專利名稱：一種刺槐屬莖尖染色體的壓片方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物鑒定技術(shù)領(lǐng)域，涉及林木莖尖染色體壓片的方法。特別適用于像 刺槐屬等材質(zhì)堅(jiān)韌、分生組織細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞間的果膠質(zhì)含量豐富的林木莖尖染色體的 壓片。
背景技術(shù)：
生物的許多性狀都是由基因控制的，而基因主要是在細(xì)胞核內(nèi)的染色體上。因此， 染色體發(fā)生形態(tài)結(jié)構(gòu)或數(shù)量上的變化，都必然會(huì)引起生物的性狀發(fā)生變異。遠(yuǎn)緣雜交、 輻射育種，單倍體育種、多倍體育種等是作物育種的重要途徑之一，而鑒別其后代是 否真正的遠(yuǎn)緣雜種，屬何種變異類型等，通過對(duì)染色體的遺傳行為的分析，又是較為 準(zhǔn)確和普遍的重要方法。因此，對(duì)植物細(xì)胞進(jìn)行制片來觀察染色體，是研究、識(shí)別生 物遺傳及變異類型的重要手段和技術(shù)。研究表明染色體壓片法是觀察植物染色體最常 用的方法，也是研究染色體組型、染色體分帶、染色體畸變和姊妹染色單體交換的基 礎(chǔ)。
有絲分裂期在整個(gè)細(xì)胞周期中所占的時(shí)間相對(duì)較短，有絲分裂制片的主要目的是 進(jìn)行染色體鑒定，希望觀察到更多分裂相，尤其是分裂中期相，通常要對(duì)材料進(jìn)行不 同的預(yù)處理。預(yù)處理主要通過抑制和破壞紡錘絲的形成來獲得更多的中期分裂相；同 時(shí)，預(yù)處理還可改變細(xì)胞質(zhì)的粘度，促使染色體縮短和分散，便于壓片和觀察。常用 的預(yù)處理有物理法、化學(xué)法、混合處理法等。
植物細(xì)胞的細(xì)胞壁對(duì)細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)起支撐和保護(hù)作用，分生組織的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu) 將分生細(xì)胞結(jié)合成一個(gè)整體，因此在壓片之前需要采用適當(dāng)方法軟化或部分分解細(xì)胞 壁、除去細(xì)胞之間的果膠層使細(xì)胞間易于分離，這一操作稱為解離。同時(shí)，解離也可 適當(dāng)清除部分細(xì)胞質(zhì)，使細(xì)胞質(zhì)背景趨于透明化，便于觀察染色體。
植物細(xì)胞分裂周期的長(zhǎng)短不盡相同，通常在十到幾十小時(shí)之間，溫度明顯地影響細(xì)胞分裂周期，同時(shí)不同植物有絲分裂高峰時(shí)間不盡相同。要經(jīng)多次試驗(yàn)才能掌握某 一植物有絲分裂高峰期，以便得到更多的處于分裂中期的細(xì)胞。
根尖與莖尖是有絲分裂的高發(fā)部位，根尖由于取材方便，是觀察植物染色體最常 用的材料。由于莖尖不好獲得，且莖尖組織不易解離，較難制片。材質(zhì)堅(jiān)韌的林木莖 尖更難被解離，解離時(shí)間短，細(xì)胞不能很好的分散開；解離時(shí)間長(zhǎng)，染色體會(huì)受到破 壞。目前根尖是制作染色體壓片的常用材料，應(yīng)用于剌槐屬的莖尖制作染色體壓片的 方法很少有文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)上述利用莖尖制作染色體壓片的缺點(diǎn)與不足，提供一種刺 槐屬莖尖染色體的壓片方法。用于對(duì)不易解離的莖尖制備染色體壓片。
本發(fā)明的方法特別適用于像刺槐屬等材質(zhì)堅(jiān)韌、分生組織細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞間的果膠 質(zhì)含量豐富的林木莖尖染色體壓片。
本發(fā)明所述的刺槐屬包括二喬刺槐、8044、 8048、 83002、 3-1、金葉刺槐、韓 國(guó)四倍體、匈牙利四倍體、長(zhǎng)葉刺槐等品種。
本發(fā)明的取材使用組織培養(yǎng)苗，通過壓片和敲打使材料盡量分散。植物細(xì)胞分裂 周期的長(zhǎng)短不盡相同，通常在十到幾十小時(shí)之間，溫度明顯地影響細(xì)胞分裂周期，同 時(shí)不同植物有絲分裂高峰時(shí)間也不盡相同。
為實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明提供如下的技術(shù)方案
一種刺槐屬莖尖染色體的壓片方法，該方法包括如下步驟
(1) 取材將組織培養(yǎng)的刺槐幼苗莖尖，自莖尖處切取3-5毫米；
(2) 預(yù)處理將莖尖放到0. 002-0. 004M 8-羥基喹啉中，處理3-5小時(shí)；
(3) 固定用卡諾氏固定液固定24小時(shí)；
(4) 解離從固定液中取出刺槐莖尖，用蒸餾水漂洗，再放到IN HC1中，在60 'C水浴中解離6-8分鐘；解離的目的是使分生組織細(xì)胞間的果膠質(zhì)分解，細(xì)胞壁軟化 或部分分解，使細(xì)胞分散開呈單個(gè)分布，細(xì)胞質(zhì)呈透明狀，使染色體更好的被觀察， 染色體也容易被分散壓平，更好計(jì)數(shù)。
4(5)壓片用蒸餾水漂洗解離后的材料，將材料移至清潔的載玻片上，用刀片自莖 尖處切取l毫米左右，以十字壓片法覆以載玻片，然后分開兩玻片。其中所述的十字 壓片法指的是兩個(gè)載玻片呈十字交叉、垂直放置，這樣便于將兩個(gè)載玻片分開，分開 后的兩個(gè)載玻片上都有材料，可以制成兩張片子，目的是讓材料盡量分散，便于觀察。 (6)染色在兩玻片上各滴l-2滴卡寶品紅染液進(jìn)行染色，20-30分鐘后加上蓋玻
片，用吸水紙吸去多余的染液；
(7) 敲打在蓋玻片上覆一層吸水紙，然后敲打l-2分鐘；
(8) 鏡檢先在低倍鏡下尋找有分裂相的視野，再用高倍鏡仔細(xì)觀察、記數(shù)或拍照。 本發(fā)明所述的刺槐幼苗為生長(zhǎng)旺盛的刺槐組培苗。當(dāng)培養(yǎng)室溫度在22 — 25'C時(shí)，
下午3_4時(shí)刺槐組培苗的細(xì)胞處于分裂旺盛期。
本發(fā)明所述的步驟(3)從預(yù)處理液轉(zhuǎn)到固定液之前用蒸餾水漂洗3-5次。 本發(fā)明所述的步驟(4)中解離前將材料用蒸餾水漂洗3-5次。 本發(fā)明所述的步驟(7)中的敲打是指用帶橡皮頭的鉛筆垂直敲打蓋玻片。 本發(fā)明所述的方法可用于刺槐屬等材質(zhì)堅(jiān)韌、分生組織細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞間的果膠質(zhì) 含量豐富的林木莖尖染色體壓片。主要是因?yàn)椴馁|(zhì)堅(jiān)韌的林木分生組織細(xì)胞間的果膠 質(zhì)含量豐富，用HCL解離的時(shí)間短，不易將果膠質(zhì)分解，致使細(xì)胞粘連在一起，不易 解離，在顯微鏡下觀察不到染色體；用HCL解離的時(shí)間長(zhǎng)，染色體會(huì)受到損壞，導(dǎo)致 染色體著色淺、不完整。而刺槐屬等材質(zhì)堅(jiān)韌的林木需要解離很長(zhǎng)時(shí)間，細(xì)胞才會(huì)呈 單個(gè)分布，這樣染色體就遭到嚴(yán)重?fù)p壞。
本發(fā)明詳細(xì)的刺槐屬莖尖染色體壓片方法包括如下步驟
1. 取材組織培養(yǎng)室溫度在22 — 25'C時(shí)，于下午3 — 4時(shí)采取組織培養(yǎng)的刺槐幼 苗莖尖，用鑷子將莖上的葉片及葉柄去除，自莖尖處切取3-5毫米。
2. 預(yù)處理將莖尖放到8-羥基喹啉0.002-0. 004M中，處理3-5小時(shí)。
3. 固定將從預(yù)處理液中取出的莖尖用蒸餾水沖洗3 — 5次，放入固定液中固定 24小時(shí)。如不立即進(jìn)行壓片，可將固定材料轉(zhuǎn)入70%酒精中，在4。C冰箱中保存，保 存時(shí)間最好不超過二個(gè)月。所述的固定液為卡諾氏固定液，即用3份無水酒精，加入l份冰醋酸(現(xiàn)配現(xiàn)用)。
4.解離將從固定液中取出的莖尖用蒸餾水沖洗3 — 5次，再放到1NHC1中，在 60'C水浴中解離6-8分鐘。
5. 壓片用蒸餾水漂洗解離后的材料，移至清潔的載玻片上，用刀片自莖尖處切 取1毫米左右，以十字壓片法覆以載玻片，用拇指用力下壓使細(xì)胞充分分散(不要使 蓋片移動(dòng))，分開兩玻片。
6. 染色各滴1-2滴染液進(jìn)行染色。染色20-30分鐘后加上蓋玻片，注意不要產(chǎn) 生氣泡，用吸水紙吸去多余的染液。所述的染色液為卡寶品紅染色液，其配制方法如
下
1) 原液A:稱取3g堿性品紅(Basic fuchsin)溶于100ml7(^乙醇中(可永久保 存)；
2) 原液B:取10ml原液A加入90ml5呢的苯酚水溶液，在37。 C條件下溫育2-4h(該 溶液不穩(wěn)定，應(yīng)在2周內(nèi)使用)；
3) 原液C:取55ml原液B加入6ml冰乙酸和6ml甲醛，充分混勻；
4) 卡寶品紅染液取10-20ml原液C加入約80ml45W的冰乙酸和lg山梨醇(可 永久保存)。
7. 敲打在蓋玻片上覆一層吸水紙，用帶橡皮頭的鉛筆垂直敲打(注意勿使玻片搓 動(dòng))l-2分鐘，使材料分散壓平，便于觀察。
S.鏡檢先在低倍鏡下尋找有分裂相的視野，再用高倍鏡仔細(xì)觀察、記數(shù)或拍照。 調(diào)節(jié)可調(diào)節(jié)可變光欄與反光鏡，使光線明暗合適，視場(chǎng)亮度適中。
本發(fā)明方法制作的染色體壓片具有如下優(yōu)點(diǎn)
1. 可操作性好，重復(fù)度高。
2. 使染色體壓片中處于分裂中期的細(xì)胞多。
3. 可解決材質(zhì)堅(jiān)韌林木的莖尖染色體壓片中材料的難解離、細(xì)胞不呈單個(gè)分布的 問題。
4. 使染色體壓片中的染色體分散均勻、容易計(jì)數(shù)。5.染色均勻清晰，可解決材質(zhì)堅(jiān)韌林木的莖尖染色體壓片中染色體染色顏色淺、 染色體不完整等問題。


圖1刺槐組織培養(yǎng)苗莖尖染色體壓片，解離6-8分鐘，細(xì)胞呈單個(gè)分布，處于分 裂中期的眾多細(xì)胞中期分裂相。
圖2刺槐組織培養(yǎng)苗莖尖染色體壓片，處于分裂前期的細(xì)胞和處于分裂中期姊妹 染色單體成對(duì)存在的細(xì)胞。
圖3刺槐組織培養(yǎng)苗莖尖染色體壓片，處于分裂中期姊妹染色單體成對(duì)存在的細(xì)胞。
圖4、圖5刺槐組織培養(yǎng)苗莖尖染色體壓片，處于分裂中期，姊妹染色單體已經(jīng) 分開，將要被拉向兩極的細(xì)胞。
圖6、圖7刺槐大田苗莖尖染色體壓片，解離30分鐘，細(xì)胞連在一起，不呈單個(gè) 分布，大多處于細(xì)胞分裂間期，處于分裂中期的細(xì)胞少。由于組織不易解離，解離的 時(shí)間長(zhǎng)，染色體受到破壞。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明，實(shí)施例僅為解釋性的，決不意味著它 以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
其中卡寶品紅染色液，其配制方法如下1)原液A:稱取3g堿性品紅(Basic fuchsin)溶于100ml7(^乙醇中(可永久保存)；2)原液B:取10 ml原液A加入90ml5% 的苯酚水溶液，在37° C條件下溫育2-4h(該溶液不穩(wěn)定，應(yīng)在2周內(nèi)使用)；3)原 液C:取55ml原液B加入6ml冰乙酸和6ml甲醛，充分混勻；4)卡寶品紅染液取 10-20ml原液C加入約80ml45M的冰乙酸和lg山梨醇。 實(shí)施例1
二喬刺槐組培苗莖尖染色體壓片
本例以二喬刺槐組培苗莖尖為樣本來制備莖尖染色體壓片，具體包括如下步驟
l.莖尖的取材組織培養(yǎng)室溫度為25'C,于下午3時(shí)采取組織培養(yǎng)的二喬刺槐幼
7苗莖尖，用鑷子將莖上的葉片及葉柄去除，自莖尖處切取3-5毫米。
2. 莖尖的預(yù)處理將莖尖放到8-羥基喹啉0.0035M中，處理3小時(shí)。
3. 莖尖的固定用鑷子將莖尖從預(yù)處理液中取出，用蒸餾水沖洗3-5次，將莖尖 放入固定液中固定24小時(shí)。
4. 莖尖的解離用鑷子將莖尖從固定液中取出，用蒸餾水沖洗3-5次，再放到 1NHC1中，在6(TC水浴中解離6分鐘。
5. 莖尖的壓片用鑷子將莖尖從1NHC1中取出，用蒸餾水沖洗3-5次，用鑷子 將莖尖移至清潔的載玻片上，用刀片自莖尖處切取l毫米左右，以十字壓片法覆以載 玻片，用拇指用力下壓使細(xì)胞充分分散，分開兩載玻片。
6. 染色在兩載玻片有材料的地方各滴1-2滴卡寶品紅染液進(jìn)行染色。染色20 分鐘后加上蓋玻片。
7. 敲打在蓋玻片上覆一層吸水紙，用帶橡皮頭的鉛筆垂直敲打1分鐘；使材料 分散壓平，便于觀察.
8. 鏡檢先在低倍鏡下尋找有分裂相的視野，再用高倍鏡仔細(xì)觀察、記數(shù)或拍照。 調(diào)節(jié)可調(diào)節(jié)可變光欄與反光鏡，使光線明暗合適，視場(chǎng)亮度適中，其結(jié)果詳見圖l-4。 實(shí)施例2
二喬刺槐組培苗莖尖染色體壓片
1. 莖尖的取材組織培養(yǎng)室溫度為22'C，于下午4時(shí)采取組織培養(yǎng)的二喬刺槐幼 苗莖尖，用鑷子將莖上的葉片及葉柄去除，自莖尖處切取3-5毫米。
2. 莖尖的預(yù)處理將莖尖放到8-羥基喹啉0.0025M中，處理5小時(shí)。
3. 莖尖的固定用鑷子將莖尖從預(yù)處理液中取出，用蒸餾水沖洗3-5次，將莖尖 放入固定液中固定24小時(shí)。
4. 莖尖的解離用鑷子將莖尖從固定液中取出，用蒸餾水沖洗3-5次，再放到 1NHC1中，在60'C水浴中解離8分鐘。
5. 莖尖的壓片用鑷子將莖尖從1NHC1中取出，用蒸餾水沖洗3-5次，用鑷子 將莖尖移至清潔的載玻片上，用刀片自莖尖處切取l毫米左右，以十字壓片法覆以載
8玻片，用拇指用力下壓使細(xì)胞充分分散，分開兩載玻片。
6. 染色在兩載玻片有材料的地方各滴1-2滴卡寶品紅染液進(jìn)行染色。染色30
分鐘后加上蓋玻片，用吸水紙吸去多余的染液。
7. 敲打在蓋玻片上覆一層吸水紙，用帶橡皮頭的鉛筆垂直敲打l分鐘，使材料 分散壓平，便于觀察。
S.鏡檢先在低倍鏡下尋找有分裂相的視野，再用高倍鏡仔細(xì)觀察、記數(shù)或拍照。 調(diào)節(jié)可調(diào)節(jié)可變光欄與反光鏡，使光線明暗合適，視場(chǎng)亮度適中，其結(jié)果詳見圖5。
在詳細(xì)說明的較佳實(shí)施例之后，熟悉該項(xiàng)技術(shù)人士可清楚地了解，在不脫離上述 申請(qǐng)專利范圍與精神下可進(jìn)行各種變化與修改，凡依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施 例所作的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化與修飾，均屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍。且本發(fā)明 亦不受說明書中所舉實(shí)例實(shí)施方式的限制。
權(quán)利要求
1、一種刺槐屬莖尖染色體的壓片方法，該方法包括如下步驟(1)取材采取組織培養(yǎng)的刺槐幼苗莖尖，自莖尖處切取3-5毫米；(2)預(yù)處理將莖尖放到0.002-0.004M8-羥基喹啉中，處理3-5小時(shí)；(3)固定用卡諾氏固定液固定24小時(shí)；(4)解離從固定液中取出刺槐莖尖，用蒸餾水漂洗，再放到1N HCl中，在60℃水浴中解離6—8分鐘；(5)壓片用蒸餾水漂洗解離后的材料，將材料移至清潔的載玻片上，用刀片自莖尖處切取1毫米左右，以十字壓片法覆以載玻片，然后分開兩玻片；(6)染色在兩玻片上各滴1-2滴卡寶品紅染液進(jìn)行染色，20-30分鐘后加上蓋玻片，用吸水紙吸去多余的染液；(7)敲打在蓋玻片上覆一層吸水紙，然后敲打1-2分鐘；(8)鏡檢先在低倍鏡下尋找有分裂相的視野，再用高倍鏡仔細(xì)觀察、記數(shù)或拍照。
2、 如權(quán)利要求1所述的壓片方法，其中所述的刺槐幼苗為生長(zhǎng)旺盛的刺槐組培苗。
3、 如權(quán)利要求1所述的壓片方法，其中所述的取材為當(dāng)組織培養(yǎng)室的溫度為22-25 "C時(shí)，于下午3 — 4時(shí)取材；
4、 如權(quán)利要求1所述的壓片方法，其中步驟(3)從預(yù)處理液轉(zhuǎn)到固定液之前用蒸餾 水漂洗3-5次。
5、 如權(quán)利要求1所述的壓片方法，其中步驟(4)中解離前將材料用蒸餾水漂洗3-5次。
6、 如權(quán)利要求1所述的壓片方法，其中步驟(7)所述的敲打是指用帶橡皮頭的鉛 筆垂直敲打蓋玻片。
7、 如權(quán)利要求1所述的壓片方法可用于材質(zhì)堅(jiān)韌、分生組織細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞間的果 膠質(zhì)含量豐富的林木刺槐屬莖尖染色體的壓片。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種刺槐屬莖尖染色體的壓片方法，包括取材、預(yù)處理、固定、解離、壓片、染色、敲打、鏡檢等步驟，其特點(diǎn)是在培養(yǎng)室溫度22-25℃時(shí)，于下午3-4時(shí)采取長(zhǎng)勢(shì)旺盛的刺槐組培苗的莖尖，這時(shí)的細(xì)胞處于分裂旺盛期；預(yù)處理采用8-羥基喹啉0.002-0.004M處理3-5小時(shí)；用十字壓片法壓片；卡寶品紅染色；用鉛筆頭敲打材料，使細(xì)胞盡量分散均勻。本發(fā)明的壓片方法，操作容易，制片效率高，節(jié)省藥物消耗，染色體分散均勻，易計(jì)數(shù)，很容易觀察到染色體的中期分裂相，染色均勻清晰，特別適用于材質(zhì)堅(jiān)韌的林木材料的染色體壓片。
文檔編號(hào)G01N21/84GK101482515SQ200910067769
公開日2009年7月15日 申請(qǐng)日期2009年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月22日
發(fā)明者劉建華, 娜 張, 朱延林, 田淑芬, 苗博瑛, 黃建全 申請(qǐng)人:天津市林業(yè)果樹研究所