal antibody (MOlJ)， clone 3C6)至 5μ g/ml，每孔 100 μ 1 置于酶聯(lián)板中，37°C 2h ；7、用ELISA洗滌緩沖液洗酶聯(lián)板3次；8、用ELISA封閉液稀釋HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG (H+L)至80ng/ml，每孔100 μ 1置于酶聯(lián)板中，37 °C 2h ；9、用ELISA洗滌緩沖液洗酶聯(lián)板3次；10、每孔加入100 μ 1可溶性TMB單組分底物溶液，避光15_20min ；11、加入ELISA中止液每孔100 μ 1中止反應(yīng)；12、讀取每孔450nm光吸收讀數(shù)，減去570nm光吸收讀數(shù)，即為該孔讀數(shù)；13、每個孔的讀數(shù)減去空白對照讀數(shù)后，取對數(shù)，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，取3XlgH)(代入曲線所得值)即為血清SP0N2濃度。用Willcoxon Two-Sample Test統(tǒng)計分析正常群體中SP0N2的含量與前列腺癌患者群體中SP0N2的含量差異是否顯著。結(jié)果如表1和圖2所示。結(jié)果前列腺癌患者血清中SP0N2含量較正常人或所有的良性病變者有明顯的上調(diào)(***，P小于0. 001)。應(yīng)用Willcoxon Two-Sample Test確認(rèn)其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。表明，可以用該試劑盒診斷前列腺癌。表1.應(yīng)用雙夾心ELISA檢測SP0N2在正常人、良性增生者和前列腺癌患者血清中的差異表達(dá)(單位ng/ml)
權(quán)利要求
1.抗脊椎蛋白2的抗體在制備用于輔助診斷前列腺癌的試劑盒中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述抗脊椎蛋白2的抗體為抗脊椎蛋白2 的單克隆抗體和/或抗脊椎蛋白2的多克隆抗體；所述抗脊椎蛋白2的單克隆抗體為鼠來源的抗脊椎蛋白2的單克隆抗體；所述抗脊椎蛋白2的多克隆抗體為羊來源的抗脊椎蛋白2的多克隆抗體。
3.檢測脊椎蛋白2的試劑盒在制備用于輔助診斷前列腺癌的試劑盒中的應(yīng)用； 或脊椎蛋白2在設(shè)計和/或制備用于輔助診斷前列腺癌的試劑盒中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的應(yīng)用，其特征在于所述檢測脊椎蛋白2的試劑盒為檢測脊椎蛋白2的酶聯(lián)免疫試劑盒或檢測脊椎蛋白2的免疫組化試劑盒。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的應(yīng)用，其特征在于所述檢測脊椎蛋白2的試劑盒為檢測脊椎蛋白2的酶聯(lián)免疫試劑盒，所述前列腺癌為如下1)或2、所示DGleason評分為4 6分的前列腺癌、Gleason評分為7分的前列腺癌、Gleason評分為8分的前列腺癌或Gleason評分為9 10分的前列腺癌； 2)前列腺特異性抗原陰性的前列腺癌；所述檢測脊椎蛋白2的試劑盒為檢測脊椎蛋白2的免疫組化試劑盒，所述前列腺癌為如下I或II或III所示I、Gleason評分為7 8分的前列腺癌或Gleason評分彡6分的前列腺癌；II、WHO評分為2級的前列腺癌；III、有轉(zhuǎn)移灶的前列腺癌。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的應(yīng)用，其特征在于所述檢測脊椎蛋白2的試劑盒為檢測脊椎蛋白2的酶聯(lián)免疫試劑盒，所述前列腺特異性抗原陰性為血清中前列腺特異性抗原濃度小于等于lOng/ml ；所述檢測脊椎蛋白2的酶聯(lián)免疫試劑盒由鼠來源的抗脊椎蛋白2的單克隆抗體、羊來源的抗脊椎蛋白2的多克隆抗體、標(biāo)準(zhǔn)品溶液、包被緩沖液、封閉液、洗滌緩沖液、終止液、 底物溶液和酶標(biāo)抗體組成；所述包被緩沖液由碳酸鈉、碳酸氫鈉和水組成；所述碳酸鈉在所述包被緩沖液中的濃度為1. 59g/L，所述碳酸氫鈉在所述包被緩沖液中的濃度為2. 93g/L ；所述洗滌緩沖液由氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、Tween 20和水組成；氯化鈉在所述洗滌緩沖液中的濃度是8g/L，氯化鉀在所述洗滌緩沖液中的濃度是0. 2g/L，磷酸氫二鈉在所述洗滌緩沖液中的濃度是1.44g g/L，磷酸二氫鉀在所述洗滌緩沖液中的濃度是0. 24g/L, Tween 20在所述洗滌緩沖液中的濃度是0. (體積百分比)；所述封閉液由所述洗滌緩沖液和牛血清白蛋白組成，牛血清白蛋白在所述封閉液中的濃度為10g/L ；所述終止液為2M的硫酸水溶液； 所述酶標(biāo)抗體為HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體；所述標(biāo)準(zhǔn)品溶液為所述封閉液與所述脊椎蛋白2組成脊椎蛋白2濃度不同的如下溶液:100,50,25,12. 5,6. 3,3. 1 和 1. 6ng/ml。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的應(yīng)用，其特征在于所述檢測脊椎蛋白2的酶聯(lián)免疫試劑盒中，所述包被緩沖液與所述羊來源的抗脊椎蛋白2的多克隆抗體組成抗體濃度為630ng/ml的溶液；所述封閉液與鼠來源的抗脊椎蛋白2 的單克隆抗體組成抗體濃度為5ug/ml的溶液；所述封閉液與酶標(biāo)抗體組成酶標(biāo)抗體濃度為80ng/ml的溶液；所述脊椎蛋白2的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示；所述前列腺特異性抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。
8.一種用于輔助診斷前列腺癌的酶聯(lián)免疫試劑盒，由以下物質(zhì)組成抗脊椎蛋白2的抗體、標(biāo)準(zhǔn)品溶液、包被緩沖液、封閉液、洗滌緩沖液、終止液和酶標(biāo)抗體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述抗體為鼠來源的抗脊椎蛋白2的單克隆抗體和羊來源的抗脊椎蛋白2的多克隆抗體；所述包被緩沖液由碳酸鈉、碳酸氫鈉和水組成；所述碳酸鈉在所述包被緩沖液中的濃度為1. 59g/L，所述碳酸氫鈉在所述包被緩沖液中的濃度為2. 93g/L ；所述洗滌緩沖液由氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、Tween 20和水組成；氯化鈉在所述洗滌緩沖液中的濃度是8g/L，氯化鉀在所述洗滌緩沖液中的濃度是0. 2g/L，磷酸氫二鈉在所述洗滌緩沖液中的濃度是1.44g g/L，磷酸二氫鉀在所述洗滌緩沖液中的濃度是0. 24g/L, Tween 20在所述洗滌緩沖液中的濃度是0. (體積百分比)；所述封閉液由所述洗滌緩沖液和牛血清白蛋白組成，牛血清白蛋白在所述封閉液中的濃度為10g/L ；所述終止液為2M的硫酸水溶液；所述酶標(biāo)抗體為HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體；所述標(biāo)準(zhǔn)品溶液為所述封閉液與所述脊椎蛋白2組成脊椎蛋白2濃度不同的如下溶液100，50，25，12. 5,6. 3,3. 1 和 1. 6ng/ml。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述包被緩沖液與所述羊來源的抗脊椎蛋白2的多克隆抗體組成抗體濃度為630ng/ml的溶液；所述封閉液與鼠來源的抗脊椎蛋白2的單克隆抗體組成抗體濃度為5ug/ml的溶液；所述封閉液與酶標(biāo)抗體組成酶標(biāo)抗體濃度為80ng/ml的溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開了SPON2的新用途。該新用途是抗脊椎蛋白2的抗體在制備用于輔助診斷前列腺癌的試劑盒中的應(yīng)用。實驗證明，用檢測SPON2的酶聯(lián)免疫試劑盒或用檢測SPON2的免疫組化試劑盒對前列腺癌進行診斷，診斷結(jié)果更精確和準(zhǔn)確，優(yōu)于現(xiàn)有的PSA診斷方法。
文檔編號G01N33/577GK102346184SQ201010244440
公開日2012年2月8日 申請日期2010年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月3日
發(fā)明者周建光, 錢曉龍 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所