專利名稱：熒光相關(guān)光譜設(shè)備和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用熒光相關(guān)光譜法(FCS)的熒光分析設(shè)備和熒光分析方法，更 具體地，涉及一種通過FCS來進(jìn)行例如蛋白質(zhì)、肽、核酸、類脂、糖鏈、氨基酸和其它生物分 子等各種分子的相互作用、結(jié)合和/或離解狀態(tài)的檢測和分析的設(shè)備和方法。
背景技術(shù)：
根據(jù)近年來光學(xué)測量技術(shù)的發(fā)展，已可利用能夠以分子水平測量和分析熒光的熒 光相關(guān)光譜法(FCS)(非專利文獻(xiàn)1和2)。簡言之，在FCS中，通過使用激光共聚焦顯微鏡 以及能夠光子計(jì)數(shù)(單光子檢測)的超高敏感光子檢測裝置的光學(xué)系統(tǒng)，測量來自通過溶 液樣品中的微區(qū)域(稱為“共聚焦體積”，顯微鏡的激光光束會(huì)聚的聚焦區(qū)域)的例如熒光 分子、熒光標(biāo)記分子等熒光粒子的熒光強(qiáng)度，然后，計(jì)算所得到的熒光強(qiáng)度的自相關(guān)函數(shù)。 可以將自相關(guān)函數(shù)認(rèn)為是來自熒光粒子的熒光強(qiáng)度漲落的指數(shù)，并且熒光強(qiáng)度的漲落對應(yīng) 于微區(qū)域中熒光粒子數(shù)量的漲落，因此，在自相關(guān)函數(shù)的值中，反映了微區(qū)域中熒光粒子的 平均停留時(shí)間(平移擴(kuò)散時(shí)間)和熒光粒子的平均停留數(shù)量(粒子平均數(shù)量)。結(jié)果，自 相關(guān)函數(shù)的值提供了關(guān)于熒光分子的運(yùn)動(dòng)速度、尺寸和濃度等的信息，并且基于該信息，可 以檢測例如分子的結(jié)構(gòu)或大小變化、分子的結(jié)合和/或離解反應(yīng)或者分散和聚集等各種現(xiàn) 象。此外，在生物科學(xué)、醫(yī)學(xué)或藥學(xué)領(lǐng)域，已嘗試在生物分子等的狀態(tài)和運(yùn)動(dòng)的檢測或 觀察中使用FCS來闡明處于細(xì)胞或分子水平的生物分子等的各種現(xiàn)象或反應(yīng)(專利文獻(xiàn)1 和2，非專利文獻(xiàn)3)。例如，在具有連接于一對可相互結(jié)合的分子(抗原和抗體、DNA和蛋白 質(zhì)等)中的至少之一的熒光標(biāo)記的這一對分子的反應(yīng)中，在來自熒光標(biāo)記的熒光強(qiáng)度的漲 落中，反映了該至少一個(gè)分子上的熒光標(biāo)記的運(yùn)動(dòng)和/或狀態(tài)變化，以致可以檢測蛋白質(zhì)、 DNA等中的分子間結(jié)合。特別地，已提出了一種模型公式，其給出針對多個(gè)熒光分子組分進(jìn) 出觀察熒光的微區(qū)域的狀態(tài)的熒光強(qiáng)度的自相關(guān)函數(shù)值，并且利用該模型公式，確定溶液 樣品中的多個(gè)熒光分子組分的存在比，并且基于所確定的比率，可以計(jì)算離解常數(shù)、結(jié)合常 數(shù)等(非專利文獻(xiàn)2)。另外，由于與傳統(tǒng)的生化方法相比，在FCS中可以利用更少的樣品量 并在更短的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行測量，所以在醫(yī)學(xué)、藥學(xué)等領(lǐng)域中還期望將FCS應(yīng)用于各種疾病的 臨床診斷或者生物活性物質(zhì)的篩選。專利文獻(xiàn)1 日本特開專利2005-098876號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2 日本特開專利2008-292371號(hào)公報(bào)非專利文獻(xiàn) 1 :Masataka Kaneshiro, Protein, Nucleic acidEnzyme, Vol. 44, No. 9，p.1431-1438(1999)非專利文獻(xiàn) 2 :F. J. Meyer-Alms, Fluorescence CorrelationSpectroscopy、 R. Rigler, edit. Springer, Berlin,2000, p.204-224非專利文獻(xiàn)3 =Noriko Kato, et. al. Gene Medicine, Vol. 6，No. 2，p. 271-27
發(fā)明內(nèi)容
在通過上述的熒光相關(guān)光譜法來檢測包含共存的多種分子組分的樣品中各組分 的存在比(分子數(shù)之比)，例如，為了檢測至少兩種組分的分子間結(jié)合比率或者檢測伴隨著 分子量變化等的反應(yīng)進(jìn)度，通常，首先進(jìn)行要測試樣品的熒光強(qiáng)度的測量和自相關(guān)函數(shù)的 計(jì)算，隨后，進(jìn)行針對所計(jì)算出的自相關(guān)函數(shù)c( τ )擬合下列公式的處理，以確定各組分的 存在比yi， 其中，N是在共聚焦體積中存在的熒光粒子的平均數(shù)量；AR是共聚焦體積的縱向 長度WZ與橫向半徑WO之比(AR = wz/wo)，稱為結(jié)構(gòu)參數(shù)(參見圖1(B))；以及Ti是各 組分的平移擴(kuò)散時(shí)間。因此，為了通過根據(jù)公式(1)的自相關(guān)函數(shù)的擬合來確定各組分的 存在比，優(yōu)選預(yù)先確定結(jié)構(gòu)參數(shù)AR和各組分的平移擴(kuò)散時(shí)間值τ i(由于N是由C(O)給 出的，因此通過擬合給出N)。在這方面，結(jié)構(gòu)參數(shù)AR和平移擴(kuò)散時(shí)間τ 的值可以依賴于 測量條件或設(shè)備調(diào)整條件而變化。因此，通常，為了以高精確度進(jìn)行測量，在每次測量測試 樣品(要測試樣品)的熒光強(qiáng)度時(shí)，針對連接有該測試樣品中的組分的熒光標(biāo)記(通常為 熒光染料)的樣品，進(jìn)行熒光強(qiáng)度的測量和其自相關(guān)函數(shù)的計(jì)算，以由所計(jì)算出的自相關(guān) 函數(shù)的值確定結(jié)構(gòu)參數(shù)AR;此外針對只包含測試樣品中的各組分的樣品，進(jìn)行熒光強(qiáng)度的 測量和其自相關(guān)函數(shù)的計(jì)算，以計(jì)算出各組分的平移擴(kuò)散時(shí)間。(下文中，將其中僅存在測 試樣品中所包含的一種組分的樣品稱為“對照樣品”)。例如，在某些熒光分子與其它分子 結(jié)合反應(yīng)的情況下，各自制備了具有所有某些熒光分子已結(jié)合至其它分子的樣品以及具有 所有某些熒光分子已從其它分子離解的樣品，并且無論何時(shí)進(jìn)行測試樣品的熒光測量和分 析，都分別進(jìn)行這些樣品的熒光測量以及自相關(guān)函數(shù)和擴(kuò)散平移時(shí)間值的計(jì)算。然而，在每次對測試樣品進(jìn)行熒光強(qiáng)度測量時(shí)進(jìn)行熒光標(biāo)記的樣品和對照樣品的 熒光測量和自相關(guān)函數(shù)計(jì)算需要較長的時(shí)間和更多勞動(dòng)。盡管連接于測試樣品中的組分的 熒光標(biāo)記的樣品的獲取和/或制備相對容易(通常，預(yù)先制備足夠量的熒光標(biāo)記)，但對照 樣品通常可能是昂貴或稀少的，并且其制備還需要一些勞動(dòng)，因此，優(yōu)選這類對照樣品的熒 光測量次數(shù)盡可能少。因此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種熒光相關(guān)光譜設(shè)備和/或方法，在通過FCS 以檢測包含共存的多種組分的樣品中各組分的存在比的測量中，所述熒光相關(guān)光譜設(shè)備和 方法能夠盡可能減少對對照樣品進(jìn)行熒光測量的次數(shù)。在這點(diǎn)上，根據(jù)本發(fā)明的發(fā)明人的研究，已通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，盡管任意多種組分中各 組分的平移擴(kuò)散時(shí)間的絕對值隨測量條件和設(shè)備調(diào)整而變化，但是在相同的測量條件和相 同的設(shè)備調(diào)整狀態(tài)下檢測的多個(gè)組分的平移擴(kuò)散時(shí)間值的比即使在不同的測量條件和/ 或不同的設(shè)備調(diào)整狀態(tài)下也幾乎恒定。因此，利用該知識(shí)，提出了本發(fā)明以實(shí)現(xiàn)上述目的。在本發(fā)明的一方面，提供了一種熒光相關(guān)光譜設(shè)備，采用其能夠檢測溶液樣品中 所包含的具有熒光標(biāo)記的至少兩種組分中各組分的存在比，所述熒光相關(guān)光譜設(shè)備包括:數(shù)據(jù)存儲(chǔ)區(qū)，其存儲(chǔ)所述至少兩種組分中各組分的平移擴(kuò)散時(shí)間的比的值；以及檢測部，其 使用所存儲(chǔ)的所述至少兩種組分中各組分的平移擴(kuò)散時(shí)間的比的值，由用所述溶液樣品測 量出的熒光強(qiáng)度的自相關(guān)函數(shù)值檢測所述至少兩種組分中各組分的存在比。如已表明的，任意分子或粒子的平移擴(kuò)散時(shí)間值依賴于熒光測量中的測量條件例 如溫度、溶液的粘度和設(shè)備的調(diào)整狀態(tài)，尤其是依賴于激光光束的會(huì)聚狀態(tài)、溶液容器的蓋 玻片的厚度等而變化的共聚焦體積的尺寸而變化。然而，根據(jù)本發(fā)明的發(fā)明人所做的實(shí)驗(yàn)， 已證實(shí)，不管測量條件和設(shè)備的調(diào)整狀態(tài)如何，任意多種分子或分子組裝的平移擴(kuò)散時(shí)間 值的比幾乎是恒定的(保持不變)。因此，在本發(fā)明中，溶液樣品中所包含的至少兩種組分 中各組分的平移擴(kuò)散時(shí)間的比的值已預(yù)先準(zhǔn)備并存儲(chǔ)在該設(shè)備中，然后，參照平移擴(kuò)散時(shí) 間比的值，由用溶液樣品測量出的熒光強(qiáng)度的自相關(guān)函數(shù)值，檢測溶液樣品中的至少兩種 組分的各組分的存在比。根據(jù)該結(jié)構(gòu)，可以省略對照樣品的平移擴(kuò)散時(shí)間值的檢測，即，每 次改變測量條件或設(shè)備調(diào)整都進(jìn)行的溶液樣品中至少兩種組分中各組分的平移擴(kuò)散時(shí)間 值的檢測，從而可以顯著地減輕用于制備、測量和分析對照樣品的負(fù)擔(dān)。就此而論，通常，至 少兩種組分中各組分的平移擴(kuò)散時(shí)間比的值可以是至少兩種組分中各組分的平移擴(kuò)散時(shí) 間與具有要連接于這些組分的熒光標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的平移擴(kuò)散時(shí)間之比的值(通常，具有 熒光標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可以是熒光染料分子本身，但不限于此)。在這種情況下，通過將標(biāo)準(zhǔn) 物質(zhì)的平移擴(kuò)散時(shí)間乘以至少兩種組分中各組分的平移擴(kuò)散時(shí)間的比的值來給出至少兩 種組分中各組分的平移擴(kuò)散時(shí)間的絕對值。至于該設(shè)備的結(jié)構(gòu)參數(shù)，無論測量條件和/或 設(shè)備的調(diào)整狀態(tài)何時(shí)改變，都可以由用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測量出的熒光強(qiáng)度的自相關(guān)函數(shù)值確定該 值，然后，將該值存儲(chǔ)在該設(shè)備中。在上述本發(fā)明設(shè)備的結(jié)構(gòu)中，可以由用至少兩種組分中各組分測量出的熒光強(qiáng)度 的自相關(guān)函數(shù)值所確定的至少兩種組分中各組分的平移擴(kuò)散時(shí)間，計(jì)算出至少兩種組分中 各組分的平移擴(kuò)散時(shí)間比的值，然后，將該值存儲(chǔ)在上述數(shù)據(jù)存儲(chǔ)區(qū)中。在這點(diǎn)上，一旦確 定的至少兩種組分中各組分的平移擴(kuò)散時(shí)間比的值，該值在不同的測量條件和/或不同的 設(shè)備調(diào)整狀態(tài)下都會(huì)保持不變，因此，對于各組分，在相同的測量條件和設(shè)備的調(diào)整狀態(tài)下 以足夠的精度進(jìn)行至少一次熒光測量、自相關(guān)函數(shù)的計(jì)算和平移擴(kuò)散時(shí)間的計(jì)算是足夠 的，從而將顯著減少現(xiàn)有技術(shù)中所需要的時(shí)間和勞動(dòng)。因此，本發(fā)明的設(shè)備進(jìn)一步可以包 括由針對所述至少兩種組分中各組分測量出的熒光強(qiáng)度的自相關(guān)函數(shù)值確定所述至少兩 種組分中各組分的平移擴(kuò)散時(shí)間的部；計(jì)算所述至少兩種組分中各組分的平移擴(kuò)散時(shí)間的 比的值的部；以及將至少所述兩種組分中各組分的平移擴(kuò)散時(shí)間的比的值存儲(chǔ)在所述數(shù)據(jù) 存儲(chǔ)區(qū)中的部。另外，由于在各種測量條件和設(shè)備的調(diào)整狀態(tài)下至少兩種組分中各組分的 平移擴(kuò)散時(shí)間比的值保持不變，作為至少兩種組分中各組分的平移擴(kuò)散時(shí)間比的要存儲(chǔ)在 數(shù)據(jù)存儲(chǔ)區(qū)中的值可以是未在同一設(shè)備中而是在不同設(shè)備中已用實(shí)驗(yàn)方法或理論上預(yù)先 確定的值。因此，本發(fā)明的設(shè)備還可以包括將所述至少兩種組分中各組分的平移擴(kuò)散時(shí)間 的比的預(yù)定值存儲(chǔ)在所述數(shù)據(jù)存儲(chǔ)區(qū)中的部。在本發(fā)明的設(shè)備的一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過針對用包含至少兩種組分的溶液樣 品測量出的熒光強(qiáng)度的自相關(guān)函數(shù)值，擬合自相關(guān)函數(shù)的理論公式，檢測要測試溶液樣品 中的至少兩種組分中各組分的存在比。理論公式包括至少兩種組分中各組分的平移擴(kuò)散時(shí) 間比的值作為其參數(shù)，其中，可以將通過使至少兩種組分中各組分的平移擴(kuò)散時(shí)間的比的
6值乘以具有熒光標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的平移擴(kuò)散時(shí)間而獲得的值用作至少兩種組分中各組分 的平移擴(kuò)散時(shí)間。此外，在上述擬合中，至少兩種組分中各組分的平移擴(kuò)散時(shí)間不是檢測值，而是估 計(jì)值，從而，可能降低擬合的精確度。因此，可以設(shè)計(jì)本發(fā)明的設(shè)備包括在擬合的卡方值大 于預(yù)定閾值時(shí)產(chǎn)生擬合精度不足的警告，從而可以忽略具有低擬合精度的檢測結(jié)果的部。 另外，由于擬合的精度會(huì)依賴于激發(fā)波長和所檢測到的熒光波長而變化(因?yàn)榧す夤馐?聚光度和光電檢測器的靈敏度可依賴于波長而改變)，因此，優(yōu)選可以針對不同標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)設(shè) 置不同的預(yù)定閾值。另外，根據(jù)上述本發(fā)明的設(shè)備，提出了一種通過使用至少兩種組分中各組分的“平 移擴(kuò)散時(shí)間比”來確定溶液樣品中所包含的被熒光標(biāo)記的至少兩種組分中各組分的存在比 的方法。因此，本發(fā)明的用于通過熒光相關(guān)光譜法檢測溶液樣品中所包含的具有熒光標(biāo)記 的至少兩種組分中各組分的存在比的方法包括以下步驟使用存儲(chǔ)在數(shù)據(jù)存儲(chǔ)區(qū)中的所述 至少兩種組分中各組分的平移擴(kuò)散時(shí)間的比的值，由針對溶液樣品測量出的熒光強(qiáng)度的自 相關(guān)函數(shù)值檢測所述至少兩種組分中各組分的存在比。此外，在該方法中，所述至少兩種組分中各組分的平移擴(kuò)散時(shí)間比的值可以是所 述至少兩種組分中各組分的平移擴(kuò)散時(shí)間與具有所述熒光標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的平移擴(kuò)散時(shí) 間之比的值。另外，通過將針對熒光強(qiáng)度的自相關(guān)函數(shù)值擬合包括至少兩種組分中各組分 的平移擴(kuò)散時(shí)間比的值作為參數(shù)的自相關(guān)函數(shù)的理論公式，由所述用包含至少兩種組分的 溶液樣品測量出的熒光強(qiáng)度的自相關(guān)函數(shù)值，可以檢測至少兩種組分中各組分的存在比， 并且在該理論公式中，可以使用通過將具有熒光標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的平移擴(kuò)散時(shí)間乘以至少 兩種組分中各組分的平移擴(kuò)散時(shí)間的比的值而得到的值作為至少兩種組分中各組分的平 移擴(kuò)散時(shí)間。而且，在上述方法中，存儲(chǔ)溶液樣品中所包含的至少兩種組分中各組分的平移 擴(kuò)散時(shí)間比的值可以通過以下任一步驟來進(jìn)行在由針對所述至少兩種組分中各組分測量 出的熒光強(qiáng)度的自相關(guān)函數(shù)值確定至少兩種組分中各組分的平移擴(kuò)散時(shí)間，并且計(jì)算所述 至少兩種組分中各組分的平移擴(kuò)散時(shí)間比的值之后，將所述至少兩種組分中各組分的平移 擴(kuò)散時(shí)間的比的值存儲(chǔ)在所述數(shù)據(jù)存儲(chǔ)區(qū)中的步驟；以及將至少兩種組分中各組分的平移 擴(kuò)散時(shí)間的比的預(yù)定值存儲(chǔ)在數(shù)據(jù)存儲(chǔ)區(qū)中的步驟。根據(jù)上述本發(fā)明的結(jié)構(gòu)，可以實(shí)質(zhì)上減少針對對照樣品的熒光測量、計(jì)算自相關(guān) 函數(shù)值和檢測平移擴(kuò)散時(shí)間的次數(shù)。因此，不必在每次測量熒光強(qiáng)度時(shí)針對使用要測試樣 品制備對照樣品，因而，會(huì)縮短測量的時(shí)間。另外，在通過具有要分配各個(gè)樣品的多個(gè)孔的 微型板進(jìn)行測量的情況下，不必過多地使用用于對照樣品的孔。此外，在本發(fā)明中，可以基于由以足夠精度針對各組分進(jìn)行的測量獲得的平移 擴(kuò)散時(shí)間的比來確定要測試樣品中至少兩種組分中各組分的平移擴(kuò)散時(shí)間，因此，期望 改善關(guān)于要測試樣品的檢測結(jié)果的可靠性。在FCS中，通過統(tǒng)計(jì)地處理熒光測量結(jié)果來 計(jì)算平移擴(kuò)散時(shí)間，因而，本質(zhì)上，所計(jì)算出的平移擴(kuò)散時(shí)間的結(jié)果中存在相當(dāng)大的離散 (dispersion)。即，僅通過在對要測試樣品的每次熒光測量時(shí)進(jìn)行的對于對照樣品的極少 次或有限次測量而檢測到的平移擴(kuò)散時(shí)間值的可靠性并不會(huì)一直高，因此，利用那些平移 擴(kuò)散時(shí)間所獲得的要測試樣品的檢測結(jié)果幾乎不準(zhǔn)確。然而，在本發(fā)明中，通過使用已在足 夠的時(shí)間內(nèi)確定的各對照樣品的平移擴(kuò)散時(shí)間的比，可以實(shí)現(xiàn)改善對于要測試樣品的檢測結(jié)果的精度。根據(jù)以下對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案的說明，本發(fā)明的其它目的和優(yōu)點(diǎn)將變得顯而 易見。


圖IA是根據(jù)本發(fā)明的熒光相關(guān)光譜設(shè)備的內(nèi)部結(jié)構(gòu)的示意圖。圖IB是共聚焦體 積(共聚焦顯微鏡的觀察區(qū))的示意圖。圖2示出示意性地表示本發(fā)明的熒光相關(guān)光譜設(shè)備中所計(jì)算出的熒光強(qiáng)度的自 相關(guān)函數(shù)的曲線圖(左圖)以及在測量樣品中分子的示意圖(右圖)。圖2A、圖2B、圖2C 各自示出針對要測試樣品中所包含的一種組分的對照樣品1所獲得的自相關(guān)函數(shù)、針對要 測試樣品中所包含的另一種組分的對照樣品2所獲得的自相關(guān)函數(shù)、以及針對要測試樣品 所獲得的自相關(guān)函數(shù)。在附圖中，箭頭表示要測試樣品中的各組分的平移擴(kuò)散時(shí)間(τ ， τ 2)。
具體實(shí)施例方式以下，詳細(xì)地描述根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。熒光相關(guān)光譜設(shè)備的結(jié)構(gòu)和分析方法參考圖1Α，根據(jù)本發(fā)明的熒光相關(guān)光譜設(shè)備1的優(yōu)選實(shí)施方案包括光學(xué)系統(tǒng)2-17 和計(jì)算機(jī)18，該計(jì)算機(jī)18控制光學(xué)系統(tǒng)中各個(gè)部的操作，并且還獲取并分析數(shù)據(jù)。熒光相 關(guān)光譜設(shè)備1的光學(xué)系統(tǒng)可以與普通共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)相同。簡言之，首先，照射從 光源2發(fā)射并通過單模光纖3傳播的激光(Ex)，作為從在光纖的出射端以光纖端的NA確定 的角度發(fā)散的光。然后，該光通過平行光管4形成為平行光束，并且在分色鏡5和反光鏡6 和7上反射，以引導(dǎo)到物鏡8中。在物鏡8上方，通常，放置了具有排列于其上的多個(gè)樣品容 器或孔(well) 10的微型板9，其中，每個(gè)容器或孔10中分配一至幾十微升的溶液樣品。在一 個(gè)樣品容器或孔10中的溶液樣品中，從物鏡8發(fā)射的激光聚焦以形成具有強(qiáng)烈光強(qiáng)度的區(qū) 域(激發(fā)區(qū)域)。溶液樣品中的組分(分子)設(shè)置有熒光標(biāo)記，例如熒光染料等，因此，當(dāng)溶 液樣品中的這些組分通過布朗運(yùn)動(dòng)移動(dòng)以進(jìn)入激發(fā)區(qū)域中時(shí)，激發(fā)熒光標(biāo)記，以發(fā)射熒光， 直到這些組分從激發(fā)區(qū)域中移出。然后，所發(fā)射的熒光(Em)通過物鏡8和分色鏡5，在鏡 11上反射，通過聚光透鏡12會(huì)聚，并通過針孔13，以通過阻斷濾片(barrierfilter) 14 (其 中，僅選擇特定波長帶區(qū)域中的光組分)引導(dǎo)到多模光纖15中。在這點(diǎn)上，如本領(lǐng)域的技 術(shù)人員已知，將針孔13放置在物鏡8的聚焦位置的共軛位置(conjugate position)處，從 而，僅從聚焦區(qū)域，即如圖IB示意性示出的物鏡8的激發(fā)區(qū)域發(fā)射的熒光可以到達(dá)光電檢 測器16，并且截?cái)鄟碜猿思ぐl(fā)區(qū)域外的光。將由如圖IB所示的物鏡8的聚焦區(qū)域稱為 “共聚焦體積”，其體積通常為約1毫微微升(fL)。然后，將利用光電檢測器16檢測到的熒光依次改變?yōu)殡娦盘?hào)時(shí)序并通過控制器 17輸入到計(jì)算機(jī)18中。在計(jì)算機(jī)18中，根據(jù)存儲(chǔ)在存儲(chǔ)設(shè)備(未示出)中的程序，通過使 用下列公式來進(jìn)行熒光強(qiáng)度I (t)的自相關(guān)函數(shù)C(T)的計(jì)算

( 2 )(其中，t，τ和η分別是測量時(shí)間、相關(guān)時(shí)間和總項(xiàng)數(shù))，并且進(jìn)行各種分析。在分 析中，原則上，針對熒光的自相關(guān)函數(shù)值擬合下列公式(3)，以確定平移擴(kuò)散時(shí)間τ ，即， 熒光發(fā)射粒子進(jìn)入到共聚焦體積中的平均停留時(shí)間，以及停留在共聚焦體積中的熒光發(fā)射 粒子的平均數(shù)N: 其中，AR是表示該設(shè)備的調(diào)整狀態(tài)的特征值，稱為“結(jié)構(gòu)參數(shù)”，其對應(yīng)于如圖IB 所示的共聚焦體積的縱向長度WZ與半徑WO之比( = wz/wo)。此外，在溶液樣品包含多 種(至少兩種)組分的情況下，通過針對自相關(guān)函數(shù)擬合下列公式來確定各組分的存在比 yi 其中，τ i是各組分的平移擴(kuò)散時(shí)間。在使用如上所述的熒光相關(guān)光譜設(shè)備1來針對任意溶液樣品進(jìn)行測量時(shí)，通常， 在約幾秒到幾十秒內(nèi)進(jìn)行幾次熒光測量，并且對于各測量，通過自相關(guān)函數(shù)的計(jì)算及其擬 合來運(yùn)算出平移擴(kuò)散時(shí)間、平均粒子數(shù)和/或各組分的存在比，然后，采用這些幾次計(jì)算出 的值的平均值作為各最終值。此外，在通過如上所述的熒光相關(guān)光譜法來對任意溶液樣品進(jìn)行測量時(shí)，通常，在 所有熒光測量之前進(jìn)行設(shè)備的調(diào)整狀態(tài)的檢驗(yàn)。具體地，共聚焦體積的尺寸(半徑wo和縱 向長度WZ)依賴于激光的共聚焦?fàn)顟B(tài)或功率(power)、構(gòu)成放置在物鏡8上方的微型板的樣 品容器或孔的底部的蓋玻片的厚度、物鏡的補(bǔ)償環(huán)的設(shè)置狀態(tài)、針孔13的位置和/或大小 等而變化，并且共聚焦體積的尺寸變化影響檢測值，例如自相關(guān)函數(shù)值、平移擴(kuò)散時(shí)間和平 均粒子數(shù)。因此，通常，針對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的溶液進(jìn)行熒光測量和自相關(guān)函數(shù)值的計(jì)算，所述標(biāo) 準(zhǔn)物質(zhì)包括添加到要測試溶液樣品的組分中的熒光標(biāo)記(通常，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可以是熒光染料 分子本身)，并且通過針對所計(jì)算出的自相關(guān)函數(shù)值擬合公式(3)來確定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的結(jié)構(gòu) 參數(shù)AR和平移擴(kuò)散時(shí)間τ 。而且，如果所得到的結(jié)構(gòu)參數(shù)值A(chǔ)R落入預(yù)定范圍內(nèi)，則將設(shè) 備的調(diào)整狀態(tài)判斷為正常，并且在隨后進(jìn)行的測量和分析中使用所獲取的AR(如果設(shè)備的 調(diào)整狀態(tài)是不能接受的，則將重復(fù)該調(diào)整)。另外，當(dāng)進(jìn)行用于確定溶液樣品中所包含的多種組分中各組分的存在比的測量和 分析時(shí)，確定各組分的平移擴(kuò)散時(shí)間τ i(參見圖2Α和圖2Β)。為此，首先，制備僅包含各組 分的對照樣品，并且對于這些對照樣品中的每一種，進(jìn)行熒光測量和自相關(guān)函數(shù)值的計(jì)算。 隨后，通過使用以上所獲取的結(jié)構(gòu)參數(shù)A作為已知量，針對各對照樣品計(jì)算出的自相關(guān)函數(shù)值擬合公式(3)，計(jì)算各組分的平移擴(kuò)散時(shí)間τ 。然后，在針對包含要檢測存在比的組 分的樣品的熒光強(qiáng)度的自相關(guān)函數(shù)值擬合公式(4)時(shí)，使用結(jié)構(gòu)參數(shù)AR和各組分的平移擴(kuò) 散時(shí)間Ti作為已知量(參見圖2C)。在這點(diǎn)上，通常，各自進(jìn)行幾次針對熒光標(biāo)記的溶液和對照樣品的用于確定結(jié)構(gòu) 參數(shù)AR和各組分的平移擴(kuò)散時(shí)間τ i的熒光測量，并且采用由所得到的熒光自相關(guān)函數(shù)值 計(jì)算出的AR的平均值和τ i的平均值作為各最終值。本發(fā)明對熒光相關(guān)光譜法的改講如“發(fā)明內(nèi)容”章節(jié)中所述，在通過如上所述的熒光相關(guān)光譜法對溶液樣品中所包 含的多種組分中各組分的存在比的測量和分析中，在公式(4)的擬合中所使用的結(jié)構(gòu)參數(shù) AR和各組分的平移擴(kuò)散時(shí)間τ i是隨著例如溫度和溶液粘度等測量條件以及設(shè)備的調(diào)整 狀態(tài)(尤其是共聚焦體積的尺寸等)而變化的參數(shù)。因此，在現(xiàn)有技術(shù)中，無論何時(shí)進(jìn)行包 含多種組分的特定樣品的測量和分析，都需要制備標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液和要測試樣品中的各組分 的對照樣品(例如，當(dāng)將如圖IA所示的具有其上排列多個(gè)孔10的微型板9用作樣品容器 時(shí)，將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液和各組分的對照樣品分配給幾個(gè)孔)，并且分別對于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液和各 對照樣品進(jìn)行熒光測量和自相關(guān)函數(shù)的計(jì)算。然而，特別地，對照樣品通常是昂貴和/或稀 有的，并且其制備也是麻煩和/或耗時(shí)的。因此，在本發(fā)明中，如下文所述，改進(jìn)了熒光相關(guān) 光譜法的處理，使得可以盡量減少對對照樣品的熒光測量的次數(shù)。⑴改進(jìn)原理對于某一組分i，將其平移擴(kuò)散時(shí)間τ i定義為τ i = wo2/4Di—(5)其中，Di是組分i的擴(kuò)散常數(shù)。當(dāng)假設(shè)在水溶液中該組分作為具有半徑ri的球 時(shí)，通過下式給出擴(kuò)散常數(shù)Di = kB · Τ/6 π · ri · η (T) — (6)[其中，、是波爾茲曼常數(shù)；T是溶液樣品的絕對溫度；η⑴是作為溫度T的函數(shù) 的溶液樣品的粘度系數(shù)。]因此，通過下式給出平移擴(kuò)散時(shí)間τ i τ i = (3 π /2kB) · wo2 · (η (T) /T) · ri—(7)然后，考慮到進(jìn)行包含多個(gè)組分的溶液樣品的熒光測量，在公式(7)中，wo是共聚 焦體積的尺寸，以及n (τ)/T是在測量時(shí)的環(huán)境條件，因此，這些值對于溶液樣品中的所有 組分而言是通用的。因此，即使當(dāng)共聚焦體積或測量時(shí)的環(huán)境條件變化時(shí)，也能通過下式給 出組分1，2，. . .，i，...的平移擴(kuò)散時(shí)間之比τ τ2 ... Ti ...τ 1 τ 2 . . . τ i . . . = rl r2 . . . ri ... —(8)并且這些比值保持不變。因此，當(dāng)在相同的共聚焦體積并在相同的環(huán)境條件下使 用對應(yīng)的對照樣品來進(jìn)行至少一次測量各組分的平移擴(kuò)散時(shí)間并且存儲(chǔ)各組分的比率時(shí)， 即使共聚焦體積和/或環(huán)境條件在測量期間變化，也可以估計(jì)各組分的平移擴(kuò)散時(shí)間的 值，而不用進(jìn)行各對照樣品的熒光測量和自相關(guān)函數(shù)的計(jì)算。(ii)確認(rèn)原理的實(shí)驗(yàn)在以下實(shí)驗(yàn)中，已確認(rèn)在如上所述的熒光相關(guān)光譜法中溶液樣品中所包含的多種 組分的各組分的平移擴(kuò)散時(shí)間比保持不變。在實(shí)驗(yàn)中，在不同溫度條件下針對以下溶液樣
10品進(jìn)行如上所述的熒光測量只包含熒光染料ATT0633的溶液樣品、只包含具有ATT0633的 肽的溶液樣品(圖2A，右邊)、以及只包含與具有ATT0633的肽結(jié)合的抗體的溶液樣品(圖 2B，右邊)，然后，由對應(yīng)的所測量出的熒光強(qiáng)度的自相關(guān)函數(shù)計(jì)算各組分的平移擴(kuò)散時(shí)間。 結(jié)果如下表 1平移擴(kuò)散時(shí)間(微秒) 根據(jù)以上結(jié)果，可以看出，相同樣品的絕對平移擴(kuò)散時(shí)間值在不同溫度條件下會(huì) 改變。然而，利用各次試驗(yàn)的ATT0633的平移擴(kuò)散時(shí)間的值對所得到的值進(jìn)行歸一化時(shí)， 即，當(dāng)計(jì)算平移擴(kuò)散時(shí)間的比率時(shí)，如表2所示，證實(shí)盡管絕對平移擴(kuò)散時(shí)間值變化，各組 分的平移擴(kuò)散時(shí)間的比仍保持不變。^ 2(相對于AT0633(標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì))的平移擴(kuò)散時(shí)間)平移擴(kuò)散時(shí)間的比 (iii)結(jié)構(gòu)的改講在本實(shí)施方案中，利用盡管測量條件等變化但溶液樣品中所包含的多個(gè)組分的各 組分的平移擴(kuò)散時(shí)間的比仍保持不變的知識(shí)，改進(jìn)了通過熒光相關(guān)光譜法確定溶液樣品中 所包含的各組分的存在比的方法和用于該方法的熒光相關(guān)光譜設(shè)備1的結(jié)構(gòu)、以及控制設(shè) 備1的操作的計(jì)算機(jī)程序的一部分。在確定某一溶液樣品中所包含的多個(gè)組分的各組分的存在比時(shí)，僅當(dāng)未知各組分 的平移擴(kuò)散時(shí)間的比時(shí)，制備各組分的對照樣品，并且針對各組分的對照樣品，進(jìn)行熒光測 量、自相關(guān)函數(shù)的計(jì)算并通過公式(3)的擬合計(jì)算平移擴(kuò)散時(shí)間(在對照樣品的熒光測量 之前，類似于現(xiàn)有技術(shù)，用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的溶液確定結(jié)構(gòu)參數(shù)AR和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的平移擴(kuò)散時(shí)間)。 然后，通過如下利用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的平移擴(kuò)散時(shí)間對所計(jì)算出的各組分的平移擴(kuò)散時(shí)間歸一化，確定各組分的平移擴(kuò)散時(shí)間(相對于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的平移擴(kuò)散時(shí)間)的比Ki
Ki= τ i/ τ 0— (9)( τ 0是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的平移擴(kuò)散時(shí)間)，并且將所得到的比存儲(chǔ)在任意數(shù)據(jù)存儲(chǔ)區(qū) 中。例如，當(dāng)要測試的溶液樣品包含熒光標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0的兩種組分即組分1和組分2時(shí)， 分別對組分1的對照樣品1和組分2的對照樣品2進(jìn)行熒光測量，并且計(jì)算其自相關(guān)函數(shù)， 如圖2Α和圖2Β所示，從而分別確定平移擴(kuò)散時(shí)間τ1、τ2。然后，通過下式確定平移擴(kuò)散 時(shí)間比κ 1和κ 2 Kl= τ 1/ τ O-(IOa)κ 2 = τ 2/τ O--(IOb)并且將所得到的比值存儲(chǔ)在數(shù)據(jù)存儲(chǔ)區(qū)中。在確定溶液樣品中的各組分的存在比時(shí)，制備標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液和要測試的溶液樣 品，并且在當(dāng)前條件下確定結(jié)構(gòu)參數(shù)AR和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的平移擴(kuò)散時(shí)間τ 0后，對溶液樣品進(jìn) 行熒光測量和自相關(guān)函數(shù)的計(jì)算。然后，針對溶液樣品的自相關(guān)函數(shù)擬合包括各組分的平 移擴(kuò)散時(shí)間比Ki與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的平移擴(kuò)散時(shí)間τ0的乘積作為各組分的平移擴(kuò)散時(shí)間的公 式(11)，從而，確定各組分的存在比yi 例如，當(dāng)要測試的溶液樣品包含熒光標(biāo)記有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)O的組分1和組分2時(shí)，僅制 備標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)O的溶液和要測試的溶液樣品，并且進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)O的溶液和要測試的溶液樣 品的熒光測量。然后，針對如圖2C所示獲得的自相關(guān)函數(shù)擬合下列公式(12) 從而，確定組分1的存在比y 1和組分2的存在比y2 = l_yl。就此而論，使用共 聚焦體積中的平均粒子數(shù)N，可以通過下式給出組分1和組分2的各粒子數(shù)m和N2 Nl = N · yl—(13a)N2 = N · y2—(13b)另外，當(dāng)以任意方式確定共聚焦體積Vc時(shí)，將組分1和組分2的濃度分別作為 N · yl/Vc ；N · y2/Vc 給出。為了實(shí)現(xiàn)如上所述的熒光相關(guān)光譜法，計(jì)算機(jī)18配備有存儲(chǔ)了平移擴(kuò)散時(shí)間比 κ i的數(shù)據(jù)存儲(chǔ)區(qū)，以及配備有如下結(jié)構(gòu)用于由針對各組分測量出的熒光強(qiáng)度的自相關(guān) 函數(shù)值確定多種組分中各組分的平移擴(kuò)散時(shí)間，并且計(jì)算并存儲(chǔ)比Ki。另外，在用于計(jì)算 機(jī)18運(yùn)行的計(jì)算機(jī)程序中，安裝了由針對各組分測量出的熒光強(qiáng)度的自相關(guān)函數(shù)值確定多種組分中各組分的平移擴(kuò)散時(shí)間，并計(jì)算和存儲(chǔ)由對照樣品的自相關(guān)函數(shù)計(jì)算出的平移 擴(kuò)散時(shí)間的比K i的程序，以及利用存儲(chǔ)在數(shù)據(jù)存儲(chǔ)區(qū)中的平移擴(kuò)散時(shí)間比K i執(zhí)行上述 公式(11)或(12)的擬合的程序。此外，由于在各種測量條件等下各組分的平移擴(kuò)散時(shí)間比κ i保持不變，所以這 些比可以不是通過相同的熒光相關(guān)光譜設(shè)備1測量出的值。因而，熒光相關(guān)光譜設(shè)備1和 計(jì)算機(jī)程序可以包括能夠使操作者將在設(shè)備1的外部獨(dú)立確定的各組分的平移擴(kuò)散時(shí)間 的比K i輸入到數(shù)據(jù)存儲(chǔ)區(qū)中的部分。要輸入的平移擴(kuò)散時(shí)間比K i的值可以是通過例如 分子動(dòng)力學(xué)等的任意計(jì)算方法確定的值。(iv)防止擬合精度的劣化在如上所述針對由熒光測量獲得的自相關(guān)函數(shù)擬合具有平移擴(kuò)散時(shí)間比κ i的 公式(11)或(12)時(shí)，各組分的平移擴(kuò)散時(shí)間不是實(shí)際測量值，而是估計(jì)值，因此，其中的 擬合精度可能劣化。因而，在本實(shí)施方案中，可以提供用于能夠使操作者檢驗(yàn)公式(11)或 (12)的擬合時(shí)的精度的結(jié)構(gòu)。更具體地，在執(zhí)行公式(11)或(12)的擬合時(shí)，計(jì)算卡方值: 表示實(shí)際的自相關(guān)函數(shù)值與擬合函數(shù)值之差的特征參數(shù)(簡言之，卡方值是實(shí)際自相關(guān)函 數(shù)值與擬合函數(shù)值之差的總和)。然后，如果卡方值大于預(yù)定閾值，則對于操作者，例如通過 在監(jiān)控器上顯示產(chǎn)生指示擬合精度不夠的警告。另外，由于在該設(shè)備中激光的聚光度和光 電檢測器的靈敏度隨著光波長而變化，所以擬合是否成功可取決于激發(fā)波長或檢測到的熒 光波長。所以，優(yōu)選可以對不同的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)設(shè)置對于該卡方值的不同預(yù)定閾值。因此，在上述實(shí)施方案中，考慮以下知識(shí)如上所述，即使測量條件等變化，溶液樣 品中所包含的各組分的平移擴(kuò)散時(shí)間的比也保持不變，因此，在通過熒光相關(guān)光譜法檢測 任意溶液樣品中的各組分的存在比時(shí)，一旦獲取了各組分的平移擴(kuò)散時(shí)間的比，就可以省 略對各組分的對照樣品的熒光測量和自相關(guān)函數(shù)的計(jì)算。該策略能夠節(jié)省對照樣品的消耗 量并顯著縮短對照樣品的測量和分析持續(xù)時(shí)間，從而提供處理量的改進(jìn)(在對分配到排列 在一個(gè)微型板上的多個(gè)孔中的溶液樣品進(jìn)行測量的情況下，將減少分配對照樣品的孔的數(shù) 量)O此外，作為要測試樣品中的組分的平移擴(kuò)散時(shí)間的比，優(yōu)選采用組分的平移擴(kuò)散 時(shí)間與連接于所述組分的熒光染料分子(標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì))的平移擴(kuò)散時(shí)間之比。在這種情況 下，已獲得相對于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)平移擴(kuò)散時(shí)間的比的任意組分的平移擴(kuò)散時(shí)間可以僅通過將該 組分平移擴(kuò)散時(shí)間的比乘以在進(jìn)行包含該組分的樣品的熒光測量時(shí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的平移擴(kuò)散 時(shí)間來確定，因此，在測量包含任意組分的任意組合的溶液樣品時(shí)，有利地，不需要每次都 進(jìn)行各組分的平移擴(kuò)散時(shí)間的檢測。例如，假設(shè)已獲得組分1、組分2和組分3的平移擴(kuò)散 時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的平移擴(kuò)散時(shí)間之比，將確定包含組分1和組分2的組合的溶液樣品、組分 1和組分3的組合的溶液樣品、組分2和組分3的組合的溶液樣品、或組分1、組分2、組分3 的組合的溶液樣品中的各組分的存在比，而不用重復(fù)檢測組分1、組分2和組分3中的各組 分的平移擴(kuò)散時(shí)間。上述本發(fā)明的方法有利地用于確定任何多個(gè)分子的結(jié)合或離解的傾向性以及/ 或者結(jié)合常數(shù)或離解常數(shù)。
權(quán)利要求
一種熒光相關(guān)光譜設(shè)備，其能夠檢測溶液樣品中所包含的具有熒光標(biāo)記的至少兩種組分中各組分的存在比，所述設(shè)備包括數(shù)據(jù)存儲(chǔ)區(qū)，其存儲(chǔ)所述至少兩種組分中各組分的平移擴(kuò)散時(shí)間的比的值；以及檢測部，其使用所存儲(chǔ)的所述至少兩種組分中各組分的平移擴(kuò)散時(shí)間的比的值，由用所述溶液樣品測量出的熒光強(qiáng)度的自相關(guān)函數(shù)值檢測所述至少兩種組分中各組分的存在比。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光相關(guān)光譜設(shè)備，其中，所述至少兩種組分中各組分的平 移擴(kuò)散時(shí)間的比的值是所述至少兩種組分中各組分的平移擴(kuò)散時(shí)間與具有所述熒光標(biāo)記 的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的平移擴(kuò)散時(shí)間之比的值。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光相關(guān)光譜設(shè)備，其中，所述熒光相關(guān)光譜設(shè)備進(jìn)一步包括由針對所述至少兩種組分中各組分測量出的熒光強(qiáng)度的自相關(guān)函數(shù)值，確定所述至少 兩種組分中各組分的平移擴(kuò)散時(shí)間的部；計(jì)算所述至少兩種組分中各組分的平移擴(kuò)散時(shí)間的比的值的部；以及將所述至少兩種組分中各組分的平移擴(kuò)散時(shí)間的比的值存儲(chǔ)在所述數(shù)據(jù)存儲(chǔ)區(qū)中的部。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光相關(guān)光譜設(shè)備，其中，所述熒光相關(guān)光譜設(shè)備進(jìn)一步包 括將所述至少兩種組分中各組分的平移擴(kuò)散時(shí)間的比的預(yù)定值存儲(chǔ)在所述數(shù)據(jù)存儲(chǔ)區(qū)中 的部。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光相關(guān)光譜設(shè)備，其中，所述檢測部通過將用包含所述至 少兩種組分的所述溶液樣品測量出的熒光強(qiáng)度的自相關(guān)函數(shù)值擬合所述自相關(guān)函數(shù)值的 理論公式，由所述用包含所述至少兩種組分的所述溶液樣品測量出的熒光強(qiáng)度的自相關(guān)函 數(shù)值檢測所述至少兩種組分中各組分的存在比，所述理論公式包括所述至少兩種組分中各 組分的平移擴(kuò)散時(shí)間的比的值作為參數(shù)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的熒光相關(guān)光譜設(shè)備，其中，在所述理論公式中，使用通過將具 有所述熒光標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的平移擴(kuò)散時(shí)間乘以所述至少兩種組分中各組分的平移擴(kuò)散 時(shí)間的比的值而獲得的值作為所述至少兩種組分中各組分的平移擴(kuò)散時(shí)間。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的熒光相關(guān)光譜設(shè)備，其中，所述熒光相關(guān)光譜設(shè)備進(jìn)一步包 括在所述擬合中的卡方值大于預(yù)定閾值時(shí)產(chǎn)生所述擬合精度不足的警告的部。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的熒光相關(guān)光譜設(shè)備，其中，針對不同的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可以設(shè)置不 同值作為所述預(yù)定閾值。
9.一種用于通過熒光相關(guān)光譜法檢測溶液樣品中所包含的具有熒光標(biāo)記的至少兩種 組分中各組分的存在比的方法，所述方法包括以下步驟使用存儲(chǔ)在數(shù)據(jù)存儲(chǔ)區(qū)中的所述至少兩種組分中各組分的平移擴(kuò)散時(shí)間的比的值，由 用所述溶液樣品測量出的熒光強(qiáng)度的自相關(guān)函數(shù)值檢測所述至少兩種組分中各組分的存 在比。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述至少兩種組分中各組分的平移擴(kuò)散時(shí)間的 比的值是所述至少兩種組分中各組分的平移擴(kuò)散時(shí)間與具有所述熒光標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的 平移擴(kuò)散時(shí)間之比的值。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述方法進(jìn)一步包括以下步驟由針對所述至少兩種組分中各組分測量出的熒光強(qiáng)度的自相關(guān)函數(shù)值，確定所述至少 兩種組分中各組分的平移擴(kuò)散時(shí)間；計(jì)算所述至少兩種組分中各組分的平移擴(kuò)散時(shí)間的比的值；以及 將所述至少兩種組分中各組分的平移擴(kuò)散時(shí)間的比的值存儲(chǔ)在所述數(shù)據(jù)存儲(chǔ)區(qū)中。
12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述方法進(jìn)一步包括以下步驟將所述至少兩 種組分中各組分的平移擴(kuò)散時(shí)間的比的預(yù)定值存儲(chǔ)在所述數(shù)據(jù)存儲(chǔ)區(qū)中。
13.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中，在檢測所述至少兩種組分中各組分的存在比的 步驟中，通過將用包含所述至少兩種組分的所述溶液樣品測量出的熒光強(qiáng)度的自相關(guān)函數(shù) 值擬合所述自相關(guān)函數(shù)值的理論公式，由所述用包含所述至少兩種組分的所述溶液樣品測 量出的熒光強(qiáng)度的自相關(guān)函數(shù)值檢測所述至少兩種組分中各組分的存在比，所述理論公式 包括所述至少兩種組分中各組分的平移擴(kuò)散時(shí)間的比的值作為參數(shù)。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中，在所述理論公式中，使用通過將具有所述熒光 標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的平移擴(kuò)散時(shí)間乘以所述至少兩種組分中各組分的平移擴(kuò)散時(shí)間的比的 值而獲得的值作為所述至少兩種組分中各組分的平移擴(kuò)散時(shí)間。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種熒光相關(guān)光譜設(shè)備和方法，對于檢測樣品中所包含的共存的各組分的存在比時(shí)通過FCS的測量，所述熒光相關(guān)光譜設(shè)備和方法能夠盡可能減少對照樣品的熒光測量次數(shù)。在本發(fā)明的用于通過FCS檢測溶液樣品中所包含的具有熒光標(biāo)記的各組分的存在比的設(shè)備和方法中，基于在不同測量條件等下各組分的平移擴(kuò)散時(shí)間的比保持不變的知識(shí)，采用各組分的平移擴(kuò)散時(shí)間的比的值。
文檔編號(hào)G01N21/64GK101900605SQ20101018702
公開日2010年12月1日 申請日期2010年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月26日
發(fā)明者山口光城 申請人:奧林巴斯株式會(huì)社