專利名稱：：一種檢測(cè)棗酊中酸棗仁皂苷和當(dāng)藥黃酮素含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種檢測(cè)棗酊中酸棗仁皂苷和當(dāng)藥黃酮素含量的方法，屬于痕量分析
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：紅棗是一種營(yíng)養(yǎng)豐富的果實(shí)，其中含有多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，比如皂苷類，黃酮類，生物堿類，糖類，氨基酸類。棗仁中可以分離得到酸棗仁皂苷A和B;紅棗的種子中還能提取出黃酮C-葡萄糖甙(即當(dāng)藥黃酮素或當(dāng)藥黃素)，當(dāng)藥黃酮素和酸棗仁皂苷都是具有提高免疫等保健功效的活性物質(zhì)。棗酊是常見(jiàn)的煙用香精香料，在煙草制品的加香、矯味中經(jīng)常使用。當(dāng)前隨著煙用香精香料品質(zhì)控制日益收到關(guān)注，香原料的主要成分及特有成分，尤其是具有這些具有免疫保健功效的成分的分析檢測(cè)也成為熱點(diǎn)。目前針對(duì)酸棗仁皂苷A和B常用的是高效液相色譜結(jié)合二極管陣列檢測(cè)器(DAD檢測(cè)器)的檢測(cè)方法，但是經(jīng)過(guò)對(duì)比酸棗仁皂苷A和B在DAD檢測(cè)器上的相應(yīng)強(qiáng)度并不理想，從而影響檢測(cè)精準(zhǔn)度。而且同時(shí)檢測(cè)酸棗仁皂苷及當(dāng)藥黃酮素的方法未見(jiàn)報(bào)導(dǎo)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)準(zhǔn)確度且能夠同時(shí)檢測(cè)棗酊中酸棗仁皂苷和當(dāng)藥黃酮素含量的方法。為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是一種檢測(cè)棗酊中酸棗仁皂苷和當(dāng)藥黃酮素含量的方法，其是以乙腈與0.1%甲酸水溶液的混合液為流動(dòng)相，采用高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)，其中高效液相色譜所采用的檢測(cè)器為蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)。所述流動(dòng)相中乙腈與0.1%甲酸水溶液的體積比為60:4(T75:25。本發(fā)明的檢測(cè)方法具體步驟如下1)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線制定在0.014-0.19mg/ml范圍內(nèi)用流動(dòng)相配制含有當(dāng)藥黃酮素、酸棗仁皂苷A和酸棗仁皂苷B的三種標(biāo)準(zhǔn)品的至少三個(gè)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，再利用高效液相色譜儀分別對(duì)上述所有濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中的三種標(biāo)準(zhǔn)品的含量進(jìn)行檢測(cè)，并根據(jù)三種標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積和相應(yīng)的濃度分別繪制三種標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線并計(jì)算得到其回歸方程；2)樣品的預(yù)處理稱取棗酊樣品于加入流動(dòng)相，經(jīng)過(guò)超聲萃取后離心處理，取上層清液，過(guò)濾得到樣品溶液；再利用高效液相色譜儀采用與步驟1)相同的條件分別對(duì)樣品溶液進(jìn)行檢測(cè)，并根據(jù)得到的峰面積分別帶入標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的回歸方程中，計(jì)算出樣品中的當(dāng)藥黃酮素、酸棗仁皂苷A和酸棗仁皂苷B的含量；步驟1)、2)中的高效液相色譜條件為色譜柱C18(4.6X150mm)；流速0.8ml/min；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器條件漂移管溫度79、1.5°C；氣流量-.2.(T2.2L/min。所述混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中當(dāng)藥黃酮素的濃度范圍為0.038-0.19mg/ml，酸棗仁皂苷A的濃度范圍為0.01-0.lmg/ml，酸棗仁皂苷B的濃度范圍為0.014-0.14mg/ml。本發(fā)明的檢測(cè)棗酊中酸棗仁皂苷和當(dāng)藥黃酮素含量的方法，乙腈和甲酸水溶液可以同時(shí)作為流動(dòng)相和樣品的萃取劑，使樣品的前處理較為簡(jiǎn)單，而且高效液相色譜的檢測(cè)器采用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)，被測(cè)目標(biāo)物在該檢測(cè)器上的信號(hào)較強(qiáng)，有較好的匹配性，而且形成了較好的函數(shù)對(duì)應(yīng)關(guān)系，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確度。另外，本發(fā)明通過(guò)優(yōu)化流動(dòng)相中有機(jī)相比例，及ELSD漂移管的溫度和載氣流量，提高了被測(cè)目標(biāo)物在色譜柱上的分離度，減少了色譜基線噪音，獲得了將為明顯的色譜峰，提高了檢測(cè)準(zhǔn)確度。圖1為混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖；圖2為當(dāng)藥黃酮素的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線圖；圖3為酸棗仁皂苷A的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線圖；圖4為酸棗仁皂苷B的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線圖；圖5為當(dāng)藥黃酮素的標(biāo)準(zhǔn)雙對(duì)數(shù)曲線圖；圖6為酸棗仁皂苷A的標(biāo)準(zhǔn)雙對(duì)數(shù)曲線圖；圖7為酸棗仁皂苷B的標(biāo)準(zhǔn)雙對(duì)數(shù)曲線圖；圖8為對(duì)比實(shí)驗(yàn)示意圖。具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的方法做詳細(xì)的介紹本發(fā)明的檢測(cè)棗酊中酸棗仁皂苷和當(dāng)藥黃酮素含量的方法具體包括如下步驟高效液相色譜條件色譜柱YMC-0DS-AC18(4.6X150mm,5um)；流動(dòng)相乙腈-0.甲酸水溶液=6040；流速0.8ml/min；進(jìn)樣量:5u1；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器條件漂移管溫度81.5°C；氣流量2.2L/min。1)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的制定分別準(zhǔn)確稱取當(dāng)藥黃酮素、酸棗仁皂苷A和酸棗仁皂苷B標(biāo)準(zhǔn)品4.8mg、2.5mg、3.5mg于同一25ml容量瓶中，用流動(dòng)相溶解稀釋并定容至刻度線，得到三種標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)溶液儲(chǔ)備液，采用該儲(chǔ)備液用流動(dòng)相稀釋配制系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使得當(dāng)藥黃酮素、酸棗仁皂苷A和酸棗仁皂苷B的濃度范圍分別是0.038—0.19mg/ml，0.01—0.lmg/ml，0.014—0.14mg/ml，對(duì)此系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)，具體混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及相應(yīng)檢測(cè)的峰面積如表1和圖1所示圖1中峰1和峰2為當(dāng)藥黃酮素的色譜峰，峰3和峰4分別為酸棗仁皂苷A和酸棗仁皂苷B的色譜峰，圖1中的色譜峰明顯且銳利，基線平穩(wěn)且無(wú)噪音，說(shuō)明本發(fā)明采用的ELSD檢測(cè)器在優(yōu)化條件后產(chǎn)生了較好的分析效果。表1標(biāo)準(zhǔn)混合溶液的濃度及相應(yīng)檢測(cè)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>根據(jù)表1中的濃度及相應(yīng)峰面積數(shù)據(jù)作圖，其中當(dāng)藥黃酮素同時(shí)出峰1和峰2，工作曲線根據(jù)兩個(gè)峰面積之和進(jìn)行計(jì)算。具體的計(jì)算結(jié)果如圖2-4及表2所示。表2標(biāo)準(zhǔn)工作曲線參數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>當(dāng)藥黃酮素、酸棗仁皂苷A和B在各自濃度范圍內(nèi)，濃度/峰面積呈現(xiàn)冪指數(shù)函數(shù)關(guān)系，如圖2、3、4所示。對(duì)酸棗仁皂苷A和B標(biāo)準(zhǔn)品各濃度和峰面積分別取自然對(duì)數(shù)，然后作圖，如圖5、6、7所示，酸棗仁皂苷A和B在ELSD檢測(cè)器上的信號(hào)與標(biāo)準(zhǔn)品濃度之間符合雙對(duì)數(shù)線性關(guān)系，被測(cè)目標(biāo)物與ELSD檢測(cè)器具有較好的匹配性。2)樣品的檢測(cè)取棗酊樣品0.1克左右置于具塞三角瓶中，移取40ml流動(dòng)相至三角瓶中，置于超聲輔助萃取器中超聲萃取30分鐘以上，取溶液10ml至離心管中于4000rpm離心10分鐘，取上層清液，經(jīng)0.45ym針式濾頭過(guò)濾，得到樣品溶液。將樣品溶液采用步驟1)相同條件的高效液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)，將得到的當(dāng)藥黃酮素、酸棗仁皂苷A和酸棗仁皂苷B的色譜峰分別帶入相應(yīng)的回歸方程中，得到樣品溶液中當(dāng)藥黃酮素、酸棗仁皂苷A和酸棗仁皂苷B的濃度，從而計(jì)算出樣品中當(dāng)藥黃酮素、酸棗仁皂苷A和酸棗仁皂苷B的含量。本發(fā)明的檢測(cè)效果1、檢測(cè)限及定量限取各標(biāo)準(zhǔn)品工作曲線最低濃度重復(fù)檢測(cè)，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。分別以3倍和10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差作為檢測(cè)限和定量限。具體數(shù)據(jù)如表3所示。表3檢測(cè)限及定量限<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>2、精密度及加標(biāo)回收率取已知濃度棗酊樣品，按照不同水平分別添加三種標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定方法加標(biāo)回收率。加標(biāo)水平和實(shí)際檢測(cè)的結(jié)果如表4所示。表4加標(biāo)水平和加標(biāo)回收率<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>3、對(duì)比實(shí)驗(yàn)本發(fā)明以酸棗仁皂苷A為例，以相同的條件分別采用ELSD檢測(cè)器和DAD檢測(cè)器進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果如圖8所示，ELSD所獲得的色譜圖中4分鐘左右有峰型良好的色譜峰出現(xiàn)，而相同保留時(shí)間在DAD檢測(cè)器獲得的色譜圖中卻沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有效的色譜峰。可見(jiàn)，對(duì)于被測(cè)目標(biāo)物酸棗仁皂苷A，ELSD是比DAD更適用的檢測(cè)器，而且DAD必須要求被測(cè)目標(biāo)物在紫外可見(jiàn)光波段有吸收才適用，使用條件較為苛刻。4、對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)采用具體實(shí)施方式所描述的方法，對(duì)某公司棗酊樣品進(jìn)行了檢測(cè)，檢測(cè)出當(dāng)藥黃酮素、酸棗仁皂苷A和B的含量如表5所示。表5實(shí)際樣品的檢測(cè)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>權(quán)利要求一種檢測(cè)棗酊中酸棗仁皂苷和當(dāng)藥黃酮素含量的方法，其特征在于以乙腈與0.1%甲酸水溶液的混合液為流動(dòng)相，采用高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)，其中高效液相色譜所采用的檢測(cè)器為蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)棗酊中酸棗仁皂苷和當(dāng)藥黃酮素含量的方法，其特征在于所述流動(dòng)相中乙腈與0.1%甲酸水溶液的體積比為6040-75:25。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的檢測(cè)棗酊中酸棗仁皂苷和當(dāng)藥黃酮素含量的方法，其特征在于具體步驟如下1)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線制定在0.014-0.19mg/ml范圍內(nèi)用流動(dòng)相配制含有當(dāng)藥黃酮素、酸棗仁皂苷A和酸棗仁皂苷B的三種標(biāo)準(zhǔn)品的至少三個(gè)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，再利用高效液相色譜儀分別對(duì)上述所有濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中的三種標(biāo)準(zhǔn)品的含量進(jìn)行檢測(cè)，并根據(jù)三種標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積和相應(yīng)的濃度分別繪制三種標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線并計(jì)算得到其回歸方程；2)樣品的預(yù)處理稱取棗酊樣品于加入流動(dòng)相，經(jīng)過(guò)超聲萃取后離心處理，取上層清液，過(guò)濾得到樣品溶液；再利用高效液相色譜儀采用與步驟1)相同的條件分別對(duì)樣品溶液進(jìn)行檢測(cè)，并根據(jù)得到的峰面積分別帶入標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的回歸方程中，計(jì)算出樣品中的當(dāng)藥黃酮素、酸棗仁皂苷A和酸棗仁皂苷B的含量；步驟1)、2)中的高效液相色譜條件為色譜柱C18(4.6X150mm)；流速0.8ml/min；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器條件漂移管溫度79-81.5°C；載氣為氮?dú)猓瑲饬髁?.0-2.2L/min。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)棗酊中酸棗仁皂苷和當(dāng)藥黃酮素含量的方法，其特征在于所述混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中當(dāng)藥黃酮素的濃度范圍為0.038-0.19mg/ml，酸棗仁皂苷A的濃度范圍為0.01-0.lmg/ml，酸棗仁皂苷B的濃度范圍為0.014-0.14mg/ml。全文摘要本發(fā)明公開了一種檢測(cè)棗酊中酸棗仁皂苷和當(dāng)藥黃酮素含量的方法，其特征在于以乙腈與0.1%甲酸水溶液的混合液為流動(dòng)相，采用高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)，其中高效液相色譜所采用的檢測(cè)器為蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)。本發(fā)明的檢測(cè)棗酊中酸棗仁皂苷和當(dāng)藥黃酮素含量的方法，乙腈和甲酸水溶液可以同時(shí)作為流動(dòng)相和樣品的萃取劑，使樣品的前處理較為簡(jiǎn)單，而且高效液相色譜的檢測(cè)器采用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)，被測(cè)目標(biāo)物在該檢測(cè)器上的信號(hào)較強(qiáng)，有較好的匹配性，而且形成了較好的函數(shù)對(duì)應(yīng)關(guān)系，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確度。文檔編號(hào)G01N30/06GK101806785SQ201010158560公開日2010年8月18日申請(qǐng)日期2010年4月28日優(yōu)先權(quán)日2010年4月28日發(fā)明者劉惠民,張曉兵,王昇,王洪波,胡斌,蔡君蘭,謝復(fù)煒,郭軍偉,郭吉兆申請(qǐng)人:中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院