專利名稱：新的質(zhì)量分析信號(hào)的放大技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用質(zhì)量分析檢測(cè)靶分子的技術(shù)。更具體而言，本發(fā)明涉及一種新的 信號(hào)放大方法，該方法使用通過低分子量有機(jī)分子進(jìn)行表面修飾(surface-modified)的 金顆粒來檢測(cè)生物分子等靶分子。
背景技術(shù)：
在人類平均壽命延長(zhǎng)的同時(shí)，出生率不斷下降，因而人口老齡化不斷加?。淮送?， 一方面，由于肥胖者、患有生活習(xí)慣病的人的增加，準(zhǔn)確診斷生活習(xí)慣病、慢性疾病等復(fù)雜 疾病并有效預(yù)防和治療日益得到重視。作為疾病等的診斷中重要的線索的生物分子、即生 物標(biāo)記(biomarker)大部分以極低的濃度存在于體內(nèi)或試樣中，因此需要具有超高靈敏度 (ultra high sensitivity)的檢測(cè)方法。目前已知的多種測(cè)定方法，在靈敏度方面顯示出 優(yōu)異的結(jié)果，但基本在下面這些方面并不令人滿意，或者尚存改善的余地。(1)是否不僅能夠用于特定疾病、特定試樣而且能夠作為通用的生物學(xué)信號(hào)放大 方法使用？(2)實(shí)驗(yàn)方法總體上是否容易？(3)非選擇性吸附導(dǎo)致的假信號(hào)的放大是否易于消除？(4)在進(jìn)行數(shù)量較多的實(shí)驗(yàn)時(shí)，是否存在費(fèi)用方面的問題？上述因素對(duì)于由有限量的試樣獲得精密的分析結(jié)果進(jìn)而進(jìn)行準(zhǔn)確的診斷而言，均 為重要的條件。因此，從這種意義上來說，如果開發(fā)出一種能夠同時(shí)對(duì)多種疾病標(biāo)記物進(jìn)行 比較分析的測(cè)定方法，則將能夠克服目前的ELISA等分析方法(即，每次必須僅對(duì)1個(gè)標(biāo)記 物進(jìn)行分析的診斷方法)的局限。質(zhì)量分析法通過對(duì)核酸、蛋白質(zhì)、肽、糖等生物分子以及通常的有機(jī)分子的質(zhì)量和 信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)定，從而能夠準(zhǔn)確獲知作為分析對(duì)象的靶分子的種類和量。質(zhì)量分析不限 于特定作用基團(tuán)的存在，因此理論上來說可應(yīng)用的分子的范圍較寬，利用質(zhì)量分析常常能 夠同時(shí)且準(zhǔn)確地分析復(fù)雜試樣中的多種靶分子，因此，例如，能夠用于多種疾病標(biāo)記物的同 時(shí)分析和診斷中。質(zhì)量分析根據(jù)試樣的電離和離子的檢測(cè)方式而存在多種類型，上述質(zhì)量分 析法中，基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間(Matrix-Assisted Laser Desorption/ lonization-T ime-of-F 1 i gh t, MALDI -T0F)方法被廣泛用于生物體試樣的質(zhì)量分析中。已知 MALDI-T0F方式的質(zhì)量分析法是用于必須迅速測(cè)定多個(gè)試樣的超高速診斷中的最優(yōu)選的質(zhì) 量分析法。然而，通過MALDI-T0F方法直接測(cè)定靶分子質(zhì)量，因靈敏度低而存在難以測(cè)定微 量的生物標(biāo)記的局限。此外，目前的現(xiàn)狀是，不僅需要關(guān)于生物標(biāo)記是否存在的信息，還需 要關(guān)于其量的信息，僅通過目前所使用的MALDI-T0F方法對(duì)此而言并不充分。因此，迫切需 要開發(fā)用于克服該問題的MALDI-T0F高靈敏度定量法、甚至并非基質(zhì)輔助方式時(shí)也能對(duì)微 量生物分子進(jìn)行定量分析的、能夠放大信號(hào)的質(zhì)量分析方法。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問題本發(fā)明是鑒于上述情況而作出的，其目的在于設(shè)計(jì)一種系統(tǒng)，其能由1個(gè)靶分子 放出被放大至數(shù)千或數(shù)萬倍的質(zhì)量分析信號(hào)；以及用于其的方法。解決問題的手段為解決這一技術(shù)問題，本發(fā)明中提供一種表面通過信號(hào)產(chǎn)生用低分子化合物修飾 的、用于捕獲靶分子和放大信號(hào)的金顆粒；使用其的分析系統(tǒng)以及使用前述金顆粒和分析 系統(tǒng)的靶分子的分析方法。在本發(fā)明的一個(gè)方面，前述金顆粒具有信號(hào)產(chǎn)生部、連接部(linker)和捕獲子。 多個(gè)前述信號(hào)產(chǎn)生部連接在前述金顆粒的表面，在前述表面形成自組裝單分子層(self assembled monolayer)。前述連接部的一端結(jié)合在前述金顆粒的表面，該連接部的另一端 連接在與靶分子特異性結(jié)合、或特異性發(fā)生反應(yīng)的捕獲子上。這里，前述信號(hào)產(chǎn)生部為多個(gè) 有機(jī)分子，在前述金顆粒的質(zhì)量分析過程中，從前述金納米顆粒游離而生成多個(gè)質(zhì)量有別 于靶分子的大小的有機(jī)陽離子。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，前述信號(hào)產(chǎn)生部，一端部通過金-硫(Au-S)鍵結(jié)合在 前述金顆粒的表面，具有另一側(cè)的醚末端部、以及連接在前述醚末端部且與前述金顆粒的 表面結(jié)合的烷烴硫醇部。這里，前述醚末端部?jī)?yōu)選含有1個(gè)以上乙二醇單元。本發(fā)明的一 個(gè)實(shí)施方式中，前述金顆粒通過激光解吸電離-飛行時(shí)間方式的質(zhì)量分析而產(chǎn)生前述信號(hào) 產(chǎn)生部的質(zhì)量信號(hào)。本發(fā)明的另一方式中，提供一種分析系統(tǒng)，該系統(tǒng)含有前述金顆粒和能夠?qū)⒎治?對(duì)象試樣固定于表面的靶固定面。此時(shí)，前述靶固定面特征在于具有固相的支撐體，能夠 通過共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵將用于分析是否存在靶分子的試樣固定在前述支撐體的表面上。本 發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，前述靶固定面具有通過金-硫(Au-S)鍵與前述靶固定面的表面 連接、在前述表面形成自組裝單分子層的多個(gè)信號(hào)產(chǎn)生部；結(jié)合在前述靶固定面的表面的 1個(gè)以上連接部；和結(jié)合在前述連接部、通過共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵固定靶分子的捕獲子。此 時(shí)，前述信號(hào)產(chǎn)生部為在前述金顆粒的質(zhì)量分析過程中從前述金納米顆粒游離后生成多個(gè) 質(zhì)量有別于靶分子和前述金顆粒的信號(hào)產(chǎn)生部的大小的有機(jī)陽離子的有機(jī)分子。本發(fā)明的再一方式中，提供一種使用前述金顆粒來分析試樣中的靶分子的方法。 該方法包括下述階段使分析是否存在靶分子的試樣和捕獲固定面相互接觸而生成捕獲混 合物的結(jié)合階段；由前述捕獲混合物除去非特異性結(jié)合的金顆粒的分選階段；以及，前述 分選階段結(jié)束后，對(duì)捕獲混合物中殘存的金顆粒進(jìn)行質(zhì)量分析的階段。此時(shí)，關(guān)于前述捕獲 固定面而言，用于與靶分子結(jié)合的前述捕獲子被固定在前述金顆粒表面的固相支撐體上。 此時(shí)，前述質(zhì)量分析既可以是以前述捕獲混合物為對(duì)象的無基質(zhì)方式的激光解吸電離質(zhì)量 分析；也可以是常規(guī)MALDI-T0F質(zhì)量分析。此外，也可以在前述分選階段和質(zhì)量分析階段之 間從捕獲混合物中分離結(jié)合后的金顆粒，僅對(duì)該金顆粒進(jìn)行質(zhì)量分析。發(fā)明效果使用本發(fā)明的質(zhì)量分析信號(hào)的放大系統(tǒng)和所述方法，不必進(jìn)行預(yù)處理即可將作為 分析對(duì)象的靶分子的質(zhì)量分析信號(hào)特異性放大，發(fā)揮能夠不受其它物質(zhì)的影響而進(jìn)行定量 測(cè)定的效果。


圖1為舉出具體的一個(gè)實(shí)施方式并將本發(fā)明涉及的質(zhì)量信號(hào)的放大原理圖形化 的圖，表示采用AM-質(zhì)量標(biāo)記作為信號(hào)產(chǎn)生部的質(zhì)量分析系統(tǒng)的分析過程。圖2是能夠用于本發(fā)明的金顆粒或靶固定面的信號(hào)產(chǎn)生部的具體的一個(gè)實(shí)施方 式，表示能夠通過硫-金鍵將自身固定于金的表面的AM-質(zhì)量標(biāo)記分子的結(jié)構(gòu)式。圖3是表示用圖2的AM-質(zhì)量標(biāo)記1和AM-質(zhì)量標(biāo)記2在金顆?；虬泄潭娴谋?面形成自組裝單分子層(SAM)后的形態(tài)的圖。圖3表示起連接部作用的AM-質(zhì)量標(biāo)記2未 與捕獲子連接的狀態(tài)。圖4表示的是對(duì)通過實(shí)施例2而在表面連接AM-質(zhì)量標(biāo)記1和AM-質(zhì)量標(biāo)記2 但未連接捕獲子的金顆粒上自組裝單分子層的形成情況進(jìn)行質(zhì)量分析的質(zhì)譜。圖5表示能夠確認(rèn)在固定有谷胱甘肽靶分子的靶固定面的表面形成SAM的 MALDI-T0F 譜。圖6為表示在固定有谷胱甘肽靶分子的靶固定面的形成過程中、在各階段AM-質(zhì) 量標(biāo)記分子形成SAM的質(zhì)譜。圖6的(a)和圖6的(c)為生物素靶固定面的分析結(jié)果，圖6 的(b)和圖6的(d)為谷胱甘肽(GSH)靶固定面的分析結(jié)果，圖表內(nèi)的百分率表示靶固定 面的表面處靶分子的高精度。圖7為用于證明本發(fā)明涉及的AM-質(zhì)量標(biāo)記產(chǎn)生特異性質(zhì)量信號(hào)的對(duì)照組實(shí)驗(yàn)。 圖7的(a)為使固定有生物素靶分子的靶固定面和具有中性鏈親和素(neutravidin)捕獲 子的金顆粒反應(yīng)的情況的質(zhì)譜，圖7的(b)為使固定有生物素靶分子的靶固定面和具有肌 紅蛋白捕獲子的金顆粒反應(yīng)的情況的質(zhì)譜，圖7的(c)為使未固定生物素的靶固定面和具 有中性鏈親和素捕獲子的金顆粒反應(yīng)的質(zhì)譜。圖8為用于證明本發(fā)明涉及的AM-質(zhì)量標(biāo)記產(chǎn)生特異性質(zhì)量信號(hào)的對(duì)照組實(shí)驗(yàn)。 圖8的(a)為對(duì)形成有圖2的AM-質(zhì)量標(biāo)記1的SAM的SAM金板進(jìn)行MALDI-T0F分析的質(zhì) 譜，圖8的(b)為對(duì)同樣的SAM金板在不形成基質(zhì)下進(jìn)行激光解吸電離分析的譜圖，圖8的 (c)為使同樣的SAM金板與形成有AM-質(zhì)量標(biāo)記5的SAM的金顆粒反應(yīng)的質(zhì)譜。圖9為在液體狀態(tài)下對(duì)AFP靶分子或脂聯(lián)素靶分子進(jìn)行質(zhì)量分析的結(jié)果的質(zhì)譜。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明要實(shí)現(xiàn)的核心技術(shù)是，對(duì)金顆粒進(jìn)行表面改性而使其能夠與靶分子 (target molecule)選擇性結(jié)合，然后通過對(duì)用前述金顆粒修飾過的低分子化合物進(jìn)行質(zhì) 量分析來檢測(cè)與靶分子的相互作用，是一種通過多個(gè)低分子化合物檢測(cè)出1個(gè)靶分子的形 式的新的信號(hào)放大方法。本發(fā)明的用于捕獲靶分子和放大信號(hào)的金顆粒，其表面經(jīng)有機(jī)分子改性、用低分 子量有機(jī)分子進(jìn)行了修飾。該改性的金顆粒具有信號(hào)產(chǎn)生部、連接部和捕獲子。本發(fā)明的 金顆粒中，捕獲子為與靶分子特異性結(jié)合的部分，連接部的一端連接在前述捕獲子上，另一 端連接在前述金顆粒上。另一方面，信號(hào)產(chǎn)生部為有機(jī)分子，為了信號(hào)的放大而在金顆粒的 表面結(jié)合有多個(gè)，在質(zhì)量分析過程中由于激光等而從金顆粒游離，生成有別于靶分子的有 機(jī)陽離子。本發(fā)明中，形成前述信號(hào)產(chǎn)生部的有機(jī)分子形成自組裝單分子層(SAM)。如后所述，使用自組裝單分子層的話，即使省略基質(zhì)的形成也能夠檢測(cè)質(zhì)量信號(hào)。此外，形成SAM 的話，能夠?qū)⑸飳W(xué)標(biāo)記穩(wěn)定且容易地連接在珠上。本發(fā)明的金顆粒特征在于，由于含有數(shù)量遠(yuǎn)多于捕獲子的信號(hào)產(chǎn)生部，因此即使 在存在于微量試樣或痕量試樣中的僅僅1個(gè)靶分子被1個(gè)金顆粒捕獲的情況下，在質(zhì)量分 析過程中，通過檢測(cè)由前述金顆粒產(chǎn)生的多個(gè)信號(hào)產(chǎn)生部分子或其片段(fragment)而被 放大的2次質(zhì)量信號(hào)，能夠提高分析的靈敏度。圖1為例舉本發(fā)明的部分實(shí)施方式的例子并將其原理圖形化的圖，表示將信號(hào)產(chǎn) 生部作為質(zhì)量標(biāo)記(mass tag)的信號(hào)放大方式。圖1的(a)為使用用于捕獲靶分子和放 大信號(hào)的本發(fā)明的金顆粒來檢測(cè)靶分子的一個(gè)實(shí)施方式。圖1的(a)的最左側(cè)的示意圖表 示具有能夠固定靶分子的表面的固相支撐體。實(shí)施在該固相支撐體上固定靶分子(用空心 圓表示)的預(yù)處理后(圖1的(a)左側(cè)起第2個(gè)示意圖)，對(duì)其加入多種本發(fā)明涉及的金顆 粒(左側(cè)起第3個(gè)示意圖)。圖1中，本發(fā)明的金顆粒用具有彎曲的帶狀突起的大的空心 圓來表示。該示意圖中，連接在圓上的呈放射狀的突起表示信號(hào)產(chǎn)生部，黑色半圓狀或V字 狀部分表示捕獲子，將捕獲子和大的空心圓連接在一起的部分表示連接部。前述金顆粒中， 僅分選出與靶分子特異性結(jié)合的產(chǎn)物，并留下該產(chǎn)物(圖1的(a)左側(cè)起第4個(gè)示意圖)。 接著，關(guān)于該分選出的金顆粒而言，在質(zhì)量分析過程中由于電離激光等從金顆粒脫離(左 側(cè)起第5個(gè)示意圖)，從而產(chǎn)生質(zhì)量分析信號(hào)(圖1的(a)的最后的示意圖)。另一方面，作為本發(fā)明另一實(shí)施方式的圖1的(b)中，未實(shí)施圖1的(a)那樣的靶 分子的固定化預(yù)處理。圖1的(b)中，將前述金顆粒和固相支撐體、以及未固定的靶分子試 樣混合并培養(yǎng)，不需要進(jìn)行預(yù)處理(圖1的(b)的最左側(cè)的示意圖)。加入含有靶分子和其 它分子的試樣后進(jìn)行分選的話，僅使前述金顆粒、靶分子、支撐體結(jié)合而成的產(chǎn)物留下(左 側(cè)起第2個(gè)示意圖)。然后，該金顆粒-靶分子-支撐體能夠經(jīng)過與圖1的(a)同樣的步驟 而產(chǎn)生質(zhì)量分析信號(hào)。本發(fā)明的金顆粒的大小沒有特別限制，可根據(jù)用途選擇適當(dāng)大小。即，可以是納米 級(jí)別的納米顆粒，也可以是微米級(jí)別的微米顆粒。例如，為納米顆粒的情況下，在想要區(qū)分 細(xì)胞表面這類具有微細(xì)表面結(jié)構(gòu)的對(duì)象的結(jié)構(gòu)時(shí)很有利；微米顆粒的情況下，具有膠體狀 態(tài)下安全性高、表面改性容易的優(yōu)點(diǎn)，每個(gè)顆粒表面能連接的信號(hào)產(chǎn)生部數(shù)目增加，具有信 號(hào)的放大更顯著的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明中，用前述金顆粒分析的靶分子和用于特異性捕獲該靶分子的捕獲子沒有 特別限制。只要是能通過特異性的相互作用例如氫鍵進(jìn)行捕獲或能通過高度選擇性的化學(xué) 反應(yīng)進(jìn)行捕獲的靶分子和捕獲子，則均是本發(fā)明的應(yīng)用對(duì)象。因此，滿足該條件的所有有機(jī) 分子、無機(jī)分子、生物分子、大分子均可作為靶分子。例如，在類似于生物素(biotin)和親 和素(avidin)、小型配體和其蛋白受體這樣的情況下，可以以小型有機(jī)分子為靶分子、以與 其特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)作為捕獲子。當(dāng)然，也可以是靶分子為蛋白質(zhì)、捕獲子為小型有機(jī)分 子這樣的構(gòu)成?；蛘?，還可以是冠醚(crown ether)或穴狀配體(cryptand)以及與其特異 性結(jié)合的陽離子這樣的、靶分子為無機(jī)離子而捕獲子是有機(jī)分子的構(gòu)成。此外，還可以是酶 和其非可逆性抑制劑(irreversible inhibitor)的情況(例如，沙林(sarin)等有機(jī)磷化 合物和乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase))這樣的、捕獲子和靶分子之間發(fā)生特異性 化學(xué)反應(yīng)而通過共價(jià)鍵相互連接這樣的構(gòu)成。
生物分子的情況下，存在顯示特異性結(jié)合(specific binding)特性的多種例 子，因此其為本發(fā)明的靶分子的1個(gè)優(yōu)選例子。生物分子之中，所有生物分子、例如蛋 白質(zhì)、肽、核酸、碳水化合物、脂質(zhì)、碳水化合物_蛋白質(zhì)綴合物(carbohydrate-protein conjugate)、脂質(zhì)-蛋白質(zhì)綴合物均可作為其對(duì)象。本發(fā)明的信號(hào)產(chǎn)生部，并非是形成自組裝單分子層的巨大分子，而是有機(jī)分子。形 成自組裝單分子層(SAM)的分子可通過多種長(zhǎng)度和化學(xué)物質(zhì)來制作，因此對(duì)于多種生物學(xué) 的靶，可生成質(zhì)量值存在差異的多種SAM形成分子而進(jìn)行區(qū)別。如上所述，本發(fā)明中，將用 作信號(hào)放大用途的SAM分子簡(jiǎn)稱為放大質(zhì)量標(biāo)記(amplifying mass tag)或?qū)⑵浜?jiǎn)稱為 AM-質(zhì)量標(biāo)記。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，前述信號(hào)產(chǎn)生部的一端部為烷烴硫醇(alkanethiol) 部位，通過金-硫(Au-S)鍵結(jié)合在前述金顆粒的表面，在其另一側(cè)具有醚末端部。本發(fā)明的 更具體的實(shí)施方式中，該醚末端部?jī)?yōu)選具有1個(gè)以上乙二醇重復(fù)單元。由乙二醇重復(fù)單元 構(gòu)成的醚末端部能夠抑制非特異性的蛋白質(zhì)吸附。該具有乙二醇重復(fù)單元的AM-質(zhì)量標(biāo)記 分子的例子如圖2所示。包含圖2所示分子的本發(fā)明涉及的AM-質(zhì)量標(biāo)記在MALDI-T0F質(zhì) 量分析等激光解吸電離方式的質(zhì)量分析時(shí)，特別易于從金顆粒脫離并產(chǎn)生質(zhì)量分析信號(hào)。如圖1和圖2所示，本發(fā)明中，對(duì)每種靶分子能夠?qū)?yīng)于選擇不同的捕獲子和不同 的AM-質(zhì)量標(biāo)記的金顆粒。使用這樣的多種金顆粒能夠同時(shí)多通道(multiplex)地分析多 種靶分子。由于質(zhì)量分析能夠容易地分析微細(xì)的質(zhì)量差異，因此適于多重分析。本發(fā)明的另一方面中，提供含有該金顆粒靶分子的分析系統(tǒng)。該分析系統(tǒng)含有前 述金顆粒和能夠在表面固定分析對(duì)象試樣的靶固定面。此時(shí)，特征在于，前述靶固定面具有 固相的支撐體，前述支撐體的表面能夠通過共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵固定用于分析是否存在靶分 子的試樣。該靶分子的分析系統(tǒng)，如圖1的(a)所示，可以實(shí)施在靶固定面固定試樣的預(yù)處 理后進(jìn)行利用；如圖1的(b)所示，也可以不進(jìn)行預(yù)處理而進(jìn)行利用。本發(fā)明的分析系統(tǒng) 中，靶固定面具有將靶分子固定在固相的支撐體上的手段，為此，也可對(duì)支撐體的表面進(jìn)行 改性。靶分子的固定手段優(yōu)選為特異性的，但只要本發(fā)明涉及的金顆粒的捕獲子能夠與靶 分子特異性結(jié)合，也可以不必為特異性的。在靶固定面的支撐體的表面上固定靶分子的方 式，可以使用使靶分子和表面或改性表面之間形成共價(jià)鍵、或非共價(jià)鍵(例如，氫鍵等利用 分子間的力的結(jié)合)而進(jìn)行固定的方式中的任意一種。本發(fā)明的分析系統(tǒng)中，前述靶固定面中支撐體的原材料可使用常規(guī)材料、即玻璃、 硅、金屬、半導(dǎo)體或塑料，某些特定的實(shí)施方式中，前述靶固定面也可以是固定有從含有靶 分子的、規(guī)定生物體試樣獲得的其它生物分子的生物芯片。例如，可以是通過形成非特異性 共價(jià)鍵而在表面固定有從特定狀態(tài)的細(xì)胞獲得的細(xì)胞裂解液(cell lysate)試樣中的蛋白 質(zhì)的生物芯片。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，前述靶固定面可以與前述金顆粒同樣地具有低分子量 有機(jī)分子的自組裝單分子層和捕獲子。即，前述靶固定面可具有通過金-硫(Au-S)鍵與前 述靶固定面的表面連接、在前述表面形成自組裝單分子層的多個(gè)信號(hào)產(chǎn)生部；結(jié)合在前述 靶固定面的表面的1個(gè)以上連接部；以及結(jié)合在前述連接部、通過共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵固定 靶分子的捕獲子。此時(shí)，前述信號(hào)產(chǎn)生部特征在于，其為如下的有機(jī)分子(AM-質(zhì)量標(biāo)記) 在前述金顆粒的質(zhì)量分析過程中從前述金納米顆粒游離，生成多個(gè)質(zhì)量有別于靶分子和前述金顆粒的信號(hào)產(chǎn)生部的大小的有機(jī)陽離子。本發(fā)明的更具體方式中，關(guān)于前述金顆粒和 前述靶固定面而言，雖具有具備烷烴硫醇部和乙二醇重復(fù)單元的信號(hào)產(chǎn)生部的單層，但采 用不同的信號(hào)產(chǎn)生部分子、即AM分子，使用與同一個(gè)靶分子特異性結(jié)合的不同抗體作為捕 獲子。本發(fā)明另一方式中，提供使用這樣的靶固定面和金顆粒來分析試樣中的靶分子的 方法。如前述圖1的(a)所示，伴有試樣的預(yù)處理的方法包含如下的階段。(i)使試樣與固相的支撐體接觸而獲得前述固相支撐體的表面上固定有試樣中的 物質(zhì)(靶分子或其它物質(zhì))的靶固定面的階段；(ii)在連接在本發(fā)明的金顆粒的捕獲子可與靶分子特異性結(jié)合的條件下，使權(quán)利 要求1 8中任意一項(xiàng)的金顆粒和前述靶固定面接觸而生成捕獲混合物的階段；(iii)從前述捕獲混合物中除去非特異性結(jié)合的金顆粒的分選階段；以及(iv)前述第(iii)階段結(jié)束后，對(duì)捕獲混合物中殘存的金顆粒進(jìn)行質(zhì)量分析的階 段。另一方面，不將試樣固定在靶固定面上，而是將金顆粒和試樣與靶固定面同時(shí)培 養(yǎng)使其結(jié)合的方法包括下述階段。(i)使試樣和權(quán)利要求1 8中任意一項(xiàng)的金顆粒與在固相支撐體的表面固定有 用于結(jié)合前述靶分子的捕獲子的捕獲固定面相互接觸，生成捕獲混合物的階段；(ii)從前述捕獲混合物除去非特異性結(jié)合的金顆粒的分選階段；以及(iii)前述(ii)階段結(jié)束后，對(duì)捕獲混合物中殘存的金顆粒進(jìn)行質(zhì)量分析的階 段。本發(fā)明的靶分子的質(zhì)量分析由于利用了信號(hào)的放大，因此具有如下的有利特征 不僅靈敏度高，而且通過能被質(zhì)譜儀檢測(cè)到的信號(hào)產(chǎn)生部的2次信號(hào)的強(qiáng)度還能夠進(jìn)行靶 分子的定量。為進(jìn)行定量分析，可利用用量已知的內(nèi)標(biāo)物(internal standard)和與其相 應(yīng)的金顆粒的方法。本發(fā)明的靶分子的分析方法具有如下的優(yōu)點(diǎn)，S卩，對(duì)于通過試樣將金顆粒和靶固 定面連接的狀態(tài)的捕獲混合物、尤其是經(jīng)過了分選而除去非特異性結(jié)合在靶固定面的金顆 粒的捕獲混合物，可不進(jìn)行其它處理過程而直接使用。本發(fā)明的信號(hào)產(chǎn)生部(即AM-質(zhì)量標(biāo) 記)通過激光解吸電離，從捕獲混合物直接被分離并生成產(chǎn)生質(zhì)量分析信號(hào)的陽離子。常 規(guī)激光解吸電離質(zhì)量分析中，使用基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)的方式，即，將基質(zhì)形成 物質(zhì)和試樣混合而形成基質(zhì)后，對(duì)該基質(zhì)照射激光使分析對(duì)象物質(zhì)解吸、電離。然而，本發(fā) 明的分析方法中，不必形成這樣的基質(zhì)，分選結(jié)束后的捕獲混合物可直接加入到激光解吸 電離質(zhì)譜儀中，因此能夠省略不必要的過程。本發(fā)明的金顆粒支持多重分析，在前述的基礎(chǔ) 上經(jīng)過最低限度的分選過程后，無需進(jìn)行其它的試樣處理就能夠直接進(jìn)行質(zhì)量分析，因此， 本發(fā)明的分析方法還適合高速分析(high-throughput assay)。另一方面，本發(fā)明的分析方 法中，也可以通過常規(guī)MALDI-T0F方式分析捕獲混合物，S卩，在質(zhì)量分析之前，可以增加使 捕獲混合物形成基質(zhì)的階段。本發(fā)明的分析方法中，質(zhì)量分析方式?jīng)]有特別限定，可使用在質(zhì)譜裝置內(nèi)能夠使 信號(hào)產(chǎn)生部從金顆粒游離的所有質(zhì)量分析方法。其中，如前所述，激光解吸電離質(zhì)量分析能 夠由本發(fā)明的金顆粒容易地產(chǎn)生質(zhì)量分析信號(hào)，是尤其適合生物分子試樣的電離的方式。激光解吸電離質(zhì)量分析中，最常用的是MALDI-T0F方式。銷售的質(zhì)譜裝置基本是將MALDI電離和TOF離子檢測(cè)方式結(jié)合，但未必需要限定為TOF檢測(cè)方式。此外，還可以在質(zhì)量分析 階段之前，增加由分選結(jié)束后的捕獲混合物僅分離特異性結(jié)合的金顆粒或結(jié)合在一起的金 顆粒-試樣的階段。如上所述，僅分離金顆粒的情況下，不僅激光解吸電離方式中、其它電 離方式的質(zhì)譜裝置中也能夠應(yīng)用本發(fā)明。普通的MALDI-T0F質(zhì)量分析的檢測(cè)限為數(shù)皮摩(picomole)，若利用本發(fā)明中公開 的信號(hào)放大方式的分析方法，則對(duì)10_15摩爾(attomole)以下的痕量試樣也能進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)施例下面舉出實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說明。下述的實(shí)施例、合成例等為本發(fā)明的例示，用于詳細(xì)進(jìn)行說明，任意情況下均非出于限定本發(fā)明的目的。<實(shí)施例1>AM分子的合成第1階段AM-質(zhì)量標(biāo)記的合成對(duì)具有長(zhǎng)烷基的長(zhǎng)鏈硫醇(long chain thiol)部分結(jié)合多種長(zhǎng)度的乙二醇 (ethylene glycol)重復(fù)單元，合成如圖2所示的具有多種質(zhì)量值的AM-質(zhì)量標(biāo)記。<實(shí)施例2>具有捕獲子的金顆粒的制造在本發(fā)明涉及的一具體實(shí)施方式
中，制造了具有捕獲子的金顆粒。該顆粒的結(jié)構(gòu) 為，在由AM-質(zhì)量標(biāo)記構(gòu)成的自組裝單分子層中含有連接部和捕獲子。如表1所示，制備了 5種金顆粒。表 權(quán)利要求
一種用于捕獲靶分子和放大信號(hào)的金顆粒，其特征在于，其為表面經(jīng)有機(jī)分子改性的金顆粒，所述金顆粒具有多個(gè)信號(hào)產(chǎn)生部，其連接在所述金顆粒的表面，在所述表面形成自組裝單分子層；1個(gè)以上的連接部，其結(jié)合在所述金顆粒的表面；捕獲子，其連接在所述連接部，與靶分子特異性結(jié)合或者發(fā)生特異性反應(yīng)，所述信號(hào)產(chǎn)生部為在所述金顆粒的質(zhì)量分析過程中從所述金納米顆粒游離而生成多個(gè)質(zhì)量有別于靶分子的大小的有機(jī)陽離子的有機(jī)分子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于捕獲靶分子和放大信號(hào)的金顆粒，其特征在于，所述金 顆粒為含有捕獲子不同的多種金顆粒的集合，針對(duì)各捕獲子而信號(hào)產(chǎn)生部不同。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于捕獲靶分子和放大信號(hào)的金顆粒，其特征在于，所述靶 分子為生物分子。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于捕獲靶分子和放大信號(hào)的金顆粒，其特征在于，所述捕 獲子選自由蛋白質(zhì)、肽、核酸、碳水化合物、脂質(zhì)、碳水化合物-蛋白質(zhì)綴合物、脂質(zhì)_蛋白質(zhì) 綴合物和小型有機(jī)分子組成的組。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用于捕獲靶分子和放大信號(hào)的金顆粒，其特征在于，所述捕 獲子為蛋白質(zhì)，通過肽鍵連接在所述連接部。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于捕獲靶分子和放大信號(hào)的金顆粒，其特征在于，所述信 號(hào)產(chǎn)生部的一端部為烷烴硫醇部位，通過金-硫(Au-S)鍵結(jié)合在所述金顆粒的表面，另一側(cè)具有醚末端部。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用于捕獲靶分子和放大信號(hào)的金顆粒，其特征在于，所述醚 末端部含有1個(gè)以上乙二醇單元。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于捕獲靶分子和放大信號(hào)的金顆粒，其特征在于，所述質(zhì) 量分析為激光解吸電離_飛行時(shí)間方式。
9.一種靶分子的分析系統(tǒng)，其特征在于，所述分析系統(tǒng)含有權(quán)利要求1 8任意一項(xiàng)的 金顆粒和表面能夠固定分析對(duì)象試樣的靶固定面，所述靶固定面具有固相的支撐體，所述支撐體的表面能夠通過共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵固定 用于分析是否存在靶分子的試樣。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的靶分子的分析系統(tǒng)，其特征在于，所述固相的支撐體選自由 玻璃、硅、金屬、半導(dǎo)體和塑料組成的組。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的靶分子的分析系統(tǒng)，其特征在于，所述靶固定面為生物芯片。
12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的靶分子的分析系統(tǒng)，其特征在于， 所述靶固定面具有多個(gè)信號(hào)產(chǎn)生部，其通過金-硫(Au-S)鍵與所述靶固定面的表面進(jìn)行連接，在所述表 面形成自組裝單分子層；1個(gè)以上的連接部，其結(jié)合在所述靶固定面的表面； 捕獲子，其連接在所述連接部，通過共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵固定靶分子； 所述信號(hào)產(chǎn)生部為在所述金顆粒的質(zhì)量分析過程中從所述金納米顆粒游離而生成多個(gè)質(zhì)量有別于靶分子和所述金顆粒的信號(hào)產(chǎn)生部的大小的有機(jī)陽離子的有機(jī)分子。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的靶分子的分析系統(tǒng)，其特征在于，所述靶固定面的信號(hào)產(chǎn) 生部含有醚末端部和連接在所述醚末端部且結(jié)合在所述金顆粒的表面的烷烴硫醇部。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的靶分子的分析系統(tǒng)，其特征在于，所述醚末端部含有1個(gè)以上乙二醇單元。
15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的靶分子的分析系統(tǒng)，其特征在于，所述金顆粒的捕獲子和 所述靶固定面的捕獲子為與所述靶分子特異性結(jié)合的相同抗體或互不相同抗體。
16.一種靶分子的質(zhì)量分析檢測(cè)方法，其為使用質(zhì)量分析來檢測(cè)試樣中是否存在靶分子的方法，包括下述階段 (i)使所述試樣與固相的支撐體接觸而獲得所述固相支撐體的表面上固定有試樣中的 物質(zhì)的靶固定面的階段；( )在連接在所述金顆粒的捕獲子可與靶分子特異性結(jié)合的條件下，使權(quán)利要求1 8中任意一項(xiàng)的金顆粒和所述靶固定面接觸而生成捕獲混合物的階段；(iii)從所述捕獲混合物除去非特異性結(jié)合的金顆粒的分選階段；以及(iv)所述第(iii)階段結(jié)束后，對(duì)捕獲混合物中殘存的金顆粒進(jìn)行質(zhì)量分析的階段。
17.—種靶分子的質(zhì)量分析檢測(cè)方法，其為使用質(zhì)量分析來檢測(cè)試樣中是否存在靶分 子的方法，所述方法包括如下階段(i)使所述試樣和權(quán)利要求1 8中任意一項(xiàng)的金顆粒與在固相支撐體的表面固定有 用于結(jié)合所述靶分子的捕獲子的捕獲固定面相互接觸，生成捕獲混合物的階段； ( )從所述捕獲混合物除去非特異性結(jié)合的金顆粒的分選階段；以及 (iii)所述第(ii)階段結(jié)束后，對(duì)捕獲混合物中殘存的金顆粒進(jìn)行質(zhì)量分析的階段。
18.根據(jù)權(quán)利要求16或17所述的靶分子的質(zhì)量分析檢測(cè)方法，其特征在于，所述除去 非特異性結(jié)合的金顆粒的階段包括洗滌所述捕獲混合物的步驟。
19.根據(jù)權(quán)利要求16或17所述的靶分子的質(zhì)量分析檢測(cè)方法，其特征在于，所述質(zhì)量 分析通過對(duì)所述捕獲混合物進(jìn)行無基質(zhì)方式的激光解吸電離而進(jìn)行。
20.根據(jù)權(quán)利要求16或17所述的靶分子的質(zhì)量分析檢測(cè)方法，其特征在于，所述質(zhì)量 分析通過基質(zhì)輔助激光解吸電離_飛行時(shí)間質(zhì)量分析而進(jìn)行。
21.根據(jù)權(quán)利要求16或17所述的靶分子的質(zhì)量分析檢測(cè)方法，其特征在于，在所述捕 獲混合物的分選階段和質(zhì)量分析階段之間，還包括從所述分選得到的捕獲混合物中分離金 顆粒的階段，所述質(zhì)量分析階段以所述分離出的金顆粒為對(duì)象。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的方式的質(zhì)量分析信號(hào)的放大技術(shù)。更具體而言，本發(fā)明中，提供發(fā)生信號(hào)的放大的新的方式的檢測(cè)方法和用于該方法的分析系統(tǒng)、以及放大用金顆粒；所述方法如下i)使表面改性后而能與靶分子選擇性結(jié)合的金顆粒、與期望確認(rèn)是否存在靶分子的試樣接觸后，ii)如果前述金顆粒和靶分子之間發(fā)生結(jié)合等相互作用，修飾前述金顆粒的低分子化合物則產(chǎn)生質(zhì)量分析信號(hào)，iii)即使是微量存在的靶分子，前述低分子化合物也能大規(guī)模產(chǎn)生質(zhì)量信號(hào)，從而發(fā)生信號(hào)的放大。根據(jù)本發(fā)明，不進(jìn)行試樣的預(yù)處理也能將期望的物質(zhì)的信號(hào)特異性放大，因此具有能夠簡(jiǎn)便且精密地測(cè)定靶分子的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/48GK101990638SQ200980112571
公開日2011年3月23日 申請(qǐng)日期2009年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月10日
發(fā)明者呂運(yùn)石, 樸炯淳, 李宙姬, 李壽載, 李政錄, 蘇相琓, 金光杓 申請(qǐng)人:普羅彼翁有限公司