專利名稱：一種測定血清中藥物活性成分的方法
技術領域：
本發(fā)明屬藥物分析領域，涉及一種測定血清中藥物活性成分的方法，尤其涉及測定血清中復方中藥的活性成分的方法。
背景技術：
復方中藥以其獨特的療效和較小的副作用，在臨床上應用已經(jīng)有數(shù)千年的歷史。 但是由于其中存在著眾多的化學成分，使得對復方中藥的作用物質基礎以及復方中藥的作用機制的研究相當困難。血清藥物化學研究顯示，中藥中雖含有諸多成分，但只有被吸收入血的成分才能產(chǎn)生作用，被認為藥物活性成分。傳統(tǒng)中藥多為口服給藥，口服給藥后藥物成分或經(jīng)過消化道直接吸收入血，或經(jīng)肝微粒體酶代謝后入血，其活性成分以血液為介質輸送到靶點，從而產(chǎn)生作用。血清中含有的成分被認為是中藥在體內(nèi)直接起作用的物質。自 1992年Homma首次提出血清藥物化學的概念以來(Homma M等Analytical Biochemistry 1992 ；202 179-187.)，血清藥物化學已經(jīng)已經(jīng)在國際上獲得廣泛認可。麝香保心丸(國藥準字Z31020068)主要含麝香、人參提取物、人工牛黃、肉桂、蘇合香、蟾酥、冰片。麝香保心丸是芳香溫通類治療胸痹(冠心病、心絞痛)的代表復方中藥藥物，因其療效確切、安全方便、價格經(jīng)濟，而成為治療冠心病、心絞痛的常用藥物之一。據(jù)統(tǒng)計，麝香保心丸在芳香溫通類治療胸痹的中藥中穩(wěn)居第一，是唯一在全國擁有較高知名度的獨家傳統(tǒng)中藥大品種。所述復方中藥的藥物活性成分測定已受到本領域研究者的關注。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種測定血清中藥物活性成分的方法，具體涉及一種測定血清中治療心血管疾病的復方中藥的活性成分的方法。本發(fā)明所涉及的治療心血管疾病的復方中藥是麝香保心丸(國藥準字 Z31020068)主要含下述原料藥組分麝香、人參提取物、人工牛黃、肉桂、蘇合香、蟾酥、冰片，目前該藥物的作用物質基礎仍然不明確。由于中藥成分復雜，導致藥物作用物質基礎不明確?，F(xiàn)有對中藥的藥效成分研究多偏重于單個成分的藥理藥效評價，脫離了中醫(yī)整體協(xié)同作用的理論。本發(fā)明將復方中藥作為一個整體進行研究，本發(fā)明采用高效液相色譜-質譜聯(lián)用的方法，分析給藥后大鼠血清、空白大鼠血清以及藥物的提取液，測定該藥物中能進入血液發(fā)揮藥效的活性成分即藥物的作用物質基礎，并在此基礎上確定這些作用物質基礎在藥物中的含量。本發(fā)明方法包括如下步驟1.配制藥物提取液取500mg藥物粉末，用6. 5ml混合溶劑超聲提取后12000r/min離心，上清液過 0. 45 μ m濾膜過濾，得到配制的藥物提取液；本發(fā)明在制備藥物提取液中，采用的混合溶劑及其比例為甲醇二氯甲烷水= 4:2: 0. 5(V/V)，超聲時間為 20min。2.制備空白血清樣品
羧甲基纖維素鈉用純水制成0. 5%的混懸液，用于SD大鼠灌胃給藥(lml/kg大鼠體重)，灌胃0. 5-3小時后，腹腔注射1 %的戊巴比妥鈉溶液(0. 15ml/kg大鼠體重)麻醉大鼠，靜脈取血，置于涂肝素鈉的EP管中，在4°C條件下，3000r/min離心IOmin ；取上清液 400μ 1，加入到5ml EP管中；沉淀蛋白后，渦旋lmin，12000r/min離心10分鐘，上清液真空旋轉蒸干，殘渣加入200 μ 1甲醇復溶，離心；上清液即為空白血清樣品；3.制備給藥后血清樣品所述復方中藥藥物粉碎成細粉后，用0. 5%的羧甲基纖維素鈉制成混懸液，藥物的濃度為0. 34g/ml ；SD大鼠給予藥物混懸液灌服(3. 4g/kg大鼠體重)。服藥0. 5-3小時后， 大鼠腹腔注射的戊巴比妥鈉溶液(0. 15ml/kg大鼠體重)麻醉，靜脈取血，置涂肝素鈉的 EP管中，4°C條件下，3000r/min離心lOmin，取上清液400 μ 1，加入5ml EP管中，沉淀蛋白后，渦旋lmin，12000r/min離心10分鐘，上清液真空旋轉蒸干，殘渣加入200 μ 1甲醇復溶， 離心；上清液即為給藥后血清樣品；本發(fā)明在制備空白或給藥血清樣品中，采用灌胃后2小時從肝門靜脈取血，每 400 μ 1血清用甲醇3ml沉淀蛋白；流動相為乙腈0. 5%甲酸水溶液。4.高效液相色譜_質譜聯(lián)用分析色譜柱Waters Symmetry C18色譜柱，5 μ m，250mm X 4. 6mm ；流動相為甲醇(流動相B)-水(流動相A)系統(tǒng)、乙腈(流動相B)-水系統(tǒng)(流動相A)、乙腈(流動相B) 0.5% 乙酸水溶液(流動相A)或乙腈(流動相B) 0. 5%甲酸水(流動相A)溶液；流速0. SmL/ min ；柱溫25°C ；電噴霧離子化源(ESI)，源電壓3. 5kv ；干燥氣流速lOL/min ；干燥氣溫度 350°C;噴霧氣壓力30psi ；MS/MS打碎電壓1. 0V，掃描的范圍為100_1500u，分別采集正離子和負離子模式下的MS和MS/MS圖譜；數(shù)據(jù)分析采用Chemstation工作站軟件。表1為梯度洗脫程序。表 權利要求
1.一種測定血清中藥物活性成分的方法，其特征是采用高效液相色譜-質譜聯(lián)用的方法，分析給藥后血清、空白血清及藥物的提取液，測定藥物活性成分及藥物活性成分的含量；包括以下步驟(1)配制藥物提取液取藥物粉末，用混合溶劑超聲提取后12000r/min離心，過濾，得藥物提取液；(2)制備空白血清樣品羧甲基纖維素鈉用純水制成混懸液，動物灌胃給藥后，取靜脈血，置涂肝素鈉的EP管中，離心，沉淀蛋白后，上清液真空旋轉蒸干，得空白血清樣品；(3)制備給藥后血清樣品藥物碎成細粉后，用0.5%的羧甲基纖維素鈉制成混懸液， 藥物的濃度為0. 34g/ml, SD大鼠給予藥物混懸液灌服3. 4g/kg大鼠體重，服藥0. 5-3小時后，大鼠腹腔注射的戊巴比妥鈉溶液麻醉，0. 15ml/kg大鼠體重，取靜脈血，置涂肝素鈉的EP管中，4°C條件下，3000r/min離心IOmin ；取上清液400 μ 1，加入5ml EP管中，沉淀蛋白，渦旋lmin，12000r/min離心10分鐘，上清液真空旋轉蒸干，殘渣加入200 μ 1甲醇復溶， 離心；上清液即給藥后血清樣品；(4)高效液相色譜_質譜聯(lián)用分析色譜柱Waters Symmetry C18色譜柱，5 μ m，250mmX 4. 6mm ；流動相為甲醇-水系統(tǒng)、 乙腈_水系統(tǒng)、乙腈-0. 5%乙酸水溶液或乙腈-0. 5%甲酸水溶液；流速0. 8mL/min ；柱溫 25°C ；電噴霧離子化源ESI，源電壓3. 5kv ；干燥氣流速lOL/min ；干燥氣溫度350°C ；噴霧氣壓力30psi ；MS/MS打碎電壓1. 0V，掃描的范圍為100_1500u，分別采集正離子和負離子模式下的MS禾口 MS/MS圖譜；(5)比較給藥血清和空白血清的質譜圖，扣除空白血清中的內(nèi)源性成分，得給藥后血清中的差異性成分，即所測得的藥物的活性成分。
2.按權利要求1所述的測定血清中藥物活性成分的方法，其特征是所述藥物為治療心血管疾病的復方中藥。
3.按權利要求1所述的測定血清中藥物活性成分的方法，其特征是所述藥物為麝香保心丸，國藥準字Z31020068，主要含含下述原料藥組分麝香、人參提取物、人工牛黃、肉桂、 蘇合香、蟾酥、冰片。
4.按照權利要求1所述的方法，其特征是，所述的步驟1的混合溶劑為甲醇二氯甲烷水=4 2 0. 5，V/V，超聲時間為20min。
5.按照權利要求1所述的方法，其特征是，所述方法中，制備空白或給藥血清樣品， 采用灌胃后2小時從肝門靜脈取血，每400 μ 1血清用甲醇3ml沉淀蛋白；流動相為乙腈 0.5%甲酸水溶液。
6.按照權利要求1所述的方法，其特征是，所述的步驟5)的差異性成分以下述16個共有色譜峰的保留時間Rt值、分子量、一級質譜離子數(shù)據(jù)和二級質譜離子數(shù)據(jù)表示
7.按照權利要求6所述的方法，其特征是產(chǎn)生的所述的藥物的活性成分，分別為曰本蟾蜍它靈，人參皂苷Re，1 β-羥基蟾毒靈，人參皂苷Rbl，人參皂苷Ral，脂蟾毒精醇，人參
8. 一種測定血清中藥物活性成分含量的方法，其特征是通過下述步驟； (1)色譜條件與系統(tǒng)適用性實驗色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料；流動相為流動相B和流動相A的混合物，其中流動相B為乙腈，流動相A為水-有機酸；梯度洗脫條件如下表；ELSD的漂移管溫度為 40°C，壓力為3. 5bar, gain值為7，理論塔板數(shù)以蟾毒靈峰計算，不低于4000，
9.根據(jù)權利要求8的方法，其特征在于測得的血清中藥物活性成分含量為每Ig藥物中含日本蟾蜍它靈0. 1-0. 5mg，人參皂苷Re 2. 0-4. Omg，1 β -羥基蟾毒靈0. 1-0. 4mg, 人參皂苷Rbl 0. 5-3. Omg，人參皂苷Ral 0. 5-3. Omg，脂蟾毒精醇0. 5-2. 5mg，人參皂苷Rc 0. 6-3. Omg，人參皂苷 Rb2 1. 0-4. Omg，人參皂苷 Rb3 0. 1_2. 5mg，人參皂苷 Rd 2. 0-5. 5mg, 蟾毒靈0. 1-2. Omg,膽酸2. 0-4. 5mg,豬去氧膽酸3. 0-5. Omg,華蟾酥毒基0. 5-2. 5mg,鵝去氧膽酸 0. 1-2. Omg,去氧膽酸 0. 1-2. Omg。
全文摘要
本發(fā)明屬藥物分析領域，涉及一種測定血清中藥物活性成分的方法，尤其涉及測定血清中復方中藥的活性成分的方法，本發(fā)明采用高效液相色譜-質譜聯(lián)用的方法，分析給藥后大鼠血清、空白大鼠血清以及藥物的提取液，測定該藥物中能進入血液發(fā)揮藥效的活性成分即藥物的作用物質基礎，并在此基礎上確定這些作用物質基礎在藥物中的含量。本發(fā)明方法能將復方中藥作為一個整體進行研究，分析血清中所含的來源于藥物的化合物成分群，揭示藥物的作用物質基礎，并能測定藥物活性成分的含量，具有穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好、可操作性強等優(yōu)點。
文檔編號G01N30/72GK102486472SQ20091004966
公開日2012年6月6日 申請日期2009年4月20日 優(yōu)先權日2009年4月20日
發(fā)明者丁建彌, 姜鵬, 孫志男, 張衛(wèi)東, 張正光, 徐瑞林, 柳潤輝, 潘芳芳, 陳忠樑 申請人:上海和黃藥業(yè)有限公司