專利名稱：檢測牛奶中結(jié)合珠蛋白含量的免疫傳感器及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化學(xué)及電化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及針對奶牛隱形 乳腺炎的重要標(biāo)志物一牛奶中結(jié)合珠蛋白含量的快速檢測方法。
背景技術(shù)：
奶牛乳腺炎(mastitis)是所有奶牛疾病中發(fā)病率最高、危害最為 嚴(yán)重的一種乳腺炎癥性疾病，主要包括臨床型乳腺炎和隱性乳腺炎兩 種類型，其中又以隱性乳腺炎的發(fā)病最為普遍。隱性乳腺炎的發(fā)生可 引起奶牛的產(chǎn)奶量下降，并導(dǎo)致牛奶中體細(xì)胞數(shù)量(SCC)升高而降 低乳品質(zhì)量。若處理不當(dāng)，則有可能發(fā)展成為臨床型乳腺炎，帶來更 大的危害。因此，對隱性乳腺炎進行適時、準(zhǔn)確的監(jiān)測是奶牛場最為 重要的工作。由于隱性乳腺炎患牛缺乏明顯的乳腺炎癥表現(xiàn)，臨床上必須借助 特殊手段才能建立該病的診斷?，F(xiàn)階段臨床上診斷奶牛隱性乳腺炎的 常規(guī)方法包括牛奶體細(xì)胞計數(shù)法和乳汁細(xì)菌培養(yǎng)法。體細(xì)胞計數(shù)又包 括采用體細(xì)胞計數(shù)儀進行直接計數(shù)和采用CMT法(加利福利亞乳腺 炎檢測方法)進行間接計數(shù)兩種方法。丹麥福斯公司生產(chǎn)的系列體細(xì) 胞計數(shù)儀是目前唯一商品化的體細(xì)胞計數(shù)裝置，但該類儀器的價格非 常昂貴，檢測成本亦較高，很難在國內(nèi)中小牛場普及；CMT法以及國內(nèi)一些研究機構(gòu)根據(jù)CMT原理開發(fā)出來的HMT法、SMT法等不 需特殊設(shè)備，檢測成本較低廉，但容易出現(xiàn)假陽性或假陰性反應(yīng)，檢 測結(jié)果的可靠性相對較低。乳汁細(xì)菌培養(yǎng)法是診斷奶牛隱性乳腺炎較 為可靠的一種方法，但存在檢測過程耗時較長、不能進行實時在線診 斷等缺點。可用于診斷隱性乳腺炎的方法還包括牛奶電導(dǎo)率檢驗法、 酶類檢測法、PCR檢測法等，這些檢測方法或者要求苛刻的檢測條件， 或者要求較高的專業(yè)技能，難以在基層單位推廣應(yīng)用。
近年來的科學(xué)研究表明，牛奶中結(jié)合珠蛋白(Haptoglobin, Hp) 的含量升高可作為診斷奶牛隱性乳腺炎的敏感指標(biāo)，目前國外已有商 品化的檢測牛結(jié)合珠蛋白的ELISA試劑盒問世。雖然ELISA檢測方 法具有靈敏度高、特異性強的優(yōu)點，但亦存在檢測成本高、操作步驟 繁瑣等不足。
鑒于奶牛隱性乳房炎的嚴(yán)重危害及以上診斷方法的缺點和局限 性，臨床上急需一種快速、靈敏、操作簡單、檢測成本低廉且能實現(xiàn) 在線診斷的檢測方法。
免疫傳感器檢測技術(shù)是將免疫檢測技術(shù)與傳感檢測技術(shù)相結(jié)合 而形成的一類新型檢測技術(shù)，是生物傳感器領(lǐng)域發(fā)展最迅速的技術(shù)之 一，具有靈敏度高、特異性強、檢測快速、使用簡便、低成本和容易 實現(xiàn)在線檢測等許優(yōu)點。電流型免疫傳感器是免疫傳感器的一種類 型，通常由轉(zhuǎn)換元件(支持電極)、生物敏感元件(抗體或抗原修飾 的工作電極)、電解池以及數(shù)據(jù)采集與處理系統(tǒng)組成，通過檢測抗原-抗體反應(yīng)前后電流的變化而實現(xiàn)定性/定量檢測。近十余年來，電流型免疫傳感器在醫(yī)學(xué)、動物醫(yī)學(xué)、環(huán)境分析和食品安全檢測等多領(lǐng)域 中得到了廣泛的研究，其中工作電極上生物分子的組裝技術(shù)一直是該 研究領(lǐng)域的關(guān)鍵內(nèi)容。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供了一種檢測牛奶中結(jié)合珠蛋白含量的免 疫傳感器，包括工作電極、輔助電極和參比電極，其特征在于，免疫 傳感器的工作電極為金電極，金電極上結(jié)合有納米金顆粒，納米金顆 粒上連接有抗結(jié)合珠蛋白抗體。
進一步地，所述的金電極為圓盤金電極，輔助電極為鉑絲電極，
參比電極為Ag/AgCl標(biāo)準(zhǔn)電極。
更進一步地，所述納米金粒子的直徑為15~25nm。 本發(fā)明的免疫傳感器以電化學(xué)三電極系統(tǒng)為基本裝置，以圓盤金 電極為工作電極，在金電極上組裝納米金顆粒，納米金顆粒上連接抗 結(jié)合珠蛋白抗體，利用抗體-抗原的特異性親和作用捕獲牛奶中的待 測抗原——結(jié)合珠蛋白，采用循環(huán)伏安法檢測免疫反應(yīng)前后傳感器的 電流變化，實現(xiàn)對牛奶中結(jié)合珠蛋白的定量檢測。
本發(fā)明免疫傳感器結(jié)構(gòu)簡單，在制備時，首先對金電極表面進行 拋光等預(yù)處理，以氯金酸溶液為電解質(zhì)溶液、用循環(huán)伏安法使金離子 在電極表面發(fā)生還原反應(yīng)產(chǎn)生金單質(zhì)，金單質(zhì)以納米粒子形態(tài)沉積在 電極表面，再通過納米金粒子吸附抗結(jié)合珠蛋白抗體，用小牛血清封 閉非特異性結(jié)合位點，制得工作電極，最后將工作電極與參比電極、輔助電極組裝形成納米金免疫傳感器。
本發(fā)明還提供了一種使用上述免疫傳感器檢測牛奶中結(jié)合珠蛋 白含量的方法，其特征在于包括以下步驟-
a. 將已知濃度的結(jié)合珠蛋白抗原溶液進行梯度稀釋，分別將權(quán) 利要求1所述免疫傳感器在上述結(jié)合珠蛋白抗原溶液中浸泡30分鐘后 放入電解池溶液中，設(shè)置掃描電壓為-0.2V-0.6V、掃描速度0.1V/s，進 行循環(huán)伏安掃描檢測，得到一系列氧化峰電流下降百分比數(shù)據(jù)，將該 數(shù)據(jù)與結(jié)合珠蛋白抗原溶液的濃度建立關(guān)聯(lián)，得結(jié)合珠蛋白抗原溶液 的工作曲線圖和線性回歸方程；
b. 取待測的新鮮牛奶樣品，3000rpm離心10分鐘，取乳清用超純 水稀釋，將上述免疫傳感器在稀釋液中浸泡30分鐘后放入電解池溶液 中，設(shè)置掃描電壓為-0.2V-0.6V、掃描速度0.1V/s，進行循環(huán)伏安掃描 檢測，得氧化峰電流下降百分比數(shù)據(jù)，將該數(shù)據(jù)代入步驟a所得線性 回歸方程，計算得出牛奶樣品中結(jié)合珠蛋白的含量。
進一步地，所述的電解池溶液含5mM鐵氰化鉀、5mM亞鐵氰化 鉀、0.1M氯化鉀。
本發(fā)明檢測方法通過采用循環(huán)伏安法檢測抗體與被檢抗原反應(yīng) 前后傳感器的電流響應(yīng)變化，確定被檢抗原的含量。
將標(biāo)準(zhǔn)濃度的抗原溶液按照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的要求進行系列稀 釋，分別用本發(fā)明的免疫傳感器對上述抗原溶液進行循環(huán)伏安掃描檢 測，可得到一系列氧化峰電流(力下降百分比數(shù)據(jù)^式中力為免疫反應(yīng)前的氧化峰電流，A為免疫反應(yīng)后的氧化峰電流。
分別以峰電流電流下降百分比《及與其相對應(yīng)的抗原濃度為縱
坐標(biāo)和橫坐標(biāo)，用Excel軟件處理繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，獲得其相應(yīng)的回 歸方程，并對該方法組裝的免疫傳感器檢測的靈敏性、特異性和穩(wěn)定 性進行分析。
當(dāng)檢測牛奶樣品中的結(jié)合珠蛋白含量時，用本發(fā)明的免疫傳感器 對樣品溶液進行循環(huán)伏安掃描檢測，計算得出氧化峰電流(力下降百 分比A，將該數(shù)據(jù)代入上述線性回歸方程，計算得出牛奶樣品中結(jié)合 珠蛋白的含量。
本方法基于電流型免疫傳感器，采用電化學(xué)循環(huán)伏安掃描法對牛 奶中結(jié)合珠蛋白進行定量測定，操作簡單、檢測快速、靈敏度高、檢 測成本低廉、易于推廣，可作為臨床上通過檢測牛奶中結(jié)合珠蛋白含 量而建立奶牛隱性乳腺炎診斷的一種實用、簡便的方法。


圖1為本發(fā)明納米金免疫傳感器檢測結(jié)合珠蛋白的工作曲線。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的內(nèi)容作進一步的說明。
實施例l:制備納米金免疫傳感器 1)溶液的配置Piranha溶液98%濃硫酸和30%過氧化氫溶液按體積比為3 : l的 比例配制。
氯金酸電解液溶液:將lg氯金酸溶解到100ml純水中配制成1% 氯金酸溶液，再取lml 1%的氯金酸溶液加入到30ml 0.5M稀硫酸溶 液中，混合均勻。
電解池溶液稱取0.0832g鐵氰化鉀，0.1056g亞鐵氰化鉀，0.3728g 氯化鉀溶解到50ml純水中。 2)制備納米金免疫傳感器
將圓盤金電極依次用直徑為l(im、0.3^im和0.05pm的氧化鋁粉末拋 光至光亮，用上述配制好的Pimnha溶液浸泡10分鐘，再依次浸泡于無 水乙醇和雙蒸水中超聲波清洗15分鐘，將清洗后的電極放入0.5M硫 酸溶液中，用循環(huán)伏安法在-0.3 1.5V電壓下拋光30分鐘，晾干備用。
以上述配制的氯金酸電解液為底液，采用線性循環(huán)伏安掃描法， 設(shè)置起始電壓為1.1V，末電壓為OV，掃面速度0.1V/s，掃描圈數(shù)為l 圈，在圓盤金電極上沉積納米金顆粒，所得納米金顆粒的直徑約為 20nm，得納米金電極。
將納米金電極浸入0.5嗎/ml的牛結(jié)合珠蛋白抗體溶液中，室溫下 孵育20分鐘后取出，用0.25%小牛血清封閉15分鐘，純水洗凈后晾干 備用，得納米金免疫電極。
將免疫電極與參比電極、輔助電極組裝形成納米金免疫傳感器。
在納米金免疫電極的制備過程中，采用循環(huán)伏安法(電壓 -0.2V-0.6V，掃描速度0.1V/s，電解池溶液為5mM鐵氰化鉀，5mM亞鐵氰化鉀，0.1M氯化鉀溶液)對每一步處理進行表征。
實施例2:結(jié)合珠蛋白的檢測 1)繪制工作曲線
將牛結(jié)合珠蛋白標(biāo)準(zhǔn)抗原(濃度為0.77mg/ml)分別稀釋至 1540ng/ml、 770ng/ml、 385ng/ml、 154ng/ml、 77ng/ml、 38.5 ng/ml、 7.7ng/ml、 3.85 ng/ml、 1.54 ng/ml和0.77 ng/ml。
用實施例l所制得的納米金免疫傳感器分別在上述濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗 原溶液中浸泡30分鐘后，采用循環(huán)伏安法對牛結(jié)合珠蛋白標(biāo)準(zhǔn)抗原進 行定量檢測，以免疫反應(yīng)前后氧化峰電流O')下降的百分比《作為 定量依據(jù)。
加(厶-力)/厶x1000/0，
式中力為免疫反應(yīng)前的氧化峰電流，力為免疫反應(yīng)后的氧化峰電流。
對每一濃度標(biāo)準(zhǔn)抗原檢測三次，取氧化峰的平均值作為每一標(biāo)準(zhǔn) 抗原濃度所對應(yīng)的峰電流值。以標(biāo)準(zhǔn)抗原濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo) (X)， W直為縱坐標(biāo)(Y)，用Excel軟件處理并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，即得 到標(biāo)準(zhǔn)抗原溶液的工作曲線圖(如圖l所示)和其相關(guān)的線性回歸方
程
Y=0.2672X-0.0567
其中X二log^C， C為抗原濃度，Y為氧化峰下降百分比)，線性相 關(guān)系數(shù)R2 = 0.9959，滿足定量分析方法對精密度的要求。牛結(jié)合珠蛋白抗原的稀釋濃度(V=V標(biāo)準(zhǔn)抗原V水)在7ng/ml(V=l: 100000) 350ng/ml (V=l: 2000)時，免疫傳感器氧化峰電流(i)下降的百分?jǐn)?shù)A與抗原濃度的以IO為底的對數(shù)呈良好的線
性關(guān)系。
2)牛奶樣品中結(jié)合珠蛋白的檢測
取待測新鮮牛奶2ml， 3000rpm (離心力為603g)離心10分鐘，棄乳脂，用超純水稀釋1000倍。室溫下，將免疫傳感器在乳清稀釋液中浸泡孵育30分鐘，取出放入電解池溶液中，設(shè)置掃描電壓為-0.2V-0.6V、掃描速度0.1V/s，進行循環(huán)伏安掃描檢測，計算出其氧化峰下降百分比h對每一樣品使用不同工作傳感器連續(xù)測量三次，K值分別為1.94， 1.86， 1.92 ，取其平均值1.91代入上述回歸方程Y二0.2672X-0.0567中，計算出結(jié)合珠蛋白的含量為92ng/ml。乘以乳清的稀釋倍數(shù)IOOO，得被測牛奶中的結(jié)合珠蛋白含量為92ug/ml。
實施例3:回收率試驗
取3份牛結(jié)合珠蛋白抗原溶液進行稀釋后，按實施例2所述步驟測定結(jié)合珠蛋白含量，測定結(jié)果如下表
樣號 加入濃度(ng/ml) 回收量(ng/ml) 回收率(％)
1 15.4 14.85 96.44
2 77 71.96 93.45
3 154 137.26 89.13其平均回收率為93.01%，相應(yīng)的回收率的標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.09%，符合定量分析方法的精密度要求。
實施例4:穩(wěn)定性試驗
取3份牛結(jié)合珠蛋白標(biāo)準(zhǔn)抗原溶液進行稀釋后，按實施例2所 述步驟測定結(jié)合珠蛋白含量；重新制備納米金免疫傳感器，置4。C冰 箱中保存48h后，重新測定3份同樣濃度標(biāo)準(zhǔn)抗原溶液，測定結(jié)果如
樣號第 一 次測量濃度放置48h后測量濃度 偏差％ (ng/ml) (ng/ml)
1 14.8514.02 5.59
2 137.26 149.35 8.10
3 71.96 75.12 4.21 平均偏差為6.07%，說明傳感器穩(wěn)定性良好。
實施例5:重復(fù)性試驗
制備2個納米金免疫傳感器，分別標(biāo)記為1#， 2#傳感器。取3 份牛結(jié)合珠蛋白標(biāo)準(zhǔn)抗原溶液進行稀釋后，分別用1#， 2#傳感器檢 測，測量結(jié)果如下表-
樣號1#傳感器測量濃度 2#傳感器測量濃度 偏差％
(ng/ml) (ng/ml)
1 57.98 63.29 8.39
122 74.06 83.47 11.27
3 7.311 7.590 3.68
用2個傳感器一起檢測三組抗原溶液，同一濃度下傳感器之間檢測偏差分別為8.39%， 11.27%和3.68% 。平均偏差為7.79%，符合免疫傳感器重復(fù)性要求。
權(quán)利要求
1、檢測牛奶中結(jié)合珠蛋白含量的免疫傳感器，包括工作電極、輔助電極和參比電極，其特征在于，免疫傳感器的工作電極為金電極，金電極上結(jié)合有納米金顆粒，納米金顆粒上連接有抗結(jié)合珠蛋白抗體。
2、 如權(quán)利要求1所述檢測牛奶中結(jié)合珠蛋白含量的免疫傳感器， 其特征在于所述的金電極為圓盤金電極，輔助電極為鉑絲電極，參比 電極為Ag/AgCl標(biāo)準(zhǔn)電極。
3、 如權(quán)利要求2所述檢測牛奶中結(jié)合珠蛋白含量的免疫傳感器， 其特征在于所述納米金粒子的直徑為15 25nm。
4、 檢測牛奶中結(jié)合珠蛋白含量的方法，其特征在于包括以下步驟a. 將已知濃度的結(jié)合珠蛋白抗原溶液進行梯度稀釋，分別將權(quán) 利要求1所述免疫傳感器在上述結(jié)合珠蛋白抗原溶液中浸泡30分鐘后 放入電解池溶液中，設(shè)置掃描電壓為-0.2V-0.6V、掃描速度0.1V/s，進 行循環(huán)伏安掃描檢測，得到一系列氧化峰電流下降百分比數(shù)據(jù)，將該 數(shù)據(jù)與結(jié)合珠蛋白抗原溶液的濃度建立關(guān)聯(lián)，得結(jié)合珠蛋白抗原溶液 的工作曲線圖和線性回歸方程；b. 取待測的新鮮牛奶樣品，3000rpm離心10分鐘，取乳清用超純 水稀釋，將權(quán)利要求1所述免疫傳感器在稀釋液中浸泡30分鐘后放入 電解池溶液中，設(shè)置掃描電壓為-0.2V-0.6V、掃描速度0.1V/s，進行循 環(huán)伏安掃描檢測，得氧化峰電流下降百分比數(shù)據(jù)，將該數(shù)據(jù)代入步驟 a所得線性回歸方程，計算得出牛奶樣品中結(jié)合珠蛋白的含量。
5、如權(quán)利要求4所述檢測牛奶中結(jié)合珠蛋白含量的方法，其特征在于所述的電解池溶液含5mM鐵氰化鉀、5mM亞鐵氰化鉀、0.1M氯化鉀。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測牛奶中結(jié)合珠蛋白含量的免疫傳感器，包括工作電極、輔助電極和參比電極，其特征在于，免疫傳感器的工作電極為金電極，金電極上結(jié)合有納米金顆粒，納米金顆粒上連接有抗結(jié)合珠蛋白抗體。本發(fā)明利用抗體-抗原的特異性親和作用捕獲牛奶中的待測抗原——結(jié)合珠蛋白，采用循環(huán)伏安法檢測免疫反應(yīng)前后傳感器的電流變化，實現(xiàn)對牛奶中結(jié)合珠蛋白的定量檢測。本發(fā)明還提供了一種結(jié)合珠蛋白的檢測方法，該方法操作簡單、檢測快速、靈敏度高、檢測成本低廉、易于推廣，可作為臨床上通過檢測牛奶中結(jié)合珠蛋白含量而建立奶牛隱性乳腺炎診斷的一種實用、簡便的方法。
文檔編號G01N33/68GK101666804SQ20091015318
公開日2010年3月10日 申請日期2009年9月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月24日
發(fā)明者丁守強, 韜 潘, 勛 譚 申請人:浙江大學(xué)