專利名稱：一種紅光檢測缺血修飾白蛋白的試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種紅光檢測缺血修飾白蛋白(IMA)的試劑盒及其檢測方法。 這種試劑盒及其檢測方法主要是將病人的生物樣品和第一試劑己知過量的二價金 屬離子溶液混合，混合液中含有與白蛋白結(jié)合的和未與白蛋白結(jié)合的金屬離子， 然后加入第二試劑pH8-10的金屬離子顯色劑溶液顯色或用IMA測試紙條顯色， 在紅光640-700nm波長檢測金屬離子顯色劑和未與白蛋白結(jié)合的鈷、鋅、銅離子 生成的藍(lán)色配合物或和鎳離子生成的綠色配合物的吸光度或反射光率，其測定值 可診斷病人是否中風(fēng)狀。
背景技術(shù)：
缺血通常是由于局部血管狹窄或阻塞導(dǎo)致組織器官的供氧能力下降，臨床上 常見的缺血性疾病有腦中風(fēng)(Stroke)、急性冠狀動脈綜合癥(Acute Coronary Syndrome，ACS)、下肢缺血性血管病變和肺栓塞等。
腦中風(fēng)是一種突然起病的腦血液循環(huán)障礙性疾病，是嚴(yán)重危害人類健康和生 命安全。我國每年發(fā)生中風(fēng)病人達(dá)200多萬，發(fā)病率高達(dá)120/10萬，致殘率高達(dá) 75%，死亡約120萬人。腦中風(fēng)的早期發(fā)現(xiàn)對預(yù)后極其重要，當(dāng)前腦中風(fēng)的主要 診斷手段是CT和核磁共振，但出現(xiàn)影像學(xué)的變化至少需要六至八小時，而搶救 的黃金時間是在六小時內(nèi)，因此迫切需要一種早期預(yù)警指標(biāo)，IMA是目前最有潛 力的腦中風(fēng)的早期檢測指標(biāo)之一，可用于中風(fēng)的早期診斷，降低致殘率和死亡率。
冠心病是中國人死亡的第二位原因。ACS是以冠狀動脈粥樣硬化斑塊破裂或 糜爛，繼發(fā)完全或不完全閉塞性血栓形成為病理基礎(chǔ)的一組臨床綜合征；其癥狀 包括胸痛、上腹部和臂部不適、喘氣、惡心和嘔吐等；常規(guī)心電圖檢測僅能發(fā)現(xiàn) 約50%的患者，容易漏診；臨床目前常用的肌鈣蛋白I對于ACS有較高的特異性， 但靈敏度較低，不利于ACS的早期篩査，IMA是目前國際上公認(rèn)的心肌缺血的早 期檢測指標(biāo)，可用于心肌缺血的診斷，提高對ACS的早期診斷及用于ACS危險 性分級，以降低對非缺血病人的收治率和心血管高危個體的漏診率，節(jié)省醫(yī)療資下肢缺血性血管病變主要分為下肢動脈硬化閉塞癥和深靜脈血栓，目前我國 60歲以上血管病變的發(fā)病率高達(dá)79.9%，而70歲以上的發(fā)病率幾乎接近100%。 下肢動脈硬化閉塞癥的主要原因為下肢中小動脈狹窄或閉塞引起的供血不足導(dǎo) 致的壞死，主要表現(xiàn)為患者肢端因缺血壞死而發(fā)生壞疽，嚴(yán)重者須截肢。下肢深 靜脈血栓是由于血凝塊堵塞深靜脈，導(dǎo)致靜脈回流嚴(yán)重受阻，從而使受堵塞的肢 體其遠(yuǎn)端的腫脹疼痛，是肺栓塞的主要危險因素。據(jù)統(tǒng)計，美國每年肺栓塞發(fā)病 率約60萬，三分之一死亡，占死因第三位。約20 30%患者未及時或未能獲診 斷和治療而死亡，若能及時診斷和給予抗凝治療，病死率可望降低。因此對下肢 缺血和肺栓塞的早期診斷是十分必要的，但目前除超聲、CT等影像學(xué)外急需一 種生化檢測手段協(xié)助臨床醫(yī)師診斷，研究表明IMA對兩者有重要的輔助診斷價值。
綜上所述，在腦中風(fēng)、急性冠狀動脈綜合征、下肢缺血性血管病變和肺栓塞 等缺血性疾病早期診斷方面，IMA是理想的輔助診斷指標(biāo)。IMA在缺血數(shù)分鐘內(nèi)就 可升高，可衡量與缺血組織接觸的白蛋白改變程度，IMA在心肌缺血時就升高， 能在缺血緩解后高水平維持?jǐn)?shù)小時，不象其它心肌標(biāo)志物在壞死時才出現(xiàn)。已知 報道有美國Bar-Or D等(US7， 070， 937, 2006年)發(fā)明的IMA檢測試劑盒， 其基本原理為正常對照組的樣品中白蛋白以活性形式存在，加入過度已知量的 鈷離子溶液后，鈷離子即可與白蛋白結(jié)合，溶液中未結(jié)合的鈷離子濃度較低；而 缺血病人的樣品中含有較多缺血修飾白蛋白，由于IMA與鈷離子結(jié)合的能力弱， 溶液中就存在較高濃度的未結(jié)合的鈷離子，采用二硫蘇糖醇(DTT)顯色劑顯色, 檢測未與白蛋白結(jié)合的鈷離子，在450-500nm波長檢測樣品的吸光度，所得數(shù)據(jù) 與己知標(biāo)準(zhǔn)IMA曲線進(jìn)行對照，即可得出IMA值。但是美國Bar-Or D方法在 450-500nm波長檢測IMA不能避免蛋白質(zhì)特別是白蛋白、脂血、血紅蛋白和膽紅 素等物質(zhì)的嚴(yán)重干擾，影響靈敏度和特異性，限止了推廣使用，因此開發(fā)一種新 的IMA檢測試劑盒及其檢測方法，是臨床上迫切需要的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種紅光檢測缺血修飾白蛋白的試劑盒及其檢測方法。這種試劑 盒及其檢測方法主要是將病人的生物樣品和第一試劑己知過量的二價金屬離子 鈷、鋅、銅或鎳溶液混合，混合液中含有與白蛋白結(jié)合的和未與白蛋白結(jié)合的金 屬離子，然后加入第二試劑pH8-10的金屬離子顯色劑溶液顯色或用IMA測試紙 條顯色，在紅光640-700nm波長檢測金屬離子顯色劑和未與白蛋白結(jié)合的鈷、鋅、銅離子形成的藍(lán)色配合物或和鎳離子形成的綠色配合物的吸光度或反射光率，其測定值可診斷病人是否有缺血癥狀。并由于本檢測方法能避免樣品中千擾物的影響，使測定值更接近真值。
本發(fā)明紅光檢測缺血修飾白蛋白試劑盒是由第一試劑二價金屬離子鈷、鋅、銅或鎳溶液(10.00-60.00mg/100ml)和第二試劑由pH8-10氨水-氯化銨緩沖液配制的0.10-3.00 mg/ml金屬離子顯色劑溶液或用第二試劑顯色的IMA測試紙條組成。IMA測試紙條1 (參見圖1)的結(jié)構(gòu)包括顯色紙塊2和作為底層的條狀硬質(zhì)塑料襯墊3，將紙塊通過pH8-10氨水-氯化銨緩沖液配制的0.10-3.00 mg/ml金屬離子顯色劑溶液浸潤干燥后制成顯色紙塊2，然后將顯色紙塊2粘貼在條狀硬質(zhì)塑料襯墊3上，即成IMA測試紙條1。檢測的基本原理為將病人生物樣品如全血、血清、血漿、體液或組織液和第一試劑已知過量的二價金屬離子溶液混合形成混合液，然后加入第二試劑由氨水-氯化銨緩沖液配制的pH8-10的金屬離子顯色劑溶液顯色，或?qū)⑺龌旌弦旱渭釉贗MA測試紙條上顯色。正常對照組樣品中的白蛋白以活性形式存在，在和第一試劑已知過量的二價金屬離子溶液混合后，混合液中未與白蛋白結(jié)合的金屬離子的數(shù)量較少，而心肌缺血病人含有較多的缺血修飾白蛋白，由于IMA與金屬離子結(jié)合的能力弱，混合液中存在較多數(shù)量的未與白蛋白結(jié)合的金屬離子。第二試劑pH8-10的金屬離子顯色劑溶液或IMA測試紙條上顯色紙塊中的金屬離子顯色劑能和未與白蛋白結(jié)合的鈷、鋅、銅離子形成的藍(lán)色配合物或和鎳離子形成的綠色配合物，在紅光640-700nm處采用分光光度比色儀檢測樣品的吸光度或采用反射光率檢測儀檢測反射光率，所得數(shù)值與一已知標(biāo)準(zhǔn)IMA曲線進(jìn)行對照，即可得到IMA值，其測定值用每毫升單位(U/ml)表示。在紅光波長檢測時，樣品中的蛋白質(zhì)特別是白蛋白、血紅蛋白、脂血和膽紅素等幾乎沒有吸收，在此條件下的檢測結(jié)果是更接近真值。
本發(fā)明紅光檢測缺血修飾白蛋白試劑盒的檢測方法，檢測IMA方法的步驟如下(參見圖2): (1)將病人的生物樣品如全血、血清、血漿、體液或組織液和第一試劑已知過量的二價金屬離子鈷、鋅、銅或鎳溶液(10.00-60.00mg/100ml)混合，混合液中含有與白蛋白結(jié)合的和未與白蛋白結(jié)合的金屬離子，18-37 °C孵育5分鐘；(2)然后加入第二試劑由pH8-10氨水-氯化銨緩沖液配制的0.10-3.00mg/ml金屬離子顯色劑溶液顯色或?qū)⒒旌弦旱渭釉贗MA測試紙條上顯色，金屬離子顯色劑和未與白蛋白結(jié)合的鈷、鋅、銅離子生成藍(lán)色配合物或和鎳離子生成綠色配合物，18-37 °C孵育5-10分鐘；(3)在紅光640-700nm波長測定生成的有色配合物的吸光度或反射光率；(4)所得數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)曲線相對照，即可得到IMA值，其測定值用每毫升單位(U/ml)表示，以診斷病人是否有缺血癥狀。
第(1)步中所述二價金屬離子是指鈷、鋅、銅或鎳的金屬鹽離子；所述混合液中除了含有與白蛋白結(jié)合的和未與白蛋白結(jié)合的金屬離子外，還有所有的以自然形式出現(xiàn)的白蛋白、缺血修飾白蛋白、脂血、血紅蛋白和膽紅素等對本發(fā)明IMA
檢測方法能避免受其影響的干擾物質(zhì)。第(2)步中所述金屬離子顯色劑是
(a) 能和二價鈷離子反應(yīng)生成藍(lán)色配合物的苦胺酸偶氮變色酸(3- (2-羥基-3， 5-二硝基苯)偶氮-4， 5二羥基-2， 7-萘二磺酸，Picramine CA,潘教麥等，《新顯色劑及其在光度分析中的應(yīng)用》，化學(xué)工業(yè)出版社，2003年，P73)，或吡啶偶氮變色酸(2-(2'-(5-硝基-吡啶)-偶氮)-4， 5 二羥基-2， 7-萘二磺酸，5-N02-PACA，石雪萍等，西北大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)2007，Vol.37，No.5，P763-766);
(b) 能和二價銅離子反應(yīng)生成藍(lán)色配合物的間氯偶氮氨替比林(MCAA，康新平等，新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報2003， Dec., 26(6)， PP552-553 );
(c) 能和二價鋅和銅離子反應(yīng)生成藍(lán)色配合物的1,5-(2-羥基-5-溴基)-3-氰基
甲^(鋅離子潘教麥等，《新顯色劑及其在光度分析中的應(yīng)用》，化學(xué)工業(yè)出版社，2003年，P232;銅離子吳鵬等，理化檢驗-化學(xué)分析分冊2004， Vol.40 ， No.9， PP541-545);
(d) 能和二價鎳離子反應(yīng)生成綠色配合物的對硝基重氮氨基喹啉基偶氮喹啉(NQAQ，潘教麥等，《新顯色劑及其在光度分析中的應(yīng)用》，化學(xué)工業(yè)出版社，
2003年，P177)。
第(3)步中采用紅光640-700nm波長測定由氨水-氯化銨緩沖液配制的pH8-10的金屬離子顯色劑或IMA測試紙條上顯色紙塊2中的金屬離子顯色劑能和未與白蛋白結(jié)合的鈷、鋅、銅離子生成的藍(lán)色配合物或和鎳離子生成的綠色配合物的吸光度或反射光率，樣品中未和白蛋白結(jié)合的金屬離子的量和吸光度值成正比，但和反射光率成反比。在這樣的測定條件下能避免樣品中白蛋白、缺血修飾白蛋白、脂血、血紅蛋白和膽紅素等物質(zhì)對IMA檢測的干擾。
現(xiàn)有生化試劑所用顯色劑，大都發(fā)明于上世紀(jì)二三十年代，比色波長集中在340-600nm范圍。1993年美國印地安那大學(xué)MR Glick和KW Ryde己發(fā)表文章呼吁要重視來自溶血、黃疸和脂血標(biāo)本引起的生化檢測結(jié)果不正確(KW Ryder andMRGlick， Clin.Chem.， Jan 1993; 39: 175 — 176)。正如美國Bar-Or D等的IMA
檢測試劑盒采用二硫蘇糖醇為顯色劑，以青藍(lán)光450-500nm波長檢測未與白蛋白結(jié)合的鈷離子，顯色產(chǎn)物為棕色，不能避免常見的生化檢測的干擾物質(zhì)如脂血、血紅蛋白、膽紅素引起的背景干擾(參見圖3)。除此以外各種形式的白蛋白，包含所有的以自然形式出現(xiàn)的白蛋白，白蛋白-金屬復(fù)合物和缺血修飾白蛋白也會對IMA檢測形成干擾，降低IMA檢測的靈敏度和特異性(中國專利CN101013137A )。美國希曼國際公司(Synermed International Inc.)在其網(wǎng)頁上(http:〃www.svnermedinc.com/revolution.php)介紹當(dāng)樣品在640-800nm波長比色時，樣品中的蛋白質(zhì)特別是白蛋白、血紅蛋白、膽紅素等幾乎沒有被吸收，脂質(zhì)顆粒和潛伏性混濁(如甘油三脂等)不會導(dǎo)致入射光的散射和折射，在此條件下的比色結(jié)果理論上更接近真值。在紅光或近紅外光640-800nm波長檢測其顯色產(chǎn)物須呈藍(lán)色或綠色，但現(xiàn)有技術(shù)中采用的DTT顯色產(chǎn)物為棕色，不具備在640-800nm波長比色的條件。本發(fā)明采用的金屬離子顯色劑在堿性特別是在氨性的條件下在紅光640-700nm波長有最大吸收峰或互補(bǔ)的最小反射光率，檢測該金屬離子顯色劑和未與白蛋白結(jié)合的鈷、鋅、銅離子生成的藍(lán)色配合物或和鎳離子生成的綠色配合物的吸光度或反射光率，顏色強(qiáng)度可反映未與白蛋白結(jié)合的金屬離子的數(shù)量。本發(fā)明由于選擇在紅光640-700nm波長檢測(參見圖3和美國希曼國際公司的網(wǎng)頁)，避免了樣品中如脂血、白蛋白、血紅蛋白、膽紅素等干擾物的影響，使比色結(jié)果更接近真值。
第(4)步中所述標(biāo)準(zhǔn)曲線是以缺血和對照組樣品建立的動力學(xué)曲線為依據(jù)。使用本發(fā)明紅光檢測缺血修飾白蛋白的試劑盒檢測IMA時，應(yīng)使用試劑盒附件提供的校準(zhǔn)品和質(zhì)控品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線和用于日常的質(zhì)量控制。本發(fā)明使用性能穩(wěn)定的化學(xué)試劑金屬離子螯合劑EDTA鈉(乙二胺四乙酸鈉)替代樣品血清或白蛋白作量值轉(zhuǎn)移建立校準(zhǔn)品和質(zhì)控品。將不同濃度的EDTA鈉和第一試劑已知過量的二價金屬離子溶液混合，后續(xù)的檢測與樣品血清的測試完全一樣，但在紅光640-700nm波長檢測的是金屬離子顯色劑和未與EDTA鈉結(jié)合的鈷、鋅、銅離子生成的藍(lán)色配合物或和鎳離子生成的綠色配合物。用戶可在各種類型的分光光度比色儀、大中小型全自動生化分析儀或反射光率檢測儀上將本發(fā)明IMA檢測試劑盒所測得的校準(zhǔn)品數(shù)據(jù)和標(biāo)示的IMA單位，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于病人樣品的IMA結(jié)果的計算；IMA質(zhì)控品分為低、中和高值三種，其標(biāo)示的IMA數(shù)值是一個范 圍，如應(yīng)用本發(fā)明試劑盒所測得數(shù)值在該質(zhì)控品所標(biāo)示的范圍內(nèi)，就說明整個檢 測系統(tǒng)操作正常。
本發(fā)明IMA試劑盒在堿性特別是在氨性條件下采用紅光波長檢測未和白蛋白 結(jié)合的鈷、鋅、銅離子生成的藍(lán)色配合物或和鎳離子生成的綠色配合物的吸光度 或反射光率，所得數(shù)值大小可診斷病人是否有缺血癥狀。腦中風(fēng)的早期診斷對于 治療方案的制定和愈后是極其重要的，而CT和核磁共振需要六至八小時后才能 出現(xiàn)影像學(xué)的變化，臨床也可用腰椎穿刺來作鑒別診斷，但需要一定的技術(shù)條件， 目前還沒有適合腦中風(fēng)早期診斷的試劑，而IMA在中風(fēng)發(fā)作后5—10分鐘血中濃 度即可升高，可結(jié)合臨床癥狀做出早期診斷。早期胸痛病人半數(shù)以上的患者無明 顯癥狀和體征，心肌損傷標(biāo)志物多為陰性，ECG無顯著變化，處于ACS診斷的 "灰?guī)?，而IMA與傳統(tǒng)的心肌壞死指標(biāo)不同，在缺血發(fā)作后5—10分鐘血中濃 度即可升高，IMA的測定有利于ACS早期診斷，還可結(jié)合心肌鈣蛋白指標(biāo)用于 ACS的篩查和危險性分級；作出是否留院的決定。磁共振血管造影(MRA)是下 肢缺血性血管病變理想的檢查手段，但不能作為一個普查手段，而IMA在下肢缺 血的早期濃度即可升高，可用作嚴(yán)重缺血性血管病變的早期篩查，因而有利于早 期診治。核素肺通氣/灌注掃描和肺動脈造影是診斷肺栓塞的靈敏或特異的檢查手 段，但這些技術(shù)需要一定的設(shè)備條件，IMA測定可用于肺栓塞的早期診斷。 本發(fā)明紅光檢測缺血修飾白蛋白的試劑盒及其檢測方法的優(yōu)點
(1) 開發(fā)了一種適合床邊診斷的快速檢測IMA方法
腦中風(fēng)、ACS、下肢缺血性血管病變和肺栓塞等疾病病情險惡，需要快速作出 診斷以利于贏得寶貴的時間及時治療。本發(fā)明可方便地使用全血檢測，步驟簡單， 試劑盒是由第一試劑二價金屬離子溶液，和將互相不會發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的堿性特別 是氨性緩沖液和顯色劑溶液合二為一的第二試劑或用第二試劑顯色的IMA測試 紙條組成，反應(yīng)時間短，僅需要15分鐘左右的時間。利用一般醫(yī)院的常規(guī)設(shè)備， 在全自動生化分析儀、小型的分光光度比色儀或反射光率檢測儀上都可完成測試， 為臨床開發(fā)了一種快速檢測IMA的方法。
(2) 避免樣品中干擾物的影響，為臨床診斷提供有力的依據(jù) 本發(fā)明是一種檢測缺血修飾白蛋白的試劑盒及其檢測方法，選擇在堿性特別
是氨性條件下采用紅光640-700nm波長檢測金屬離子顯色劑和鈷、鋅、銅離子生成的藍(lán)色配合物或和鎳離子生成的綠色配合物的吸光度，被測樣品中的蛋白質(zhì)特 別是白蛋白、血紅蛋白、膽紅素等幾乎沒有干擾，脂質(zhì)顆粒和潛伏性混濁(如甘 油三脂等)基本上也不會導(dǎo)致入射光的散射和折射，在此條件下避免了樣品中干 擾物的影響，使測定結(jié)果更接近真值，為臨床診斷提供有力的依據(jù)。 (3)能明顯提高IMA檢測試劑盒和檢測方法的靈敏度和特異性 由于本發(fā)明選用的金屬離子顯色劑具有靈敏度高和選擇性強(qiáng)的特點，因此 能明顯提高IMA檢測試劑盒和檢測方法的靈敏度和特異性。因為缺血和正常人樣 品中未和白蛋白結(jié)合的金屬離子數(shù)量變化差別不是很大，所以顯色劑必須要求靈 敏度高。同時由于樣品中含有的各種微量元素較多，因此顯色劑也必須要有較強(qiáng) 的選擇性，特別是不受樣品中含量較高的鉀、鈉、鈣和鐵等元素的干擾。 (4)為IMA檢測開發(fā)了一種性能穩(wěn)定的IMA檢測試劑盒 本發(fā)明采用的金屬離子顯色劑是一種性能優(yōu)良的色原體，以苦胺酸偶氮變色 酸結(jié)構(gòu)(參見圖4)為例其中的偶氮基為有顏色的"生色基團(tuán)"4，偶氮基的 兩端與芳烴碳原子相連；芳烴環(huán)鄰位的羥基為能參與形成金屬配位物的"官能團(tuán)" 5;芳烴環(huán)其他位置引入的取代基為能改變試劑本身顏色和影響試劑分析性能的 "助色基團(tuán)"6，這些基團(tuán)使得金屬離子顯色劑具有性能穩(wěn)定，反應(yīng)迅速，靈敏 度高和選擇性強(qiáng)等特點，并且可以常溫保存，有利于IMA試劑的運輸和保存，是 一種性能穩(wěn)定的IMA檢測試劑盒，又IMA檢測試劑盒成本低廉，是一個很有開 發(fā)前景的產(chǎn)品。


圖1本發(fā)明IMA測試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2本發(fā)明使用紅光檢測缺血修飾白蛋白試劑盒檢測IMA方法的示意圖。
圖3脂血、血紅蛋白、膽紅素樣品在300-800nm波長范圍內(nèi)非特異性吸收的 的吸光度變化(弓l自美國希曼國際公司(Synermed International Inc.)網(wǎng)頁 http:〃www.synermedinc.com/revolution.php )。
圖4金屬離子顯色劑苦胺酸偶氮變色酸的結(jié)構(gòu)作為色原體中的"生色基團(tuán)"， "官能團(tuán)"和"助色基團(tuán)"的示意圖。
圖5吡啶偶氮變色酸-鈷離子IMA檢測試劑盒建立的IMA標(biāo)準(zhǔn)動力學(xué)曲線圖。
具體實施例方式
實施例1 吡啶偶氮變色酸-鈷離子IMA檢測試劑盒在Laola FAITH-1020全 自動生化分析儀上建立IMA標(biāo)準(zhǔn)曲線、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品和檢測IMA
吡啶偶氮變色酸-鈷離子IMA試劑盒由第一試劑鈷離子溶液(CoCl2 6H20， 23.5mg/100ml)和第二試劑由pHIO氨水-氯化銨緩沖溶液(25pl/ml氨水，1.2mg/ml 氯化銨)配制的吡啶偶氮變色酸(0.12mg/ml)溶液組成。
選取40例心肌缺血樣品選自cTn I陽性或ECG ST波段波動的急性胸痛急診 病人，IOO例對照組樣品選自35歲以上，無糖尿病，高血壓，高血脂，高膽固醇 病史。血液被抽入促凝管中，十分鐘后，將凝集的血液離心分離血清。然后將樣 品血清加入樣品杯中放入樣品盤中指定的樣品測試位并編號，同時將標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì) 控品放入樣品盤指定的位置，將第一試劑和第二試劑分別放入相對應(yīng)的試劑槽中， 指令機(jī)器不做試劑空白，所謂試劑空白就是以水代替樣品血清所做的測試，但依 據(jù)本發(fā)明反應(yīng)原理，第一試劑中所有的鈷離子都將參于和第二試劑顯色劑的反應(yīng)， 因而所得吸光度是最高值，這樣標(biāo)準(zhǔn)品和樣品血清的吸光度將低于試劑空白，這 樣所得標(biāo)準(zhǔn)曲線是倒置的，吸光度高，IMA反而低，因此本試劑盒不適合做試劑 空白。本測試采用終點法選取兩點測吸光度，測試程序是先吸樣品血清(或標(biāo)準(zhǔn) 品、質(zhì)控品)25W和第一試劑25pl加入比色杯中混勻，37r孵育五分鐘，然后 加入第二試劑25(HU混勻后在15點讀取(主波長660nm，副波長800nm)第一個 OD值作為試劑本底，37'C孵育十分鐘后在41點讀取測第二個OD值，第二個 OD值扣去試劑本底OD值后即為樣品的吸光度。
100例正常人對照組平均OD值為0.654±0.047， 40例心肌缺血對照組平均 OD值為0.938±0.151, IMA在正常人群中呈正態(tài)分布，范圍(42-78 U/ml)，第 95百分位數(shù)定為75 U/ml。所得數(shù)據(jù)作回歸分析繪制標(biāo)準(zhǔn)動力學(xué)曲線(見圖3)， 并得到回歸方程Y=99.548x+1.2538。
校準(zhǔn)品和質(zhì)控品是以已知的動力學(xué)曲線為依據(jù),使用EDTA鈉(乙二胺四乙 酸鈉)替代血清或白蛋白而建立，校準(zhǔn)品和質(zhì)控品化學(xué)性能穩(wěn)定，可用于日常質(zhì)量 管理。在校準(zhǔn)品和質(zhì)控品檢測體系里面，EDTA鈉濃度越低，未結(jié)合的金屬離子 就越多，吸光度就越高，相反，EDTA鈉濃度越高，吸光度也就越低，因此EDTA 鈉的濃度和吸光度成反比關(guān)系，EDTA鈉配置濃度見下表1:表l
標(biāo)準(zhǔn)/質(zhì)控品EDTA濃度(mol/L)OD值IMA單位(u/ml)
標(biāo)10扁930.37640
標(biāo)20扁800.59660
標(biāo)30扁630.86085
標(biāo)40扁501.138115
標(biāo)50.001801.387140
質(zhì)控l0細(xì)850.45150
質(zhì)控20細(xì)550.923100
質(zhì)控30.002101.254130
閂常先運行標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行儲存，如果所測質(zhì)控品的數(shù)值在質(zhì)控
品所標(biāo)示的范圍內(nèi)，質(zhì)控通過，然后就可運行病人樣品，所得OD值與標(biāo)準(zhǔn)曲線 進(jìn)行對照，即可測得IMA值并打印結(jié)果，其測定值用每毫升單位(U/ml)表示。 如病人的IMA值高于臨界值就為IMA陽性，測得的IMA值可為臨床醫(yī)生診斷心 肌缺血的癥狀。
實施例2對硝基重氮氨基喹啉基偶氮喹啉-鎳離子IMA試劑盒應(yīng)用于ACS 的診斷及ACS危險性分級
對硝基重氮氨基喹啉基偶氮喹啉-鎳離子IMA試劑盒由單人份包裝的含80pl 第一試劑的二價鎳離子溶液(NiCl2'6H20， 55.0 mg/100ml)的帶蓋小試管(兼 比色管)和含l，OOOpl第二試劑由pH9.0氨水-氯化銨緩沖溶液(20pl/ml氨水， 7.0mg/ml氯化銨)配制的對硝基重氮氨基喹啉偶氮喹啉(O.lOmg/ml)溶液的帶蓋 小試管組成，用于全血檢測。
將病人血液被抽入含肝素鈉的抗凝試管中，打開第一試劑的封蓋，將8(Hil 被測全血加入第一試劑管中混勻，室溫孵育五分鐘，然后打開第二試劑的封蓋將 其全部倒入第一試劑管中混勻，放入比色儀的比色孔中，室溫孵育十分鐘后以空氣 調(diào)零測定樣品的OD值(光徑lcm，波長670nm)。所得OD值與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行對 照，即可測得IMA值，其測定值用每毫升單位(U/ml)表示。如病人的IMA值 高于臨界值就為IMA陽性，測得的IMA值可為臨床醫(yī)生診斷心肌缺血級。如采用己有技術(shù)檢測IMA，則有21名患者IMA陽性被升級，而采用本發(fā)明對硝基重 氮氨基喹啉基偶氮喹啉-鎳離子IMA檢測試劑盒，則有26名患者IMA陽性被升 級，其中18例和現(xiàn)有技術(shù)結(jié)果相符，8例為新發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有技術(shù)有3例降為陰性， 而所有排除為IMA陰性患者均未發(fā)生ACS，顯示本發(fā)明試劑盒相對于已有技術(shù) 提高了靈敏度和特異性，可以更加有效地將患者分成高風(fēng)險組和低風(fēng)險組。
實施例3 1,5-(2-羥基-5-溴基)-3-氰基甲澄-鋅離子IMA試劑盒聯(lián)合和肌鈣 蛋白I用于高危胸痛病人的ACS篩査
1，5-(2-羥基-5-溴基)-3-氰基甲潛-鋅離子IMA試劑盒由第一試劑鋅離子溶液 (ZnS04 '7H2O，24.8mg/100ml)和第二試劑由pH9.2氨水-氯化銨緩沖溶液((21nl/ml 氨水，6.5mg/ml氯化銨)配制的1,5-(2-羥基-5-溴基)-3-氰基甲'暨(0.125 mg/ml) 溶液組成。
高危胸痛病人血液被抽入促凝試管中，十分鐘后將凝集的血液離心分離血 清。將100pl被測血清加入微量比色杯中，然后加入lOOpl第一試劑混勻，室溫 孵育五分鐘，然后加入第二試劑l,OOOW混勻，室溫孵育十分鐘后采用比色儀， 以空氣調(diào)零測定樣品的OD值(光徑lcm，波長660nm)。所得OD值與標(biāo)準(zhǔn)曲線 進(jìn)行對照，即可測得IMA值，其測定值用每毫升單位(U/ml)表示。
肌鈣蛋白I是重要的心肌標(biāo)志物，對ACS的特異性高達(dá)99%以上，但其對 ACS的靈敏度不到50%，采用1,5-(2-羥基-5-溴基)-3-氰基甲澄-鋅離子IMA試劑 盒聯(lián)合肌鈣蛋白I用于高危胸痛病人的ACS篩查，測一百三十例急診胸痛病人, 如單獨采用肌鈣蛋白I檢測，靈敏度僅為49%，如聯(lián)合IMA使用，靈敏度則可高 達(dá)91%，所以IMA聯(lián)合肌鈣蛋白I將是高危胸痛診斷流程對于ACS的重要診斷 工具。
實施例4間氯偶氮氨替比林-銅離子IMA試劑盒用于腦中風(fēng)的早期診斷 間氯偶氮氨替比林-銅離子IMA試劑盒由第一試劑銅離子溶液(CuS04 6H20， 24.8mg/100ml)和第二試劑由pH9.4氨水-氯化銨緩沖溶液((22pl/ml氨水， 5.4mg/ml氯化銨)配制的間氯偶氮氨替比林(0.135 mg/ml)溶液組成。
106例腦中風(fēng)(含腦缺血和腦出血)病人和43例正常人對照組血液被抽入促 凝試管中，十分鐘后將凝集的血液離心分離血清。將ioow被測血清加入微量比 色杯中，然后加入100nl第一試劑混勻，室溫孵育五分鐘，然后加入第二試劑 l,OOOW混勻，室溫孵育十分鐘后采用比色儀，以空氣調(diào)零測定樣品的OD值(光徑lcm，波長660nm)。所得OD值與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行對照，即可測得IMA值，其 測定值用每毫升單位(U/ml)表示。
結(jié)果顯示106例腦中風(fēng)病人中，52例腦缺血病人的IMA平均值為102.5 U/ml， 54例腦出血病人(含蛛網(wǎng)膜下腔出血和顱內(nèi)出血)的IMA平均值為101.6 U/ml， 均高于正常人對照組(IMA平均值為45.6 U/ml)，但腦缺血和腦出血病人的IMA 值沒有顯著差異(P>0.05)。
實施例5 1,5-(2-羥基-5-溴基)-3-氰基甲暨-銅離子IMA測試紙條試劑盒用于 下肢動脈硬化閉塞癥的篩査
1，5-(2-羥基-5-溴基)-3-氰基甲整-銅離子IMA測試條試劑盒由100pl裝于帶蓋 小試管中的第一試劑銅離子溶液(CuS04 *5H20, 24.8mg/100ml，和用第二試劑由 pH9.6氨水-氯化銨緩沖溶液((23pl/ml氨水，4.3 mg/ml氯化銨)配制的1,5-(2-羥 基-5-溴基)-3-氰基甲澄(0.125 mg/ml)顯色劑溶液為顯色劑的IMA測試紙條(參 見圖1)組成。
選取200例年齡在55-70歲之間，病程在輕微主訴期和間歇性跛行期的病人， 病人血液被抽入促凝試管中，十分鐘后將凝集的血液離心分離血清。將lOOpl被 測血清加入第一試劑小試管中混勻，室溫孵育五分鐘，然后取混合液滴入到 IMA測試紙條1 (參見圖l)中的顯色紙塊2上，室溫孵育十分鐘后，采用反射 光率檢測儀以空氣調(diào)零測定樣品的反射光率(波長660nm)，陽性標(biāo)本顏色深， 反射光率低，陰性標(biāo)本顏色淺，反射光率高，所得反射光率與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行對照， 即可測得IMA值，其測定值用每毫升單位(U/ml)表示。
結(jié)果顯示靈敏度高達(dá)100 %， IMA平均值為110.6 U/ml與磁共振血管造影 (MRA)檢査結(jié)果的符合率達(dá)到96%。
實施例6苦胺酸偶氮變色酸-鈷離子IMA試劑盒用于肺栓塞的早期診斷 苦胺酸偶氮變色酸-鈷離子IMA試劑盒由第一試劑鈷離子溶液(CoCl2 6H20， 24mg/100ml)和第二試劑由pH9.8氨水-氯化銨緩沖溶液((24jil/ml氨水，3.2 mg/ml 氯化銨)配制的苦胺酸偶氮變色酸(0.12mg/ml)溶液組成。
選取120例有肺栓塞的臨床表現(xiàn)的病人血液被抽入促凝試管中，十分鐘后將 凝集的血液離心分離血清。將100^1被測血清加入微量比色杯中，然后加入lO(Hil 第一試劑混勻，室溫孵育五分鐘，然后加入第二試劑l，OOOpl混勻，室溫孵育十 分鐘后采用比色儀，以空氣調(diào)零測定樣品的OD值(光徑lcm，波長650nm)。所得OD值與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行對照，即可測得IMA值，其測定值用每毫升單位(U/ml) 表示。
結(jié)果顯示靈敏度高達(dá)100%, IMA平均值為113.5 U/ml，與肺動脈造影檢查 結(jié)果的符合率達(dá)到98%。
權(quán)利要求
1.一種紅光檢測缺血修飾白蛋白的試劑盒，其特征在于試劑盒是由第一試劑二價金屬離子鈷、鋅、銅或鎳溶液10.00-60.00mg/100ml和第二試劑由pH8-10氨水-氯化銨緩沖液配制的0.10-3.00mg/ml金屬離子顯色劑溶液，或用第二試劑顯色的IMA測試紙條(1)組成。
2. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的IMA測試紙條(1)的結(jié) 構(gòu)包括將紙塊通過pH8-10氨水-氯化銨緩沖液配制的0.10-3.00 mg/ml金屬離子顯 色劑溶液浸潤干燥后制成的顯色紙塊(2)和條狀硬質(zhì)塑料襯墊(3)，顯色紙塊(2) 粘貼在條狀硬質(zhì)塑料襯墊(3)上。
3. 權(quán)利要求1和2所述試劑盒的檢測方法，其特征在于檢測方法的步驟是(1) 將病人的生物樣品和第一試劑已知過量的二價金屬離子鈷、鋅、銅或鎳溶液混合成混合液，18-37 °C孵育5分鐘；(2) 然后加入第二試劑由pH8-10氨水-氯化銨緩沖液配制的金屬離子顯色劑 溶液顯色，或?qū)⑺龌旌弦旱渭釉贗MA測試紙條(1)上顯色，金屬離子顯色劑 和未與白蛋白結(jié)合的鈷、鋅、銅離子形成藍(lán)色配合物或和鎳離子形成綠色配合物， 18-37 °C孵育5-10分鐘；(3) 在紅光640-700nm波長測定所述有色配合物的吸光度或反射光率；(4) 所得數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)曲線相對照，即可得到IMA值。
4. 如權(quán)利要求3所述試劑盒的檢測方法，其特征在于在第(2)步中所述的金屬離子顯色劑.是(a) 能和二價鈷離子反應(yīng)生成藍(lán)色配合物的苦胺酸偶氮變色酸或吡啶偶氮變色酸；(b) 能和二價銅離子反應(yīng)生成藍(lán)色配合物的間氯偶氮氨替比林；(c) 能和二價鋅或銅離子反應(yīng)生成藍(lán)色配合物的1,5-(2-羥基-5-溴基)-3-氰基甲澄；(d) 能和二價鎳離子反應(yīng)生成綠色配合物的對硝基重氮氨基喹啉基偶氮喹啉。
5. 權(quán)利要求1和2所述試劑盒的應(yīng)用，其特征在于所述試劑盒在腦中風(fēng)的診斷、ACS的診斷及危險性分級、急性胸痛的ACS篩查、下肢缺血性血管病變的診 斷、肺栓塞的診斷中檢測IMA的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求1和2所述試劑盒的應(yīng)用，其特征在于所述試劑盒聯(lián)合和肌鈣蛋 白I測定在ACS的診斷及危險性分級、急性胸痛的ACS篩査中檢測IMA的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明是一種紅光檢測缺血修飾白蛋白的試劑盒及其檢測方法。試劑盒是由第一試劑二價金屬離子鈷、鋅、銅或鎳溶液和第二試劑pH8-10的金屬離子顯色劑溶液或用第二試劑顯色的IMA測試紙條組成。檢測方法是將生物樣品和第一試劑溶液混合成混合液，然后加入第二試劑顯色，或?qū)⒒旌弦旱渭釉贗MA測試紙條上顯色，形成藍(lán)色或綠色配合物，在紅光640-700nm波長測定其吸光度或反射光率，其測定值可診斷病人是否有缺血癥狀。本發(fā)明開發(fā)了一種適合床邊診斷的快速檢測IMA方法，步驟簡單，僅15分鐘左右就能完成，并避免了樣品中干擾物的影響，使測定結(jié)果更接近真值。試劑盒成本低廉，靈敏度高，特異性強(qiáng)，性能穩(wěn)定，便于運輸和保存。
文檔編號G01N33/68GK101655500SQ20091019536
公開日2010年2月24日 申請日期2009年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月8日
發(fā)明者佳 劉, 靜 江, 潘曙明, 程振球, 賀堅慧 申請人:賀堅慧