專利名稱：氧化鋅量子點標記抗體的熒光免疫測定方法
技術領域：
本發(fā)明屬于免疫測定技術領域，涉及一種利用氧化鋅量子點進行免疫測定的方法。
背景技術：
納米結構氧化鋅除了獨特的半導體光電特性之外，還具有對生物安全無毒、能與 蛋白質等生物分子以氫鍵或其他方式螯合并能很好的保持其生物活性、具有較高等電 點等優(yōu)異的性能，這使其在生物/化學傳感器方面具有重要的應用。
目前，低濃度抗原的檢測是臨床醫(yī)學和診斷學面臨的重要課題。能成功檢測低濃 度的抗原，可以為相應的疾病早期診斷和治療提供科學的依據?？乖瓭舛葯z測的傳統(tǒng) 手段是先進行病毒培養(yǎng)以提高疾病抗原的濃度，然后輔以光化學檢測法或其他檢測方 法確定抗原濃度并推算出原始濃度。這種方法的局限性在于其周期長，精確度差等， 可能延誤疾病的發(fā)現和最佳治療時機。利用納米材料構建生物/化學傳感器進行電化學 檢測抗原的方法因其檢測限低、檢測快速、選擇性好等優(yōu)點正逐漸受到越來越多的重 視，但由于早期疾病期相應抗原的濃度極低，因此如何使低濃度的抗原產生明顯的檢 測信號是這種方法亟待解決的重要問題之一。
發(fā)明內容
技術問題本發(fā)明針對上述技術缺陷，提供一種氧化鋅量子點標記抗體的熒光免 疫測定方法，該方法利用氧化鋅標記抗體檢測低濃度抗原，對相應抗原的檢測限低、 選擇性好、靈敏度高、穩(wěn)定性好。
技術方案在本發(fā)明中，利用簡單的液相反應制備氧化鋅量子點，得到了粒徑均 一，分散性好的氧化鋅量子點，把量子點標記到抗體上。同時在自制的電解池中在載 片上固定化一層抗體，在特定濃度的待測抗原溶液中，使標記了氧化鋅量子點的抗體 和載片上的抗體均與抗原進行特異性結合，把標記在抗體上的氧化鋅量子點連接到載
4片上。然后測定載片上氧化鋅量子點的熒光強度，建立氧化鋅熒光強度與與抗原濃度 之間的關系，從而確定待測抗原濃度。
利用液相反應制備氧化鋅量子點，得到粒徑均一、分散性好的氧化鋅量子點，把該 量子點標記到抗體上；同時在電解池中的載片上固定化一層抗體，在一系列已知濃度 的待測抗原溶液中，使標記了氧化鋅量子點的抗體和載片上的抗體均與抗原進行特異 性結合，把標記在抗體上的氧化鋅量子點連接到載片上；然后測定載片上氧化鋅量子 點的熒光強度，建立氧化鋅熒光強度與與抗原濃度之間的標準對應關系，用實際樣品 檢測時得到的氧化熒光強度與此標準對應關系相對照即可確定實際樣品的抗原濃度。 本發(fā)明的技術解決方案具體為
第一步二水合乙酸鋅與乙醇按2 : 1 ~25 : 1克/升混合，60 8(TC回流2.5 4小 時，溶解，冷至室溫；
第二步 一水合氫氧化鋰與乙醇按0.6 : 1 ~6 : 1克/升混合，超聲溶解；
第三步將第一步和第二步所得溶液混合，置于高壓釜中，密封，使其能承受壓 力不小于2xl()Spa，加熱至60 100'C,保持0.5-3小時，自然冷卻至室溫，取出，離 心，用去離子水清洗三次，得到氧化鋅量子點；
第四步將氧化鋅量子點分散到抗體溶液中，氧化鋅量子點質量與抗體溶液體積 比為2.5 : 1 ~25 : 1克/升，33 37。C震蕩1~3小時，離心，用pH6.8~7.5磷酸鹽緩沖溶 液清洗三次；最終分散于pH6.8 7.5磷酸鹽緩沖溶液中，不用時保存于冰箱保溫層；
第五步載片修飾，分兩類載片，①金片，浸于等摩爾濃度的5~15毫摩爾/升的 11—巰基一i"^一垸酸(MUA)和ll一巰基一十一烷醇(MU)的乙醇溶液中，0~8°C 保持18小時，取出用去離子水清洗；②二氧化硅片或玻璃片，浸于5~15毫摩爾/毫升 3—胺基—三乙氧基硅丙烷(APTS)的乙醇溶液中，35 45'C保持2 5小時，用去乙醇 清洗，再浸于5 15毫摩爾/毫升戊二醛水溶液中1~3小時，取出，用去離子水清洗；
第六步將第五步得到的載片安裝到自制的電解池中，向電解池中注入抗體溶 液，使注入的抗體溶液體積至少能全部浸沒反應液腔內的載片面積且至多不溢出反應 液腔，33 37'C保持1~3小時，用pH6.8 7.5磷酸鹽緩沖溶液注入清洗；
第七步向電解池中注入的抗原溶液，使注入的抗原溶液體積至少能全部浸沒反 應液腔內的載片面積且至多不溢出反應液腔，33 37'C保持1~3小時，用pH6.8 7.5磷酸鹽緩沖溶液注入清洗；
第八步將第四步制得的標記了氧化鋅量子點的抗體溶液注入電解池中，使注入 的溶液體積至少能全部浸沒反應液腔內的載片面積且至多不溢出反應液腔，33~37°C 保持1 3小時，用pH6.8 7.5磷酸鹽緩沖溶液注入清洗，取出載片，室溫真空干燥2 小時；
第九步測定載片上氧化鋅量子點的熒光強度；
第十步改變第七步的抗原溶液濃度，重復第七、八、九步，測定一系列抗原濃 度相對應的氧化鋅量子點的熒光強度，建立熒光強度與抗原濃度之間的關系。
以上過程測得的氧化鋅量子點熒光強度與抗原濃度之間的關系是本發(fā)明方法中的 重要的基礎數據，為用此發(fā)明方法進行臨床檢測提供濃度判定的參考依據，對利用本 發(fā)明方法進行快速、準確的臨床檢測有著極其重要的意義。
上述抗體與抗原為肝癌首選標志物a—胎蛋白(AFP)及其對應抗體，肺癌結腸癌 首選標志物(CEA)及其對應抗體，胰腺癌首選標志物(CA19-9)及其對應抗體，卵巢癌 首選標志物(CA 125)及其對應抗體。
上述載片為金片、二氧化硅片或玻璃片。
有益效果與現有技術相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點
1. 本發(fā)明液相法制備氧化鋅量子點設備和工藝簡單，制得的氧化鋅量子點粒徑 均一，條件可控，重復性好。
2. 本發(fā)明氧化鋅量子點對抗體的標記過程與溶出過程在自主設計的電解池中進
行，操作簡單，條件溫和，量子點與抗體的結合穩(wěn)定牢固。非常有利于保持 抗體的生物活性。
3. 本發(fā)明運用氧化鋅量子點的熒光特性進行測試，測試快速方便，靈敏度高， 選擇性好。
圖1是本發(fā)明測定方法的流程圖。
圖2是本發(fā)明實例測定方法的流程圖。
具體實施方式
(如圖2)
第一步0.55克二水合乙酸鋅加25毫升乙醇，8(TC回流3小時，乙酸鋅溶 解，冷至室溫。
第二步將0.148克一水合氫氧化鋰加25毫升乙醇，超聲10分鐘溶解。
第三步將第一步和第二步所得溶液混合，加乙醇稀釋10倍，置于高壓釜中， 密封，使其能承受壓力不小于2xl()Spa，加熱至7(TC，保持1小時，自然冷卻至室 溫，取出，離心，用去離子水清洗三次，得到氧化鋅量子點。
第四步將5毫克氧化鋅量子點分散到100微升5微克/毫升的CA19 — 9抗體溶 液中，35。C震蕩l小時，離心，用pH7.4磷酸鹽緩沖溶液清洗三次。最終分散于l毫 升pH7.4磷酸鹽緩沖溶液中，不用時保存于冰箱保溫層。
第五步lxl厘米二氧化硅片浸于10毫摩爾/毫升APTS的乙醇溶液中，4(TC保 持3小時，用乙醇清洗，再浸于10毫摩爾/毫升戊二醛水溶液中4(TC保持3小時，取 出，用去離子水清洗。
第六步將第五步得到的二氧化硅片安裝到自制的電解池中，向電解池中注入 100微升5微克/毫升的CA19 — 9抗體溶液，35'C保持1小時，用pH7.4磷酸鹽緩沖溶 液注入清洗。
第七步向電解池中注入50微升10U的CA19—9抗原溶液，35。C保持1小 時，用pH7.4磷酸鹽緩沖溶液注入清洗。
第八步取IOO微升第四步制得的標記了氧化鋅量子點的CA19—9抗體溶液注 入電解池中，35'C保持1小時，用pH7.4磷酸鹽緩沖溶液注入清洗，取出二氧化硅 片，常溫真空干燥2小時。
第九步測定二氧化硅片上氧化鋅量子點的熒光強度。
第十步改變第七步的抗原溶液濃度，每一次增加20U，重復第七、八、九 步，測定一系列抗原濃度相對應的氧化鋅量子點的熒光強度，建立熒光強度與抗原濃 度之間的關系。繪制量子點熒光強度與抗原濃度之間的關系曲線，為樣品實測提供標 準依據。
權利要求
1、一種氧化鋅量子點標記抗體的熒光免疫測定方法，其特征在于利用液相反應制備氧化鋅量子點，得到粒徑均一、分散性好的氧化鋅量子點，把該量子點標記到抗體上；同時在電解池中的載片上固定化一層抗體，在一系列已知濃度的待測抗原溶液中，使標記了氧化鋅量子點的抗體和載片上的抗體均與抗原進行特異性結合，把標記在抗體上的氧化鋅量子點連接到載片上；然后測定載片上氧化鋅量子點的熒光強度，建立氧化鋅熒光強度與與抗原濃度之間的標準對應關系，用實際樣品檢測時得到的氧化熒光強度與此標準對應關系相對照即可確定實際樣品的抗原濃度。
2、 根據權利要求l所述的氧化鋅量子點標記抗體的熒光免疫測定方法，其特征 在于具體測定方法為第一步二水合乙酸鋅與乙醇按2 : 1~25 : 1克/升混合，60 80。C回流2.5 4小 時，溶解，冷至室溫；第二步 一水合氫氧化鋰與乙醇按0.6 : 1~6 : l克/升混合，超聲溶解；第三步將第一步和第二步所得溶液混合，置于高壓釜中，密封，使其能承受壓力不小于2xl()Spa，加熱至60 100'C，保持0.5 3小時，自然冷卻至室溫，取出，離 心，用去離子水清洗三次，得到氧化鋅量子點；第四步將氧化鋅量子點分散到抗體溶液中，氧化鋅量子點質量與抗體溶液體積 比為2.5 : 1 ~25 : 1克/升，33 37t震蕩1~3小時，離心，用pH6.8~7.5磷酸鹽緩沖溶 液清洗三次；最終分散于pH6.8 7.5磷酸鹽緩沖溶液中，不用時保存于冰箱保溫層；第五步載片修飾，分兩類載片，①金片，浸于等摩爾濃度的5~15毫摩爾/升的 11_巰基—H^—烷酸(MUA)和ll一巰基一i~一垸醇(MU)的乙醇溶液中，0~8°C 保持18小時，取出用去離子水清洗；②二氧化硅片或玻璃片，浸于5~15毫摩爾/毫升 3—胺基—三乙氧基硅丙烷(APTS)的乙醇溶液中，35 45。C保持2 5小時，用去乙醇 清洗，再浸于5 15毫摩爾/毫升戊二醛水溶液中1~3小時，取出，用去離子水清洗；第六步將第五步得到的載片安裝到自制的電解池中，向電解池中注入抗體溶 液，使注入的抗體溶液體積至少能全部浸沒反應液腔內的載片面積且至多不溢出反應液腔，33 37'C保持1~3小時，用pH6.8~7.5磷酸鹽緩沖溶液注入清洗；第七步向電解池中注入的抗原溶液，使注入的抗原溶液體積至少能全部浸沒反應液腔內的載片面積且至多不溢出反應液腔，33 37'C保持1~3小時，用pH6.8 7.5磷酸鹽緩沖溶液注入清洗；第八步將第四步制得的標記了氧化鋅量子點的抗體溶液注入電解池中，使注入的溶液體積至少能全部浸沒反應液腔內的載片面積且至多不溢出反應液腔，33~37°C保持1 3小時，用pH6.8 7.5磷酸鹽緩沖溶液注入清洗，取出載片，室溫真空干燥2小時；第九步測定載片上氧化鋅量子點的熒光強度；第十步改變第七步的抗原溶液濃度，重復第七、八、九步，測定一系列抗原濃 度相對應的氧化鋅量子點的熒光強度，建立熒光強度與抗原濃度之間的關系。
3、根據權利要求2所述的氧化鋅量子點標記抗體的熒光免疫測定方法，其特征 在于所述載片為金片、二氧化硅片或玻璃片。
全文摘要
氧化鋅量子點標記抗體的熒光免疫測定方法是將用氧化鋅量子點標記的抗體與固定在裁片上的抗體通過抗原的特異性反應結合在一起，利用氧化鋅量子點的熒光特性測定被固定于載片上的氧化鋅的熒光強度，建立氧化鋅量子點的熒光強度與抗原濃度之間的關系的標準曲線，從而定量的確定實測樣品抗原濃度的方法。本發(fā)明方法制備的氧化鋅量子點粒徑均一，分散性好，與抗體結合穩(wěn)定，檢測結果穩(wěn)定可靠，重現性好，為醫(yī)學臨床早期檢測疾病抗原提供了一條快速可靠的檢測途徑。在臨床早期診斷方法應用有著巨大的應用潛力。
文檔編號G01N1/28GK101587071SQ20091003213
公開日2009年11月25日 申請日期2009年7月1日 優(yōu)先權日2009年7月1日
發(fā)明者劉松琴, 徐春祥, 朱光平, 王明亮, 谷保祥 申請人:東南大學