專利名稱：測(cè)定染料、抗體、藥物和藥物前體分子在多肽分子上相對(duì)吸附常數(shù)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種利用掃描隧道顯微技 術(shù)Scanning Tunneling Microscopy, STM)測(cè)定染料、抗體、藥物和藥物前體等分子在多肽 上相對(duì)吸附常數(shù)的方法。
背景技術(shù)：
在藥物設(shè)計(jì)和開發(fā)研究中，解析靶標(biāo)蛋白與藥物相互作用的模式和結(jié)合本質(zhì)是 極其重要的，一般可以用高通量的蛋白質(zhì)結(jié)晶和高分辨的X射線晶體衍射技術(shù)、二維核磁 共振技術(shù)來(lái)進(jìn)行研究(可參考 Daniel Picot, Patrick J. Lollet al.，Nature 1994，367， 243. R Aneta Τ. Petkova, Yoshitaka Ishii et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 2002, 99，16742.)?，F(xiàn)在X射線晶體衍射技術(shù)已經(jīng)很成熟，但由于一些重要的蛋白(例如膜蛋白，淀粉 樣蛋白)分子本身的難結(jié)晶性，很難獲得高質(zhì)量的晶體學(xué)數(shù)據(jù)來(lái)研究藥物分子與蛋白的相 互作用。另外，即使獲得了蛋白和藥物分子的共結(jié)晶，藥物在靶標(biāo)蛋白上的結(jié)合位點(diǎn)也很難 保證具有周期性，所以解析藥物分子與蛋白的相互作用仍然困難重重。核磁共振技術(shù)可以 精確解析溶液中的分子結(jié)構(gòu)，避開了結(jié)晶的困難，但能解析的分子質(zhì)量有限制?，F(xiàn)也有大量研究基于超級(jí)計(jì)算機(jī)，進(jìn)行分子模擬并實(shí)現(xiàn)可視化，得以模擬蛋白與 蛋白或蛋白與小分子相互作用的動(dòng)態(tài)過(guò)程，解析藥物作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，并設(shè)計(jì)新的藥物分 子。但是計(jì)算機(jī)模擬與實(shí)驗(yàn)研究之間不可避免的存在著一些差距。所以急需發(fā)展實(shí)驗(yàn)研究 方法獲得藥物分子與蛋白或多肽相互作用的作用位點(diǎn)和直觀圖像，在分子尺度上研究藥物 分子在蛋白或多肽上的吸附能力。本發(fā)明發(fā)展了一種新方法，利用掃描隧道顯微技術(shù)測(cè)定 染料、抗體、藥物和藥物前體等待測(cè)分子在多肽上的相對(duì)吸附常數(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種測(cè)定待測(cè)分子在多肽分子上相對(duì)吸附常數(shù)的方法， 該方法包括如下步驟1)將多肽分子和標(biāo)記分子進(jìn)行組裝，獲得多肽分子與標(biāo)記分子的組裝體的掃描隧 道顯微鏡圖像；2)將多肽分子、標(biāo)記分子和待測(cè)分子進(jìn)行組裝，形成組裝體，以獲得所述待測(cè)分子 在多肽分子和標(biāo)記分子上吸附的掃描隧道顯微鏡圖像；3)對(duì)比步驟1)和步驟2)中獲得的掃描隧道顯微鏡圖像，統(tǒng)計(jì)待測(cè)分子吸附在多 肽分子以及標(biāo)記分子上的吸附數(shù)量；4)將步驟幻獲得的待測(cè)分子在標(biāo)記分子上的吸附數(shù)量歸一化為單位1，確定待測(cè) 分子在多肽分子上的相對(duì)吸附常數(shù)。優(yōu)選地，在所述步驟1)中，所述組裝體的制備方法包括如下步驟
i)將所述多肽分子與所述標(biāo)記分子充分混合，形成混合液；ii)將步驟i)得到的混合液滴加到導(dǎo)電性基底，例如石墨，金、銀、銅、鉬等金屬基 底以及硅等半導(dǎo)體基底表面，以形成組裝體。其中，多肽分子與標(biāo)記分子形成組裝體，可以除去溶劑在固/氣界面獲得組裝體 的掃描隧道顯微鏡圖像，也可保留溶劑在基底/溶液界面獲得組裝體的掃描隧道顯微鏡圖 像。優(yōu)選地，在所述步驟2、中，所述組裝體的制備方法包括如下步驟i)將所述多肽分子、所述標(biāo)記分子以及所述待測(cè)分子充分混合，形成混合液；ii)將步驟i)得到的混合液滴加到導(dǎo)電性基底，例如石墨，金、銀、銅、鉬等金屬基 底以及硅等半導(dǎo)體基底表面，以形成組裝體。其中，多肽分子、標(biāo)記分子以及待測(cè)分子形成組裝體，可以除去溶劑在固/氣界面 獲得組裝體的掃描隧道顯微鏡圖像，也可保留溶劑在基底/溶液界面獲得組裝體的掃描隧 道顯微鏡圖像。優(yōu)選地，在制備組裝體中，采用超聲來(lái)充分混合。優(yōu)選地，在制備組裝體中，所述導(dǎo)電性基底為石墨，所述石墨優(yōu)選為新解理的高定 向石墨。高定向石墨具有原子級(jí)平整的表面，而且在很多環(huán)境中都很穩(wěn)定，適于掃描隧道顯 微鏡的研究。優(yōu)選地，在制備組裝體中，還包括除去所述基底表面殘留液的步驟，優(yōu)選地，可以 采用吹惰性氣體(例如氮?dú)?的方式來(lái)除去所述基底表面的殘留液。其中，可以除去溶劑在固/氣界面獲得組裝體的掃描隧道顯微鏡圖像，也可保留 溶劑在基底/溶液界面獲得組裝體的掃描隧道顯微鏡圖像。優(yōu)選地，所述待測(cè)分子為染料、抗體、藥物或藥物前體分子等。優(yōu)選地，所述染料為酞菁、嚇啉類分子及其衍生物，剛果紅、硫磺素、姜黃素及其衍 生物；所述抗體為淀粉質(zhì)多肽分子抗體；所述藥物為吡啶、嘧啶、吡嗪、咪唑、吡咯等氮雜環(huán) 類分子及其衍生物，例如4’ 4-聯(lián)吡啶，乙烯吡啶，三吡啶，剛果紅，姜黃素；所述藥物前體為 硫磺素。優(yōu)選地，所述多肽分子為五聚丙氨酸、八聚苯丙氨酸和八聚組氨酸。本發(fā)明以五聚 丙氨酸、八聚苯丙氨酸和八聚組氨酸為例，其他多肽也可以，例如beta淀粉樣多肽及其片 段、胰淀素多肽及其片段、prion片段多肽、寡聚多肽、嵌段寡聚多肽、人工序列多肽等。優(yōu)選地，所述標(biāo)記分子為吡啶、嘧啶、吡嗪、咪唑、吡咯類氮雜環(huán)分子及其衍生物， 例如4’ 4-聯(lián)吡啶、乙烯吡啶，三吡啶、嘧啶等，優(yōu)選地，所述標(biāo)記分子為4’ 4-聯(lián)吡啶。綜上所述，本發(fā)明的目的在于發(fā)展一種基于掃描隧道顯微鏡的新方法，在分子水 平上研究蛋白或多肽與小分子的相互作用，測(cè)定染料、抗體、藥物和藥物前體等待測(cè)分子在 多肽上的相對(duì)吸附常數(shù)。在利用掃描隧道顯微鏡來(lái)測(cè)定染料、抗體、藥物和藥物前體等待測(cè)分子在多肽上 相對(duì)吸附常數(shù)的方法中，獲得多肽分子自組裝結(jié)構(gòu)的STM圖像之后，或通過(guò)與標(biāo)記分子的 共吸附獲得多肽-標(biāo)記分子的共組裝結(jié)構(gòu)的STM圖像之后，加入染料、抗體、藥物和藥物前 體等待測(cè)分子，得到待測(cè)分子在多肽上的結(jié)合位點(diǎn)和吸附數(shù)量，并在分子水平上研究多肽 和待測(cè)分子的相互作用，測(cè)定待測(cè)分子在多肽上相對(duì)吸附常數(shù)的方法。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案通過(guò)識(shí)別多肽分子組裝特征，來(lái)測(cè)定染料、抗體、藥物和藥 物前體等待測(cè)分子在多肽上相對(duì)吸附常數(shù)，包括如下步驟1)制備多肽分子(或與標(biāo)記分子共混)溶液，超聲10分鐘；2)在多肽分子的溶液中，或多肽分子與標(biāo)記分子的混合溶液中，加入染料、抗體、 藥物或藥物前體等待測(cè)分子溶液，使其充分混合；3)混合之后，取15微升溶液滴在新解理的高定向石墨表面，靜置10分鐘；4)用高純氮?dú)獍褮埩粼谑砻娴娜芤捍底撸?)用掃描隧道顯微鏡來(lái)進(jìn)行測(cè)定，統(tǒng)計(jì)出高分辨掃描隧道顯微鏡圖像中染料、抗 體、藥物或藥物前體等待測(cè)分子在多肽分子上的結(jié)合位點(diǎn)和吸附數(shù)量，并得到吸附常數(shù)的 相對(duì)關(guān)系。本發(fā)明至少具有以下有益效果本發(fā)明利用掃描隧道顯微鏡對(duì)染料、抗體、藥物或藥物前體等分子在多肽上的相 對(duì)吸附常數(shù)進(jìn)行測(cè)定，能清楚地識(shí)別多肽分子二維組裝的方向性，并在此基礎(chǔ)上，通過(guò)加入 染料、抗體、藥物或藥物前體分子后得到分子在多肽上的結(jié)合位點(diǎn)和吸附數(shù)量，并由此得到 不同多肽對(duì)于分子的相對(duì)吸附能力，即分子在多肽上的相對(duì)吸附常數(shù)。本發(fā)明利用掃描隧道顯微技術(shù)，可在分子水平上研究藥物分子與蛋白質(zhì)分子的相 互作用，藥物分子在蛋白分子上的作用位點(diǎn)和吸附能力，不受蛋白結(jié)晶性的影響，也不受結(jié) 合信號(hào)強(qiáng)弱的影響。本發(fā)明采用多肽分子與標(biāo)記分子形成組裝體，或者采用多肽分子、標(biāo)記分子以及 待測(cè)分子形成組裝體，可以除去溶劑在固/氣界面獲得組裝體的掃描隧道顯微鏡圖像，也 可保留溶劑在基底/溶液界面獲得組裝體的掃描隧道顯微鏡圖像。本發(fā)明采用的高定向石墨具有原子級(jí)平整的表面，在很多環(huán)境中都很穩(wěn)定，適于 掃描隧道顯微鏡的研究。本發(fā)明對(duì)于解析靶標(biāo)蛋白與藥物相互作用的模式和結(jié)合本質(zhì)具有 非常重要的意義。本發(fā)明可以用于在新藥早期研究階段中標(biāo)靶的確定，不同序列蛋白對(duì)于藥物分子 的吸附能力等的測(cè)試。特別在治療神經(jīng)退行性疾病中，研究淀粉樣蛋白的聚集機(jī)理及其與 藥物分子的相互作用機(jī)理，利用分子水平的證據(jù)來(lái)尋找可能的藥物靶點(diǎn)，從而對(duì)尋找和設(shè) 計(jì)有效的調(diào)節(jié)劑分子、藥物分子等提供指導(dǎo)。


圖1是三個(gè)模型多肽，五聚丙氨酸(5Ala)、八聚苯丙氨酸(SWie)和八聚組氨酸 (SHis)與4，4’ -聯(lián)吡啶分子GBpy)的共同組裝體的掃描隧道顯微鏡圖像；圖2是染料分子磺酸基酞菁在三種多肽-標(biāo)記分子組裝體上吸附的掃描隧道顯微 鏡圖像，其中，A和B表示在5Ala-4Bpy組裝體中，C和D表示在8Wie_4Bpy組裝體中，E表 示在8His-4Bpy組裝體中；圖3是從圖1和圖2的掃描隧道顯微鏡圖像中統(tǒng)計(jì)得到的染料分子磺酸基酞菁在 三種組裝體中的吸附數(shù)量；圖4是三種多肽組裝體對(duì)于染料分子磺酸基酞菁的不同吸附能力，即染料分子在 多肽分子上的相對(duì)吸附常數(shù)。將SPhe多肽分子對(duì)于染料分子的吸附能力歸一化為1時(shí)，SHis和5Ala多肽分子對(duì)于染料分子的吸附能力分別為10. 2和41. 8 ；圖5是藥物分子剛果紅在5Ala-4Bpy組裝體上吸附的掃描隧道顯微鏡圖像；圖6是從圖5的掃描隧道顯微鏡圖像中統(tǒng)計(jì)得到的剛果紅在多肽和4Bpy上的吸 附數(shù)量；圖7是藥物前體分子ThT在5Ala-4Bpy組裝體上吸附的掃描隧道顯微鏡圖像。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述。實(shí)施例1基于掃描隧道顯微鏡來(lái)測(cè)定染料分子在多肽上相對(duì)吸附常數(shù)1、所使用物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)多肽分子(5Ala、8Phe和8His)，吡啶類分子GBpy)和染料分子磺酸基酞菁的化學(xué)
結(jié)構(gòu)，如下所示
[
權(quán)利要求
1.一種測(cè)定待測(cè)分子在多肽分子上的相對(duì)吸附常數(shù)的方法，該方法包括如下步驟1)將多肽分子和標(biāo)記分子進(jìn)行組裝，獲得多肽分子與標(biāo)記分子的組裝體的掃描隧道顯 微鏡圖像；2)將多肽分子、標(biāo)記分子和待測(cè)分子進(jìn)行組裝，形成組裝體，以獲得所述待測(cè)分子在多 肽分子和標(biāo)記分子上吸附的掃描隧道顯微鏡圖像；3)對(duì)比步驟1)和步驟2)中獲得的掃描隧道顯微鏡圖像，統(tǒng)計(jì)待測(cè)分子吸附在多肽分 子以及標(biāo)記分子上的吸附數(shù)量；4)將步驟幻獲得的待測(cè)分子在標(biāo)記分子上的吸附數(shù)量歸一化為單位1，確定待測(cè)分子 在多肽分子上的相對(duì)吸附常數(shù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步驟1)中，所述組裝體的制備方法 包括如下步驟i)將所述多肽分子與所述標(biāo)記分子充分混合，形成混合液； )將步驟i)得到的混合液滴加到導(dǎo)電性基底，例如石墨，金、銀、銅、鉬等金屬基底以 及硅等半導(dǎo)體基底表面，以形成組裝體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步驟幻中，所述組裝體的制備方法 包括如下步驟i)將所述多肽分子、所述標(biāo)記分子以及所述待測(cè)分子充分混合，形成混合液； )將步驟i)得到的混合液滴加到導(dǎo)電性基底，例如石墨，金、銀、銅、鉬等金屬基底以 及硅等半導(dǎo)體基底表面，以形成組裝體。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于，在所述步驟i)中，采用超聲來(lái)充分混I=I ο
5.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于，在所述步驟ii)中，所述導(dǎo)電性基底 為石墨，所述石墨優(yōu)選為新解理的高定向石墨。
6.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于，在所述步驟ii)中，還包括除去所述 基底表面殘留液的步驟，優(yōu)選地，采用吹惰性氣體，例如氮?dú)獾姆绞絹?lái)除去所述基底表面的 殘留液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述待測(cè)分子為染料、抗體、藥物或藥物 前體分子。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述染料為酞菁、嚇啉類分子及其衍生 物，剛果紅、硫磺素、姜黃素及其衍生物；所述抗體為淀粉質(zhì)多肽分子抗體；所述藥物為吡 啶、嘧啶、吡嗪、咪唑、吡咯等氮雜環(huán)類分子及其衍生物，例如4’ 4-聯(lián)吡啶，乙烯吡啶，三吡 啶，剛果紅，姜黃素；所述藥物前體為硫磺素。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述多肽分子包括五聚丙氨酸、八聚苯丙 氨酸、八聚組氨酸、beta淀粉樣多肽及其片段、胰淀素多肽及其片段、prion片段多肽、寡聚 多肽、嵌段寡聚多肽和人工序列多肽，優(yōu)選地，所述多肽分子為五聚丙氨酸、八聚苯丙氨酸 和八聚組氨酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述標(biāo)記分子為吡啶、嘧啶、吡嗪、咪唑、 吡咯類氮雜環(huán)分子及其衍生物，例如4’ 4-聯(lián)吡啶、乙烯吡唆，三吡啶、嘧啶等，優(yōu)選地，所述 標(biāo)記分子為4’ 4-聯(lián)吡啶。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用掃描隧道顯微技術(shù)來(lái)測(cè)定染料、抗體、藥物和藥物前體等待測(cè)分子在多肽分子上的相對(duì)吸附常數(shù)的新方法。該方法涉及如下過(guò)程獲得多肽分子自組裝結(jié)構(gòu)的STM圖像之后，或通過(guò)與標(biāo)記分子的共吸附獲得多肽-標(biāo)記分子的共組裝結(jié)構(gòu)的STM圖像之后，加入染料、抗體、藥物和藥物前體等待測(cè)分子，得到待測(cè)分子在多肽上的結(jié)合位點(diǎn)和吸附數(shù)量，并在分子水平上研究多肽和待測(cè)分子的相互作用，測(cè)定待測(cè)分子在多肽上相對(duì)吸附常數(shù)的方法。本發(fā)明的方法對(duì)于解析靶標(biāo)蛋白與藥物的相互作用的模式和結(jié)合本質(zhì)具有非常重要的意義。
文檔編號(hào)G01N13/00GK102062718SQ20091023816
公開日2011年5月18日 申請(qǐng)日期2009年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月17日
發(fā)明者楊延蓮, 毛曉波, 王琛 申請(qǐng)人:國(guó)家納米科學(xué)中心