專利名稱：腸道病毒71型抗體(IgM)診斷試劑盒(酶聯(lián)免疫法)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)腸道病毒71型抗體(IgM)的酶聯(lián)免疫測(cè)定試劑盒及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腸道病毒EV71型感染是由人腸道病毒71型(EV71)引起的疾病的總稱，臨床上主要表現(xiàn)為手足口病，手足口病多在嬰幼兒中爆發(fā)流行，部分EV71感染患兒表現(xiàn)為皰疹性咽峽炎，重癥患者出現(xiàn)病毒性腦炎、病毒性腦脊髓膜炎、肺水腫、肺出血等。引起手足口病的病原，最常見的是柯薩奇病毒A16和腸道病毒71型；由腸道病毒71型感染引起的疾病發(fā)生重癥感染的比例較大，病死率也較高，重癥病例病死率可達(dá)10% -25%，因此病原學(xué)診斷意義重大。腸道病毒71型(EV71)基因組為含有大約7. 5Kb的單股正鏈RNA，包括5’端非編碼區(qū)、3’端非編碼區(qū)和由P1、P2、P3所組成的多蛋白，共編碼11種蛋白，其中4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白 VP1、VP2、VP3、VP4，7 個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白 2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D。其中 VP1、VP2、VP3 暴露于病毒外殼的表面，為EV71主要的抗原變異位置；VP4包埋在病毒外殼的內(nèi)側(cè)與內(nèi)部的RNA結(jié)合，其功能類似病毒外殼的錨，用以穩(wěn)定病毒蛋白的結(jié)構(gòu)。非結(jié)構(gòu)蛋白2A為分裂初期先驅(qū)蛋白質(zhì)，也與終止宿主細(xì)胞合成其本身所需蛋白有關(guān)；3C則參與大部分的蛋白裂解反應(yīng)； 3D為RNA聚合酶，在病毒RNA復(fù)制時(shí)主導(dǎo)轉(zhuǎn)錄及復(fù)制反應(yīng)；28、2(、3々、；^等四種蛋白則與病毒RNA的復(fù)制有關(guān)。由于中和抗原表位多集中于VP1，故VPl是EV71病毒的主要中和決定因子，因此VPl蛋白被認(rèn)為是最適合來建立ELISA方法的抗原。腸道病毒EV71的臨床診斷主要依據(jù)三個(gè)方面一是臨床表現(xiàn)，二是血清學(xué)證據(jù)， 三是病原學(xué)證據(jù)。由于腸道病毒EV71型感染臨床表現(xiàn)多，因此腸道病毒EV71的血清學(xué)檢測(cè)和病原學(xué)檢測(cè)是目前最主要的依據(jù)。EV71感染產(chǎn)生終生免疫保護(hù)，感染后可檢出IgM和 IgG抗體。IgM試劑是最適于臨床近期感染診斷的重要指標(biāo)。EV71-IgM抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，是一種科學(xué)、方便、經(jīng)濟(jì)的EV-71感染的血清學(xué)檢測(cè)方法。腸道病毒71型抗體(IgM)的檢測(cè)已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，基本上是以腸道病毒71型的病毒培養(yǎng)物為抗原作為包被抗原的間接ELISA，試劑盒在特異性、靈敏度和穩(wěn)定性方面尚存諸多不足之處；并且，由于病毒培養(yǎng)成本高，效率低，無法大量供應(yīng)市場(chǎng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于克服上述不足，提供一種臨床檢驗(yàn)急需、操作簡(jiǎn)便、 適合各醫(yī)療疾控部門使用的可檢測(cè)人血清或血漿中腸道病毒71型抗體(IgM)的酶聯(lián)免疫測(cè)定試劑盒及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種腸道病毒71型抗體(IgM)的酶聯(lián)免疫測(cè)定試劑盒，其組分包括抗人-IgM(y鏈)單克隆抗體預(yù)包被的微孔板、辣根過氧化物酶標(biāo)記的重組腸道病毒 71型抗原、陽性對(duì)照、陰性對(duì)照、標(biāo)本稀釋液、濃縮洗滌液(20X)、底物液A、底物液B和終止液。本發(fā)明的技術(shù)方案是首先將血清樣本加入到微孔板中，樣本中的IgM抗體被預(yù)包被在微孔板上的抗人-IgM(y鏈)單克隆抗體吸附(捕獲)，未結(jié)合的其他成分(包括特異的IgG抗體)將被洗滌除去，第二步，加入腸道病毒71型抗原酶標(biāo)記物，被捕獲的IgM中的EV71-IgM會(huì)與蠟根過氧化物酶標(biāo)記的EV71重組抗原特異性的結(jié)合，洗去其他未結(jié)合物， 辣根過氧化物酶會(huì)和后續(xù)加入的底物反應(yīng)。最終達(dá)到檢測(cè)EV71-IgM抗體的目的。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供了一種腸道病毒71型抗體(IgM)的酶聯(lián)免疫測(cè)定試劑盒的制備方法，該方法包括下列步驟1.抗人-IgM(y鏈)單克隆抗體預(yù)包被微孔板的制備1.1 包被0.05mol/L(0.05毫摩爾/升)，pH9. 6碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖系統(tǒng)，加入適量抗人_IgM(u鏈)單克隆抗體，混勻后按每孔IOOul (微升)加入到微孔板中，37°C放置2小時(shí)， 室溫過夜，然后甩去孔內(nèi)液體，拍干；1.2 洗滌0. 01mol/L PBS-T (0. 01毫摩爾/升磷酸氫鈉-磷酸二氫鈉緩沖系統(tǒng)，0. 05 %的 Tween-20), pH7. 2，按每孔加入150ul的量加入到微孔板中，然后甩去，重復(fù)洗滌一次，拍干。1.3 封閉0. 01mol/L PBS，10 %小牛血清，0. 25 %酪蛋白，0. 1 %硫柳汞鈉，pH7.2，按每孔力口入IlOul的量加入到微孔板中，37°C放置2小時(shí)，然后甩去孔內(nèi)液體，拍干；1.4 干燥封閉后的微孔板，甩去孔內(nèi)液體拍干后，放置于干燥室(相對(duì)濕度小于45% )過夜，然后放入有干燥劑的鋁箔袋中封口，保存于2 8°C環(huán)境。2.酶標(biāo)抗原工作液的制備0. 01mol/L PBS，10 % 小牛血清，0. 25 % 酪蛋白，l/1000Proclin300，pH 7. 2 的 buffer中加入適量辣根過氧化物酶標(biāo)記的重組腸道病毒71型VPl抗原，保存于2 8°C環(huán)
^Ml O3.陽性對(duì)照的制備取A45tl值彡2. 0的抗EV71_IgM陽性多份人血清混勻，用56°C水浴鍋加熱120分鐘，用0. 01mol/L PBS, 20% BSA, pH 7. 2的buffer調(diào)整到A450值> 1.0，加入萬分之五的硫柳汞鈉，保存于2 8°C環(huán)境。4.陰性對(duì)照的制備取A450值< 0. 1的抗EV71_IgM陰性多份人血清混勻，用56°C水浴鍋加熱120分鐘，自然冷卻后，加入萬分之五的硫柳汞鈉，保存于2 8°C環(huán)境。5.底物液ANa2HPO4. 12H20 18g檸檬酸·H205g乙酸鈉9. 25g乙酸1. 2ml
Na2O25g 去離子水 IOOOml，pH5. 06.底物液B先用5mlDMS0 (二甲亞砜)溶解0. 25g TMB (3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺)；取IOOOml 去離子水加入約Iml濃鹽酸，混勻后pH2. 5，將TMB溶液加入到鹽酸溶液中混勻。7.終止液濃硫酸IOOml去離子水800ml8. 20X濃縮洗滌液Na2HPO4. 12H2058gNaH2PO48gNaCL160gTween-2010. Oml去離子水1000ml，調(diào)整pH7. 2本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供了一種人血清中腸道病毒71型抗體(IgM)測(cè)定方法， 本發(fā)明的試劑盒在使用時(shí)可以按下列步驟操作1.取出試劑盒置室溫平衡30分鐘。將20X洗滌液用蒸餾水做20倍稀釋。2.加樣品取出包被板，作好標(biāo)記，留1孔空白對(duì)照，其余加入陰性對(duì)照3孔陽性對(duì)照2孔50ul/孔及待測(cè)標(biāo)本50ul/孔于相應(yīng)的反應(yīng)板孔內(nèi)，空白對(duì)照不加。將反應(yīng)板輕輕震蕩混勻后，用封板膜封板，置37°C溫箱或水浴中反應(yīng)30分鐘。3.洗板溫育后，將封板膜揭掉，吸干孔內(nèi)液體，用洗滌液洗板5次，每次浸泡30 秒鐘。4.加酶標(biāo)工作液每孔加入50ul酶標(biāo)工作液，空白孔除外。5.溫育用封板膜封板后，置37°C溫箱或水浴中反應(yīng)30分鐘。6.洗板溫育后，將封板膜揭掉，吸干孔內(nèi)液體，用洗滌液洗板5次，每次浸泡30 秒鐘。7.顯色每孔加入底物A、B液各50ul，震蕩混勻，用封板膜封板后，置37°C溫箱或水浴中反應(yīng)15分鐘8.終止每孔加入終止液50ul，輕輕震蕩混勻。9.測(cè)定設(shè)定酶標(biāo)儀波長(zhǎng)于450nm(建議雙波長(zhǎng)450/630nm檢測(cè))，測(cè)定各孔A450 值。注意在終止反應(yīng)30分鐘內(nèi)讀數(shù)。當(dāng)使用單波長(zhǎng)時(shí)，校準(zhǔn)空白孔，設(shè)定酶標(biāo)儀波長(zhǎng)于 450nm，測(cè)定各孔A450值，當(dāng)使用雙波長(zhǎng)450/630nm檢測(cè)時(shí)，可以不設(shè)空白孔，直接測(cè)定各孔 A值。本發(fā)明具有如下特點(diǎn)1.采用捕獲兩步法進(jìn)行檢測(cè)，血清不用二次稀釋簡(jiǎn)化了操作過程，避免了間接法中的多種干擾因素，是檢測(cè)的靈敏度和特異性得到提高。2.操作方法簡(jiǎn)單，實(shí)用性強(qiáng)，適合各級(jí)醫(yī)療單位和疾控中心使用。
具體實(shí)施例方式
實(shí)例1?？谷?IgM(u鏈)單克隆抗體預(yù)包被微孔板的制備1. 1 包被Na2CO3 1. 6gNaHCO3 2. 9g去離子水1000ml，調(diào)整PH9. 6，加入適量抗人-IgM (μ鏈)單克隆抗體，混勻后按每孔IOOul (微升) 加入到微孔板中，37°C放置2小時(shí)，室溫過夜，然后甩去孔內(nèi)液體，拍干；1. 2 洗滌Na2HPO4. 12H20NaH2PO4NaCLTween-20
3. 72g 0. 4g 6. 8g 0. 5ml干。
去離子水1000ml，
調(diào)整pH7. 2按每孔加入150ul的量加入到微孔板中，然后甩去，重復(fù)洗滌-
-次，拍
1.3封閉
Na2HPO4 NaH2PO4 NaCL 牛血清去離子水硫柳汞鈉
12H20
3. 72g 0. 4g 6. 8g 100. Oml 1000ml,
Ig
調(diào)整pH7. 2，按每孔加入IlOul的量加入到微孔板中，37°C放置2小時(shí)，然后甩去孔內(nèi)液體，拍干；1. 4 干燥封閉后的微孔板，甩去孔內(nèi)液體拍干后，放置于干燥室(相對(duì)濕度小于45% )過夜，然后放入有干燥劑的鋁箔袋中封口，保存于2 8°C環(huán)境。

于2
實(shí)例2.酶標(biāo)抗原工作液的制備
12H20
3. 72g 0. 4g 6. 8g 100. Oml 2. 5g IOOml Iml
900ml,
調(diào)整pH 7. 2，加入適量辣根過氧化物酶標(biāo)記的重組腸道病; 8°C環(huán)境。 實(shí)例3.陽性對(duì)照的制備
Na2HPO4 NaH2PO4 NaCL 牛血清酪蛋白小牛血清 Proclin300 去離子水
71型VPl抗原，保存
7
取A45tl值彡2. 0的抗EV71_IgM陽性多份人血清混勻，用56°C水浴鍋加熱120分鐘，自然冷卻后，用0. 01mol/L PBS, 20% BSA，pH 7. 2的buffer調(diào)整到A450值> 1. 0，加入萬分之五的硫柳汞鈉，保存于2 8°C環(huán)境。
0091]實(shí)例4.陰性對(duì)照的制備
0092]取A450值< 0. 1的抗EV71_IgM陰性多份人血清混勻，用56°C水浴鍋加熱120分鐘，自然冷卻后，加入萬分之五的硫柳汞鈉，保存于2 8°C環(huán)境。
0093]實(shí)例5.底物液A0094]Na2HPO412H2018g0095]檸檬酸.H205g0096]乙酸鈉9. 25g0097]乙酸1. 2ml0098]Na2O25g0099]去離子水1000ml,pH5.00100]實(shí)例6.底物液B0101]先用 5mlDMS0 ( 二甲亞砜)溶解0.2
去離子水加入約Iml濃鹽酸，混勻后pH2. 5，將TMB溶液加入到鹽酸溶液中混勻。
0102]實(shí)例7.終止液
0103]^c H2SO4IOOml
0104]去離子水800ml
0105]實(shí)例8. 20X濃縮洗滌液
0106]Na2HPO4. 12H20 58g
0107]NaH2PO44g
0108]NaCL160g
0109]Tween-2010.0ml
0110]去離子水1000ml，調(diào)整pH7. 2
0111]實(shí)例9.
0112]9. 1用本發(fā)明的試劑盒與衛(wèi)生部醫(yī)藥生物工程技術(shù)研究中心和中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司研制生產(chǎn)的腸道病毒EV71逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒在寧波市疾病預(yù)防控制中心和河北省疾病預(yù)防控制中心平行檢測(cè)臨床血清650例(其中健康人員血清450 例，EV71急性期陽性血清192例，A16陽性血清18例)，具體結(jié)果如下表1貝爾公司生產(chǎn)的EV71_IgM試劑和PCR試劑的比較
實(shí)驗(yàn)分組例數(shù)北京貝爾達(dá)安基因PCR試劑陽性陰性陽性陰性EV71急性期陽性血清19219201920CA16陽性血清18018018正常人群45004500450
9. 2用本發(fā)明的試劑盒與病毒病預(yù)防控制所國家麻疹實(shí)驗(yàn)室研制的腸道病毒 EV71中和試驗(yàn)試劑平行檢測(cè)臨床血清400例(其中健康人員血清50例，EV71急性期陽性血清230例，A16陽性血清20例)，表2貝爾公司生產(chǎn)的EV71_IgM試劑和中和試劑的比較
權(quán)利要求
1.一種腸道病毒71型抗體(IgM)的酶聯(lián)免疫測(cè)定試劑盒，其特征在于該試劑盒包括抗人-IgM(y鏈)單克隆抗體預(yù)包被的微孔板、辣根過氧化物酶標(biāo)記的重組腸道病毒71型抗原、陽性對(duì)照血清、陰性對(duì)照血清、濃縮洗滌液(20 X )、底物液A、底物液B和終止液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種腸道病毒71型抗體(IgM)的酶聯(lián)免疫測(cè)定試劑盒的制備方法，其特征在于該方法包括下列步驟2.1.抗人_IgM(y鏈)單克隆抗體預(yù)包被微孔板的制備2. 1. 1包被0. 05mol/L(0. 05毫摩爾/升)，pH9. 6碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖系統(tǒng)，加入適量抗人-IgM(y鏈)單克隆抗體，混勻后按每孔IOOul (微升)加入到微孔板中，37°C放置2小時(shí)，室溫過夜，然后甩去孔內(nèi)液體，拍干；2. 1. 2洗滌0. 01mol/L PBS-T (0.01毫摩爾/升磷酸氫鈉-磷酸二氫鈉緩沖系統(tǒng)，0. 05 %的 Tween-20), pH7. 2，按每孔加入150ul的量加入到微孔板中，然后甩去，重復(fù)洗滌一次，拍干。2. 1. 3封閉0. 01mol/L PBS，10%小牛血清，0. 25%酪蛋白，0. 硫柳汞鈉，pH7. 2，按每孔加入 IlOul的量加入到微孔板中，37°C放置2小時(shí)，然后甩去孔內(nèi)液體，拍干；2. 1. 4干燥封閉后的微孔板，甩去孔內(nèi)液體拍干后，放置于干燥室(相對(duì)濕度小于45%)過夜，然后放入有干燥劑的鋁箔袋中封口，保存于2 8°C環(huán)境。2. 2.酶標(biāo)抗原工作液的制備0. 01mol/L PBS，10%小牛血清，0. 25%酪蛋白，1/1000 Proclin300, pH 7. 2 的 buffer 中加入適量辣根過氧化物酶標(biāo)記的重組腸道病毒71型VPl抗原，保存于2 8°C環(huán)境。2.3.陽性對(duì)照的制備取A45tl值彡2. 0的抗EV71-IgM陽性多份人血清混勻，用56°C水浴鍋加熱120分鐘，用 0. 01mol/L PBS, 20% BSA，pH 7. 2的buffer調(diào)整到A450值> 1. 0，加入萬分之五的硫柳汞鈉，保存于2 8°C環(huán)境。2.4.陰性對(duì)照的制備取A450值< 0. 1的抗EV71-IgM陰性多份人血清混勻，用56°C水浴鍋加熱120分鐘，自然冷卻后，加入萬分之五的硫柳汞鈉，保存于2 8°C環(huán)境。2. 5.底物液A18g 5g9. 25g 1. 2ml 5g1000ml,pH5.012H20 ,H20Na2HPO4. 檸檬酸乙酸鈉乙酸 Na2O2 去離子水 2. 6.底物液B 先用 5mlDMS0 (.甲亞砜)溶解0. 25g TMB (3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺)；取1000ml去離子水加入約Iml濃鹽酸，混勻后pH2. 5，將TMB溶液加入到鹽酸溶液中混勻。 2. 7.終止液濃硫酸IOOml去離子水800ml2.8. 20X濃縮洗滌液 Na2HPO4. 12H2058g NaH2PO4 8g NaCL 160g Tween-20 10. Oml去離子水1000ml，調(diào)整pH7. 2
3.—種人血清中腸道病毒71型抗體(IgM)測(cè)定方法，其特征在于該方法包括下列步驟操作3. 1.取出試劑盒置室溫平衡30分鐘。將20X洗滌液用蒸餾水做20倍稀釋。 3. 2.加樣品取出包被板，作好標(biāo)記，留1孔空白對(duì)照，其余加入陰性對(duì)照3孔陽性對(duì)照2孔50ul/孔及待測(cè)標(biāo)本50ul/孔于相應(yīng)的反應(yīng)板孔內(nèi)，空白對(duì)照不加。將反應(yīng)板輕輕震蕩混勻后，用封板膜封板，置37°C溫箱或水浴中反應(yīng)30分鐘。3. 3.洗板溫育后，將封板膜揭掉，吸干孔內(nèi)液體，用洗滌液洗板5次，每次浸泡30秒鐘。3. 4.加酶標(biāo)工作液每孔加入50ul酶標(biāo)工作液，空白孔除外。3. 5.溫育用封板膜封板后，置37°C溫箱或水浴中反應(yīng)30分鐘。3. 6.洗板溫育后，將封板膜揭掉，吸干孔內(nèi)液體，用洗滌液洗板5次，每次浸泡30秒鐘。3. 7.顯色每孔加入底物A、B液各50ul，震蕩混勻，用封板膜封板后，置37°C溫箱或水浴中反應(yīng)15分鐘3. 8.終止每孔加入終止液50ul，輕輕震蕩混勻。3. 9.測(cè)定設(shè)定酶標(biāo)儀波長(zhǎng)于450nm (建議雙波長(zhǎng)450/630nm檢測(cè))，測(cè)定各孔A450值。 注意在終止反應(yīng)30分鐘內(nèi)讀數(shù)。當(dāng)使用單波長(zhǎng)時(shí)，校準(zhǔn)空白孔，設(shè)定酶標(biāo)儀波長(zhǎng)于450nm， 測(cè)定各孔A450值，當(dāng)使用雙波長(zhǎng)450/630nm檢測(cè)時(shí)，可以不設(shè)空白孔，直接測(cè)定各孔A值。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)腸道病毒71型抗體(IgM)的酶聯(lián)免疫診斷試劑盒及其制備方法和應(yīng)用。由腸道病毒71型引起手足口病，發(fā)生重癥感染的比例較大(病毒性腦炎、病毒性腦脊髓膜炎、肺水腫)，病死率也較高可達(dá)10％-25％，EV71-IgM抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑盒，可用于EV71感染的診斷。EV71-IgM檢測(cè)已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，多是EV71病毒培養(yǎng)物作為包被抗原的間接ELISA，特異性、靈敏度和穩(wěn)定性方面尚存諸多不足；由于病毒培養(yǎng)成本高，效率低，無法大量供應(yīng)市場(chǎng)。本發(fā)明克服上述不足，提供一種臨床檢驗(yàn)急需、操作簡(jiǎn)便、適合各醫(yī)療疾控部門使用的檢測(cè)人血清中EV71-IgM的試劑盒及其制備方法和應(yīng)用。技術(shù)方案是首先將血清加入到微孔板中，其中的IgM抗體被預(yù)包被在微孔板上的抗μ鏈捕獲，未結(jié)合的其他成分被洗滌除去，第二步，加入酶標(biāo)記物，被捕獲的IgM中的EV71-IgM會(huì)與HRP標(biāo)記的EV71重組抗原特異性的結(jié)合，洗滌后，HRP會(huì)和后續(xù)加入的底物反應(yīng)。最終達(dá)到檢測(cè)EV71-IgM抗體的目的。
文檔編號(hào)G01N33/577GK102243232SQ20101017186
公開日2011年11月16日 申請(qǐng)日期2010年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月14日
發(fā)明者常延濱, 邵育曉 申請(qǐng)人:北京貝爾生物工程有限公司