專利名稱：：一種改進(jìn)的標(biāo)記免疫測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域的一種標(biāo)記免疫實(shí)驗(yàn)方法，具體是指一種改進(jìn)的標(biāo)記免疫測定方法。
背景技術(shù)：
：免疫血清學(xué)技術(shù)是一類在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)診斷，研究及其相關(guān)制品生產(chǎn)中應(yīng)用最為廣泛的實(shí)驗(yàn)方法之一。標(biāo)記免疫學(xué)創(chuàng)建于上世紀(jì)六十年代中后期，他的出現(xiàn)使多數(shù)原有免疫實(shí)驗(yàn)方法退出生物學(xué)應(yīng)用，而部分新的或能與標(biāo)記技術(shù)銜接的原有試驗(yàn)方法則集合為一個新興的實(shí)驗(yàn)
技術(shù)領(lǐng)域：
而得到迅速發(fā)展。標(biāo)記血清學(xué)是標(biāo)記免疫學(xué)中的一個最為重要分支，在近四十年發(fā)展歷程中，其敏感性、特異性與穩(wěn)定性，因?qū)嶒?yàn)材料的進(jìn)步而得到顯著的提高；其發(fā)展空間因新的標(biāo)記物、示蹤物及其反應(yīng)信號探測方式的不斷發(fā)掘而得以迅速拓展；操作的便捷程度因?qū)嶒?yàn)反應(yīng)方式的改進(jìn)而得到不斷改善，這種改善與實(shí)驗(yàn)設(shè)備自動化的結(jié)合顯著降低了實(shí)驗(yàn)操作者的工作強(qiáng)度。既往采用的標(biāo)記免疫實(shí)驗(yàn)就其反應(yīng)方式而言包括直接法、間接法、補(bǔ)體法、雙抗體(或雙抗原)夾心法、幾種不同方式的競爭法，各種不同形式的蛋白芯片技術(shù)，以及PAP法等多種。在二十余年的沿革與發(fā)展中，間接法、雙抗體夾心法及其部分競爭法的應(yīng)用迅速得到普及，他們?nèi)呔袃刹交蛞陨系拿庖叻磻?yīng)，而此兩步免疫反應(yīng)在操作方式上可采用二步法，也可以合并在同一時(shí)間平面內(nèi)進(jìn)行，即一步法。由于一步法能在充分保證檢測結(jié)果特異性、敏感性與穩(wěn)定性，在幾乎完全相同的實(shí)驗(yàn)操作、試劑、與實(shí)驗(yàn)儀器條件下，較二步法節(jié)省一次免疫反應(yīng)時(shí)間，并省去一輪洗滌步驟，這一改進(jìn)曾作為標(biāo)記免疫學(xué)上的重大技術(shù)進(jìn)步，于上世紀(jì)90年代后期在我國迅速推廣。Hooks效應(yīng)即鉤狀現(xiàn)象，表現(xiàn)為當(dāng)反應(yīng)體系中待測物質(zhì)，即抗原或抗體，濃度升高到一定程度時(shí)，檢測信號反而下降，甚至出現(xiàn)假陰性結(jié)果。隨著標(biāo)記免疫學(xué)技術(shù)在方法敏感性上的大幅提高，尤其是其主要反應(yīng)方式由傳統(tǒng)的二步法簡化為一步法，并在我國臨床檢驗(yàn)中大幅度普及應(yīng)用后，由Hooks效應(yīng)導(dǎo)致的臨床檢驗(yàn)結(jié)果失真便成為一個十分常見的臨床現(xiàn)象。造成Hooks效應(yīng)的原因雖可能與待測的免疫分子結(jié)構(gòu)相關(guān)，但反應(yīng)體系中靶抗原與對應(yīng)抗體比例的高度失調(diào)是其最主要的原因。這種影響如果發(fā)生于某些特殊臨床指標(biāo)如采用一步法ELISA或化學(xué)發(fā)光技術(shù)進(jìn)行血清HBsAg篩選，則可造成部分強(qiáng)陽性標(biāo)本檢測信號的降低或顯著降低，甚至導(dǎo)致個別具有高度傳染性的強(qiáng)陽性標(biāo)本在一步法檢測中出現(xiàn)假陰性結(jié)果。如果這種漏檢發(fā)生在獻(xiàn)血員篩選，則勢必導(dǎo)致受血者發(fā)生輸血相關(guān)性肝炎的嚴(yán)重臨床事件。鑒于該指標(biāo)在我國檢測規(guī)模及其社會影響面極其廣大，一步法在獻(xiàn)血員HBV感染者篩選中的應(yīng)用在我國已被明令禁止。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種能簡化二步法的實(shí)驗(yàn)操作，同時(shí)又能克服一步法中鉤狀效應(yīng)的標(biāo)記免疫測定方法。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，一種改進(jìn)的標(biāo)記免疫測定的方法，其步驟包括1)向已包被已知抗體或抗原的固相載體表面加入含待測抗原或抗體的待測標(biāo)本，進(jìn)行免疫反應(yīng)；2)向步驟1)的已發(fā)生免疫反應(yīng)的固相載體中加入密度大于上述待測標(biāo)本溶液的標(biāo)記抗體或抗原溶液，靜置分層使標(biāo)記抗體或抗原覆蓋于固相載體表面，使標(biāo)記抗體或抗原與固相載體表面的對應(yīng)免疫物質(zhì)進(jìn)行免疫反應(yīng)；3)洗去固相載體表面未發(fā)生免疫結(jié)合的物質(zhì)；4)根據(jù)常規(guī)方法生成檢測信號，并據(jù)此測定待測標(biāo)本中靶抗原或抗體的含量。所述常規(guī)方法采用酶促顯色的方法，該方法進(jìn)行酶促顯色反應(yīng)后，用酶標(biāo)記比色計(jì)比色，并根據(jù)對照或標(biāo)準(zhǔn)曲線孔測值判讀實(shí)驗(yàn)結(jié)果。所述常規(guī)方法采用化學(xué)發(fā)光顯色的方法，該方法進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯色反應(yīng)后，用化學(xué)發(fā)光測定儀比色，并根據(jù)對照或標(biāo)準(zhǔn)曲線孔測值判讀實(shí)驗(yàn)結(jié)果。所述標(biāo)記抗體或抗原溶液為常規(guī)標(biāo)記溶液中加入惰性有機(jī)與無機(jī)分子，使標(biāo)記溶液的密度大于待測標(biāo)本溶液。所述標(biāo)記抗體或抗原溶液的粘度能使標(biāo)記溶液與待測標(biāo)本溶液分層。步驟3)所述的洗滌方法為洗滌3-6次，每次洗1-5分鐘。同一體積溶液內(nèi)溶質(zhì)數(shù)量及種類的不同，會導(dǎo)致他們密度與粘度的差別。而將兩種或以上溶液置于同一容器中時(shí)，他們將因密度上的差別而依次處于容器中不同的位置，密度較高的溶液會沉在相對下層。合理的溶液粘度對各溶液間界面的維系至關(guān)重要。本發(fā)明利用上述原理，在標(biāo)記溶液中加入惰性有機(jī)與無機(jī)溶劑調(diào)節(jié)標(biāo)記溶液至適當(dāng)?shù)拿芏?。將其加至第一步免疫反?yīng)完成后的反應(yīng)孔或其它容器中，此法配制的標(biāo)記抗體或抗原溶液可因密度較高而平鋪在反應(yīng)孔底部，覆蓋與靶物質(zhì)反應(yīng)后的固相界面并完成二次免疫反應(yīng)。而先期加入的標(biāo)本溶液則通過排溢作上升至標(biāo)記溶液的頂端，不或基本不對二次免疫反應(yīng)發(fā)生干擾。本發(fā)明將二步法標(biāo)記免疫測定中所需要的二步洗滌步驟簡化為一步洗滌，省略一步洗滌及其與之伴隨的相關(guān)操作，從而使實(shí)驗(yàn)過程明顯簡化，并減少了洗滌操作自身的負(fù)面影響。本發(fā)明還保留二步法中兩步免疫反應(yīng)依序進(jìn)行的特征，從理論上根除發(fā)生Hooks效應(yīng)的可能性。本發(fā)明所用各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)條件、實(shí)驗(yàn)儀器、具體操作方法、結(jié)果的計(jì)算方式以及檢測的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與控制等都基本與常規(guī)的測定方法相同，可確保本發(fā)明能與現(xiàn)有技術(shù)實(shí)現(xiàn)良好的對接，具有很強(qiáng)的實(shí)用性。具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，本實(shí)施例僅作舉例來說明本發(fā)明，不作任何限定實(shí)施例1一種雙抗體夾心ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)實(shí)驗(yàn)來測定血清中HBsAg的方法，其步驟包括在已包被抗HBs-IgG的反應(yīng)孔中加入含擬進(jìn)行HBsAg檢測的血清、其它標(biāo)本或質(zhì)控物，室溫免疫反應(yīng)30分鐘；向反應(yīng)板的各反應(yīng)孔中小心加入密度高于待測標(biāo)本溶液的抗HBs-HRP溶液，所加入的抗HBs-HRP溶液平鋪于各反應(yīng)孔的底部，并將已反應(yīng)的待測標(biāo)本溶液排溢到抗HBs-HRP溶液的頂端，靜置，以保持兩層溶液的相對分層狀態(tài)，在室溫下再反應(yīng)30分鐘；免疫反應(yīng)完成后，甩出反應(yīng)孔內(nèi)的全部液體，用洗滌液洗滌反應(yīng)板3次，每次5分鐘，甩干；向反應(yīng)孔中加入酶反應(yīng)底物，室溫放置30分鐘，待酶促顯色反應(yīng)完成后加入50mL濃度為2mol/L硫酸終止反應(yīng)。采用酶標(biāo)比色計(jì)比色，并根據(jù)對照或標(biāo)準(zhǔn)曲線孔測值判讀實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)施例2一種雙抗體夾心酶化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫來測定血清中HBsAg的方法，其步驟包括在已包被抗HBs-IgG的反應(yīng)孔中加入含擬進(jìn)行HBsAg檢測的血清、其它標(biāo)本或質(zhì)控物，室溫免疫反應(yīng)60分鐘。向反應(yīng)板的各反應(yīng)孔中小心加入密度高于待測標(biāo)本溶液的抗HBs-HRP溶液，所加入的抗HBs-HRP溶液平鋪于各反應(yīng)孔的底部，并將已反應(yīng)的待測標(biāo)本溶液排溢到抗HBs-HRP溶液的頂端，靜置，以保持兩層溶液的相對分層狀態(tài)，在室溫下再反應(yīng)60分鐘。免疫反應(yīng)完成后，吸出反應(yīng)孔內(nèi)的全部液體，用洗滌液洗滌反應(yīng)板6次，每次1分鐘，甩干。向反應(yīng)孔中加入化學(xué)發(fā)光底物作酶促發(fā)光反應(yīng)，用發(fā)光信號測定儀測定發(fā)光信號強(qiáng)度，并根據(jù)對照或標(biāo)準(zhǔn)曲線孔測值判讀實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)施例3一種用間接法ELISA測定血清中抗HCV的方法，其步驟包括在已包被重組HCAg的反應(yīng)孔中加入含擬進(jìn)行抗HCV檢測的血清、其它標(biāo)本或質(zhì)控物，室溫免疫反應(yīng)60分鐘。向反應(yīng)板的各反應(yīng)孔中小心加入密度高于待測標(biāo)本溶液的抗HCV-HRP溶液，所加入的抗HCV-HRP溶液平鋪于各反應(yīng)孔的底部，并將已反應(yīng)的待測標(biāo)本溶液排溢到抗HCV-HRP溶液的頂端，靜置，以保持兩層溶液的相對分層狀態(tài)，在室溫下再反應(yīng)60分鐘。免疫反應(yīng)完成后，吸出反應(yīng)孔內(nèi)的全部液體，用洗滌液洗滌反應(yīng)板5次，每次2分鐘，吸干。向反應(yīng)孔中加入酶反應(yīng)底物，室溫放置30分鐘，待酶促顯色反應(yīng)完成后加入50μmL濃度為2mol/L硫酸終止反應(yīng)。采用酶標(biāo)比色計(jì)比色，并根據(jù)對照或標(biāo)準(zhǔn)曲線孔測值判讀實(shí)驗(yàn)結(jié)果。將本發(fā)明的測定方法、常規(guī)標(biāo)記免疫測定方法的一步法與二步法進(jìn)行比較。以實(shí)施例1中的雙抗體夾心ELISA來測定血清中HBsAg含量的方法為例，不同的測定方法對檢測敏感性的影響如表1所示，血清中HBsAg含量單位為ng/mL，測定值為A45(1。測\含^XyI2.01.O0.50.250.1250.06250.03130.016空白_________本發(fā)明3.112.791.941.160.430.370.0210.140.06一步法3.232.931.871.240.580.290.230.170.05二步法2.892.732.111.130.470.310.190.1050.045表1不同的測定方法對檢測敏感性的影響由表1可以看出本發(fā)明的敏感性可以達(dá)到0.03ng/mL，與一步法和二步法沒有明顯差別。以實(shí)施例1中的雙抗體夾心ELISA來測定血清中HBsAg含量的方法為例，不同的測定方法對檢測的顯色強(qiáng)度的影響如表2所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表2不同的測定方法對檢測的顯色強(qiáng)度的影響由表2可以看出以上三種測定方法沒有明顯差別。以實(shí)施例1中的雙抗體夾心ELISA來測定血清中HBsAg含量的方法為例，不同的測定方法對檢測的Hooks效應(yīng)的影響如表3所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表3不同的測定方法對檢測的Hooks效應(yīng)的影響由表3可以看出血清中HbsAg含量過高時(shí)，本發(fā)明方法測值與二步法ELISA之間未見顯著差異，而一步法自150.0μg/mL起，隨著檢測標(biāo)本靶物質(zhì)含量的升高，其A450反而呈序貫下降的趨勢。本發(fā)明檢測信號強(qiáng)度與二步法一樣消除了Hooks效應(yīng)的影響?？傊?，本發(fā)明的敏感性和顯色強(qiáng)度都與一步法及二步法相當(dāng)，但是在進(jìn)行高濃度測量時(shí)的準(zhǔn)確性高于一步法，而又比二步法減少一次洗滌操作，從而減小了操作強(qiáng)度，也減少了洗滌操作過多而給實(shí)驗(yàn)結(jié)果帶來的誤差影響。本發(fā)明不局限于酶標(biāo)記和化學(xué)發(fā)光標(biāo)記方法，其他標(biāo)記方法也可以運(yùn)用本發(fā)明的方法進(jìn)行測定。并且，本發(fā)明也不局限于雙抗體(原)夾心法，間接法與競爭法也可以運(yùn)用本發(fā)明的方法進(jìn)行測定。同時(shí)，所述基于實(shí)驗(yàn)標(biāo)本與標(biāo)記抗體溶液兩者間密度差異而產(chǎn)生的排溢分層的現(xiàn)象還可用于除二步法以外的有二步以上免疫反應(yīng)步驟的其它免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中，從而對其方法進(jìn)行簡化。因此本發(fā)明可以值得推廣應(yīng)用，具有很強(qiáng)的實(shí)用性。權(quán)利要求一種改進(jìn)的標(biāo)記免疫測定的方法，其步驟包括1)向已包被已知抗體或抗原的固相載體表面加入含待測抗原或抗體的待測標(biāo)本，進(jìn)行免疫反應(yīng)；2)向步驟1)的已發(fā)生免疫反應(yīng)的固相載體中加入密度大于上述待測標(biāo)本溶液的標(biāo)記抗體或抗原溶液，靜置分層使標(biāo)記抗體或抗原覆蓋于固相載體表面，使標(biāo)記抗體或抗原與固相載體表面的對應(yīng)免疫物質(zhì)進(jìn)行免疫反應(yīng)；3)洗去固相載體表面未發(fā)生免疫結(jié)合的物質(zhì)；4)根據(jù)常規(guī)方法生成檢測信號，并據(jù)此測定待測標(biāo)本中靶抗原或抗體的含量。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的改進(jìn)的標(biāo)記免疫測定的方法，其特征在于所述常規(guī)方法采用酶促顯色的方法，該方法進(jìn)行酶促顯色反應(yīng)后，用酶標(biāo)記比色計(jì)比色，并根據(jù)對照或標(biāo)準(zhǔn)曲線孔測值判讀實(shí)驗(yàn)結(jié)果。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的改進(jìn)的標(biāo)記免疫測定的方法，其特征在于所述常規(guī)方法采用化學(xué)發(fā)光顯色的方法，該方法進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯色反應(yīng)后，用化學(xué)發(fā)光測定儀比色，并根據(jù)對照或標(biāo)準(zhǔn)曲線孔測值判讀實(shí)驗(yàn)結(jié)果。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的改進(jìn)的標(biāo)記免疫測定的方法，其特征在于所述標(biāo)記抗體或抗原溶液為常規(guī)標(biāo)記溶液中加入惰性有機(jī)與無機(jī)分子，使標(biāo)記溶液的密度大于待測標(biāo)本溶液。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的改進(jìn)的標(biāo)記免疫測定的方法，其特征在于所述標(biāo)記抗體或抗原溶液的粘度能使標(biāo)記溶液與待測標(biāo)本溶液分層。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的改進(jìn)的標(biāo)記免疫測定的方法，其特征在于步驟3)所述的洗滌方法為洗3-6次，每次洗1-5分鐘。全文摘要本發(fā)明提供了一種改進(jìn)的標(biāo)記免疫測定的方法，其步驟包括向已包被已知抗體或抗原的固相載體表面加入待測標(biāo)本，進(jìn)行免疫反應(yīng)；向上述固相載體中加入密度大于待測標(biāo)本溶液的標(biāo)記溶液，靜置分層使標(biāo)記物質(zhì)覆蓋于固相載體表面，并在固相載體表面進(jìn)行免疫反應(yīng)；洗去固相載體表面未發(fā)生免疫結(jié)合的物質(zhì)；根據(jù)常規(guī)方法進(jìn)行顯色，測定待測標(biāo)本中靶物質(zhì)的含量。本發(fā)明將二步法標(biāo)記免疫測定中所需要的二步洗滌簡化為一步洗滌，使實(shí)驗(yàn)過程簡化，并減少了洗滌操作自身的負(fù)面影響。本發(fā)明還保留二步法中兩步免疫反應(yīng)依序進(jìn)行的特征，從理論上根本消除發(fā)生Hooks效應(yīng)的可能性。本發(fā)明所用各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)條件、實(shí)驗(yàn)儀器等都基本與常規(guī)的測定方法相同，具有很強(qiáng)的實(shí)用性。文檔編號G01N21/76GK101806797SQ20101012807公開日2010年8月18日申請日期2010年3月17日優(yōu)先權(quán)日2010年3月17日發(fā)明者張春燕,李佩珊,李方和,陳妍申請人:華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院