專利名稱：肝素鈉中多硫酸軟骨素的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及肝素鈉中多硫酸軟骨素的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)方 法。
背景技術(shù)：
我國(guó)是肝素鈉產(chǎn)量最大的國(guó)家，國(guó)際市場(chǎng)的肝素鈉產(chǎn)品原料70%以上均來(lái)自中 國(guó)。隨著需求的增加，這幾年肝素鈉的價(jià)格一路攀升。2008年2月，美國(guó)因注射肝素鈉出 現(xiàn)4例死亡，多例不良反應(yīng)的醫(yī)療事故，成為震驚世界的“肝素鈉事件”。經(jīng)有關(guān)專家分析， 上述事故可能是因?yàn)榕c肝素鈉中含有多硫酸軟骨素有關(guān)聯(lián)。我國(guó)政府十分重視并關(guān)注事態(tài) 發(fā)展，針對(duì)市場(chǎng)中存在部分肝素鈉中含多硫酸軟骨素情況，國(guó)家藥監(jiān)局召開(kāi)專門(mén)會(huì)議，要求 加強(qiáng)管理，一律召回含有多硫酸軟骨素的肝素鈉。因此，對(duì)肝素鈉中多硫酸軟骨素進(jìn)行檢測(cè) 已經(jīng)成為迫在眉睫的事。目前，行業(yè)內(nèi)肝素鈉中多硫酸軟骨素的檢測(cè)，一般采用核磁共振法，醋酸纖維素薄 膜電泳法。核磁共振法檢測(cè)設(shè)備投入較大，而且多硫酸軟骨素含量少于時(shí)也不易被檢 出。而醋酸纖維素薄膜電泳檢測(cè)法，分離效果差，容易受其它雜質(zhì)干擾，薄膜不透明，不易于 觀察，通常肝素鈉中多硫酸軟骨素的含量大于5%時(shí)，電泳檢測(cè)效果明顯，而當(dāng)多硫酸軟骨 素小于3%時(shí)電泳檢測(cè)結(jié)果不容易辨別。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種肝素鈉中多硫酸軟骨素的瓊脂糖凝膠電泳 檢測(cè)方法，克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，即使肝素鈉中的多硫酸軟骨素含量少于也能被檢 出，本發(fā)明檢測(cè)結(jié)果容易觀察，分辨率高，檢測(cè)靈敏度高。本發(fā)明采取以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)肝素鈉中多硫酸軟骨素的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)方法，包括下列步驟(1)樣品溶解取相同重量的不含多硫酸軟骨素的肝素鈉粗品、含有重量低于 多硫酸軟骨素的肝素鈉粗品、肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品、多硫酸軟骨素標(biāo)準(zhǔn)品，分別溶解于水中，每毫 升溶液中含樣品5-20mg ；(2)硝化對(duì)步驟(1)得到的四種水溶液，分別加酸調(diào)PH至1-3，然后用亞硝酸鹽 或硝酸鹽進(jìn)行硝化反應(yīng)0. 5-2小時(shí)，再用堿調(diào)PH至6. 5-7. 5，備用；(3)制膠板用瓊脂糖溶液與電泳緩沖液混合，其混合體積比為1 0. 7-1. 5，并加 熱使其溶解，趁熱將膠液倒于大小適宜的玻板上，靜置，待凝膠結(jié)成無(wú)氣泡的均勻薄層；(4)電泳在電泳槽內(nèi)加入電泳緩沖液，將凝膠板置于電泳槽架上，浸入緩沖液； 取步驟(1)準(zhǔn)備好的四種樣品水溶液，于凝膠板負(fù)極端分別點(diǎn)樣，立即接通電源，在設(shè)定的 電壓梯度、電流強(qiáng)度的條件下電泳；(5)染色和脫色取下凝膠板，用染色液染色，再用水洗去多余的染色液至背景無(wú) 色為止；
(6)結(jié)果觀察觀察樣品和標(biāo)準(zhǔn)品所顯示的遷移距離。本發(fā)明進(jìn)一步改進(jìn)方案是，步驟(3)、步驟(4)所述的電泳緩沖液為醋酸-鋰鹽緩 沖液，緩沖液的PH值為2. 0-4. 0。本發(fā)明更進(jìn)一步改進(jìn)方案是，步驟(4)所述的點(diǎn)樣，四種樣品溶液的點(diǎn)樣量分別 為0. 5-1. 5 μ 1。所述的電壓梯度為25-35V/cm，電流強(qiáng)度為l-2mA/cm，電泳時(shí)間為15-20分 鐘。多硫酸軟骨素是一種含有葡萄糖醛酸衍生物和乙酰氨基半乳糖衍生物的物質(zhì)，其 分子結(jié)構(gòu)由2-0-硫酸基-葡萄糖醛酸-(1 — 3) -2-N-乙?；?2-脫氧-4或6_0_硫酸基 半乳糖組成，而肝素鈉沒(méi)有這樣的特殊分子結(jié)構(gòu)。亞硝酸鹽或亞硝酸類物質(zhì)只能降解和硫 酸基連接的氨基粘多糖，而不能降解和乙?；B接的乙酰氨基半乳糖。因此硝化反應(yīng)使肝 素鈉降解，而多硫酸軟骨素不降解或不容易降解，在電泳檢測(cè)中被檢出。通過(guò)亞硝酸鹽或亞 硝酸之類物質(zhì)對(duì)含有多硫酸軟骨素的肝素鈉樣品進(jìn)行處理；再通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)肝 素鈉中的多硫酸軟骨素。本發(fā)明的有益效果一、本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了對(duì)肝素鈉中含量較低的多硫酸軟骨素的檢測(cè)，靈敏度達(dá)到0. 5% 以上。二、本發(fā)明所制備的瓊脂糖凝膠厚薄均勻，含水量大(約占98% -99% )，近似自由 電泳，樣品擴(kuò)散性好，對(duì)樣品吸附極微，因此電泳圖譜清晰，分辨率高，重復(fù)性好。三、瓊脂糖透明無(wú)紫外吸收，瓊脂糖膠板呈透明狀，易于觀察，電泳過(guò)程和結(jié)果可 直接用紫外光燈檢測(cè)、觀察，觀察直觀，容易判斷。四、電泳后區(qū)帶易染色，樣品極易洗脫，便于定量測(cè)定，且制成干膜可長(zhǎng)期保存。五、本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，電泳速度快。


圖1為本發(fā)明中的四種樣品電泳圖。圖中的1為不含多硫酸軟骨素的肝素鈉粗品； 圖中的2為含有多硫酸軟骨素的重量0. 6%的肝素鈉粗品；圖中的3為肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品，圖中 的4為多硫酸軟骨素標(biāo)準(zhǔn)品。從圖示可知，圖中的2、4相應(yīng)位置顯現(xiàn)多硫酸軟骨素條帶，圖 中的1、3相應(yīng)位置未顯現(xiàn)該條帶。說(shuō)明本發(fā)明能檢測(cè)出肝素鈉中含有低于的多硫酸軟 骨素(高于此百分比更能檢出)。
具體實(shí)施例以下僅是對(duì)本發(fā)明的說(shuō)明，而非對(duì)本發(fā)明的限制。(1)樣品溶解取不含多硫酸軟骨素的肝素鈉粗品、含有重量0. 6%多硫酸軟骨素 的肝素鈉粗品(向不含多硫酸軟骨素的肝素鈉粗品中加入重量的0.6%多硫酸軟骨素得 到)、肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品、多硫酸軟骨素標(biāo)準(zhǔn)品各200mg，分別溶解于IOml水中。(2)硝化對(duì)步驟(1)得到的四種樣品溶液，分別加鹽酸調(diào)PH至2，然后用亞硝酸 鈉進(jìn)行硝化反應(yīng)1. 5小時(shí)，再用氫氧化鈉調(diào)PH至7，備用；(3)制膠板先配制醋酸-鋰鹽緩沖液，取冰醋酸50mL，加水SOOmL混合后，用氫氧 化鋰調(diào)節(jié)PH值至3. 0，再加水定溶至IOOOmL ；取瓊脂糖0. 2g加入IOmL的水中，置水浴中加熱使其完全溶解，向瓊脂糖溶液中加入溫?zé)岬拇姿醎鋰鹽緩沖液10mL (其溫度與瓊脂糖溶 液溫度接近)，混合均勻后，趁熱將膠液涂布于(4cmX9cm)的玻板上，厚度約3mm，靜置，待 凝膠結(jié)成無(wú)氣泡的均勻薄層，即可；(4)點(diǎn)樣與電泳在電泳槽內(nèi)加入步驟(3)配制的醋酸-鋰鹽緩沖液，將凝膠板 置于電泳槽架上，經(jīng)濾紙橋浸入緩沖液；于凝膠板負(fù)極端分別用步驟(1)得到的樣品溶液 1 U 1點(diǎn)樣，立即接通電源，在電壓梯度約30V/cm、電流強(qiáng)度l-2mA/cm的條件下，電泳約20 分鐘，關(guān)閉電源；(5)染色與脫色取下凝膠板，用甲苯胺藍(lán)溶液染色，再用水洗去多余的染色液至 背景無(wú)色為止；甲苯胺藍(lán)溶液配制一般可用甲苯胺藍(lán)0. lg溶解于lOOmL水中制得；(6)觀察標(biāo)準(zhǔn)樣品與對(duì)照樣品所顯示的遷移距離，標(biāo)準(zhǔn)品與對(duì)照樣品所顯示的遷 移距離之比為0. 8-0. 9。
權(quán)利要求
肝素鈉中多硫酸軟骨素的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)方法，其特征在于包括下列步驟(1)樣品溶解取相同重量的不含多硫酸軟骨素的肝素鈉粗品、含有重量低于1％多硫酸軟骨素的肝素鈉粗品、肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品、多硫酸軟骨素標(biāo)準(zhǔn)品，分別溶解于水中；(2)硝化對(duì)步驟(1)得到的四種水溶液，分別加酸調(diào)PH至1-3，然后用亞硝酸鹽或硝酸鹽進(jìn)行硝化反應(yīng)0.5-2小時(shí)，再用堿調(diào)PH至6.5-7.5，備用；(3)制膠板用瓊脂糖溶液與電泳緩沖液混合，其混合體積比為1∶0.7-1.5，并加熱使其溶解，趁熱將膠液倒于大小適宜的玻板上，靜置，待凝膠結(jié)成無(wú)氣泡的均勻薄層；(4)電泳在電泳槽內(nèi)加入電泳緩沖液，將凝膠板置于電泳槽架上，浸入緩沖液；取步驟(1)準(zhǔn)備好的四種樣品水溶液，于凝膠板負(fù)極端分別點(diǎn)樣，立即接通電源，在設(shè)定的電壓梯度、電流強(qiáng)度的條件下電泳；(5)染色和脫色取下凝膠板，用染色液染色，再用水洗去多余的染色液至背景無(wú)色為止；(6)結(jié)果觀察觀察樣品和標(biāo)準(zhǔn)品所顯示的遷移距離。
2.如權(quán)利要求1所述的肝素鈉中多硫酸軟骨素的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)方法，其特征在 于步驟(3)、步驟(4)所述電泳緩沖液為醋酸-鋰鹽緩沖液，緩沖液的pH值為2. 0-4.0。
3.如權(quán)利要求1所述的肝素鈉中多硫酸軟骨素的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)方法，其特征在 于步驟(4)所述的點(diǎn)樣，四種樣品溶液的點(diǎn)樣量分別為0. 5-1. 5 μ 1。
4.如權(quán)利要求1所述的肝素鈉中多硫酸軟骨素的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)方法，其特征在 于步驟(4)所述的電壓梯度為25-35V/cm，電流強(qiáng)度為l-2mA/cm，電泳時(shí)間為15-20分鐘。
5.如權(quán)利要求1所述的肝素鈉中多硫酸軟骨素的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)方法，其特征在 于步驟(5)所述的染色液為甲苯胺藍(lán)溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了肝素鈉中多硫酸軟骨素的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)方法，根據(jù)多硫酸軟骨素與肝素鈉分子結(jié)構(gòu)不同的特點(diǎn)，通過(guò)硝化反應(yīng)使肝素鈉降解，而多硫酸軟骨素不容易降解，在電泳檢測(cè)中被檢出。本發(fā)明采用瓊脂糖凝膠電泳實(shí)現(xiàn)了對(duì)肝素鈉中含量較低的多硫酸軟骨素的檢測(cè)，靈敏度達(dá)到0.5％以上，電泳圖譜清晰，分辨率高，觀察直觀，容易判斷，重復(fù)性好。電泳后區(qū)帶易染色，樣品極易洗脫，便于定量測(cè)定，且制成干膜可長(zhǎng)期保存。本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，電泳速度快。
文檔編號(hào)G01N1/30GK101825608SQ20101011207
公開(kāi)日2010年9月8日 申請(qǐng)日期2010年2月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月12日
發(fā)明者劉榜惠, 張志斌, 袁紅英 申請(qǐng)人:淮安麥德森化學(xué)有限公司