專利名稱：涉及昆蟲膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的調(diào)節(jié)害蟲的生理狀況的試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)害蟲的生理狀況、涉及昆蟲膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的試劑等。
背景技術(shù)：
膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(乙酰CoA:膽堿0-乙酰轉(zhuǎn)移酶，EC 2. 3. 1. 6 ；同義詞膽堿乙酰 化酶，膽堿0-乙酰轉(zhuǎn)移酶；ChAT)是負(fù)責(zé)催化神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿從其前體乙酰輔酶A(乙酰 CoA)和膽堿生物合成的酶。乙酰膽堿是被報道的第一種神經(jīng)遞質(zhì)，并且其在一些重要的大 腦過程如學(xué)習(xí)、記憶和睡眠中具有關(guān)鍵的作用。乙酰膽堿在周圍和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的膽堿能 神經(jīng)元中發(fā)揮作用。在周圍神經(jīng)系統(tǒng)中，乙酰膽堿通過神經(jīng)元_肌肉連接刺激肌肉收縮，并 且在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，乙酰膽堿促進學(xué)習(xí)和短時記憶形成。對于來自包括昆蟲的無脊椎動物的膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶有如下的許多報道。線蟲 (C. elegans)膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶富集在膽堿能神經(jīng)元的聯(lián)會區(qū)(Duerr等人，中西海岸蠕蟲 會議摘要(Midwest Worm Meeting abstract) 39)。線蟲膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的功能缺失 突變導(dǎo)致在Ll幼蟲期時生長停滯，并導(dǎo)致死亡(Yook和Jorgensen，西海岸蠕蟲會議摘要 (West Coast Worm Meetingabstract) 260)。線蟲膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的嚴(yán)重功能下降突 變導(dǎo)致生長緩慢，身材小以及不規(guī)律的排便周期(Rand和Russell，遺傳學(xué)(Genetics)， 106(2) :227-248，1984)。突變導(dǎo)致對乙酰膽堿酯酶抑制劑如涕滅威(aldicarb)或敵百蟲 (trichlorfon)耐藥，可能是由于乙酰膽堿的合成低下導(dǎo)致(Rand和RusselLGenetics (遺 傳學(xué))，106 (2) :227-248，1984)。在黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)的所有發(fā)育階段中，膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶廣 泛地分布在其中樞神經(jīng)系統(tǒng)中(Gorczyca和Hall，神經(jīng)科學(xué)雜志(J. Neurosci. )，7 (5) 1361-1369,1987)。黑腹果蠅膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的隱性非條件性功能缺失突變體在胚 胎晚期死亡(Greenspan，比較生理學(xué)雜志(J. Comp. Physiol.), 137 (1) :83_92，1980)。黑 腹果蠅膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的溫度敏感性功能下降突變體在限制性溫度下孵育后發(fā)生癱瘓 (Kitamoto等人，神經(jīng)生物學(xué)(J. Neurobiol.), 42 (2) :161_171，2000)。在黑腹果蠅膽堿乙 酰轉(zhuǎn)移酶基因座處使用溫度敏感性功能缺失突變，已經(jīng)顯示正常乙酰膽堿代謝不是神經(jīng)系 統(tǒng)的初始形成所必需的，但是對于隨后其結(jié)構(gòu)完整性和功能的維持其是必需的(Chase和 Kankel，發(fā)育生物學(xué)(Dev. Biol.), 125(2) :361_380，1988)。過去農(nóng)藥的發(fā)現(xiàn)基于隨機篩選方法，經(jīng)常直接檢測特定化學(xué)物質(zhì)對整個生物體諸 如昆蟲、真菌和/或植物的作用，并且測定生物活性。一旦發(fā)現(xiàn)具有適當(dāng)?shù)纳锘钚缘幕瘜W(xué) 化合物，需要更深入的研究來具體地在分子水平確定這些化合物的作用模式或作用部位， 以便預(yù)測這些化合物的安全性和環(huán)境載荷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明描述一種更加基于目標(biāo)的篩選農(nóng)業(yè)化學(xué)品的方法，其中針對特定的目標(biāo)篩選化合物，所述目標(biāo)已經(jīng)鑒定為與化學(xué)干擾目標(biāo)部位以控制害蟲生物體的目的在生物學(xué)和
/或生理學(xué)上相關(guān)。具體地，本發(fā)明描述了使用一種調(diào)節(jié)害蟲的生理狀況并具有調(diào)節(jié)昆蟲膽堿乙酰轉(zhuǎn) 移酶的活性的能力的試劑用于控制害蟲。S卩，本發(fā)明提供1. 一種調(diào)節(jié)害蟲的生理狀況的試劑，其中所述試劑具有調(diào)節(jié)昆蟲膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶 的活性的能力。2.根據(jù)第1項所述的試劑，其中所述膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶是棉蚜膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶；3.根據(jù)第1項所述的試劑，其中所述試劑是殺蟲劑；4.根據(jù)第1項所述的試劑，其中所述調(diào)節(jié)昆蟲膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性的能力是抑 制所述昆蟲膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶與乙酰輔酶A和膽堿的反應(yīng)的能力。5. 一種殺蟲劑，包括具有調(diào)節(jié)昆蟲膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性的能力的物質(zhì)或所述物 質(zhì)的農(nóng)業(yè)上可接受的鹽作為活性成分；6.根據(jù)第5項所述的殺蟲劑，其中所述物質(zhì)具有抑制所述昆蟲膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶與 乙酰輔酶A和膽堿的反應(yīng)的能力；7.根據(jù)第6項所述的殺蟲劑，其中所述物質(zhì)具有在無細(xì)胞系統(tǒng)中抑制所述昆蟲膽 堿乙酰轉(zhuǎn)移酶與乙酰輔酶A和膽堿的反應(yīng)的能力，其中在10 μ M或更多的所述物質(zhì)的存在 下，所述膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性低于不存在所述物質(zhì)時的活性；8.根據(jù)第6項所述的殺蟲劑，其中所述物質(zhì)具有在無細(xì)胞系統(tǒng)中以ΙΟΟμΜ或更小 的IC5tl抑制所述昆蟲膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶與乙酰輔酶A和膽堿的反應(yīng)的能力；9. 一種測定測試物質(zhì)的殺蟲活性的方法，包括(1)測定反應(yīng)系統(tǒng)中選自下面A組中的膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性的第一步驟，在所 述反應(yīng)系統(tǒng)中所述膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶與測試物質(zhì)接觸；以及(2)基于通過比較在所述第一步驟中測定的活性與對照的活性而獲得的差值評價 所述測試物質(zhì)的殺蟲活性的第二步驟<Α 組 >(a)包括SEQ ID NO 1的氨基酸序列的蛋白；(b)包括SEQ ID NO :1的氨基酸序列中缺失、添加或置換一個或多個氨基酸的氨 基酸序列的蛋白，其中所述蛋白具有膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性；(c)包括與SEQ ID NO :1的氨基酸序列具有50%或更高的序列同一性的氨基酸序 列的蛋白，其中所述蛋白具有膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性；(d)包括與SEQ ID NO :1的氨基酸序列具有75%或更高的序列相似性的氨基酸序 列的蛋白，其中所述蛋白具有膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性；(e)包括由SEQ ID NO :2或3的核苷酸序列編碼的氨基酸序列的蛋白；(f)包括由與SEQ ID NO :2或3的核苷酸序列具有50%或更多的序列同一性的核 苷酸序列編碼的氨基酸序列的蛋白，其中所述蛋白具有膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性；
(g)包括由多核苷酸編碼的氨基酸序列的蛋白，其中所述多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件 下與包括與SEQ ID NO :2或3的核苷酸序列互補的核苷酸序列的多核苷酸雜交，并且其中 所述蛋白具有膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性；
(h)包括昆蟲膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列的蛋白；以及(i)包括棉蚜膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列的蛋白；10. 一種篩選殺蟲物質(zhì)的方法，包括選擇具有由第9項所述的方法評價的所述殺 蟲活性的物質(zhì)；11. 一種殺蟲劑，包括通過第10項所述的方法選擇的物質(zhì)或其農(nóng)業(yè)上可接受的鹽 作為活性成分；12. 一種控制害蟲的方法，包括向害蟲、所述害蟲的棲息地或要保護免受所述害蟲傷害的植物施用有效量的第5、6、7、8或11項所述的殺蟲劑；13. —種控制害蟲的方法，包括鑒定具有由第9項所述的方法評價的所述殺蟲活性的物質(zhì)，以及將所述害蟲與所述被鑒定的殺蟲物質(zhì)接觸；14. 一種昆蟲膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶，包括選自下列B組的氨基酸序列<B組〉(a) SEQ ID NO 1 的氨基酸序列；(b)SEQ ID NO :1的氨基酸序列中缺失、添加或置換一個或多個氨基酸的氨基酸序 列，其中所述氨基酸序列具有膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性；(c)與SEQ ID NO=I的氨基酸序列具有50%或更高的序列同一性的氨基酸序列， 其中所述氨基酸序列具有膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性；(d)與SEQ ID NO 1的氨基酸序列具有75%或更高的序列相似性的氨基酸序列， 其中所述氨基酸序列具有膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性；(e)由SEQ ID NO :2或3的核苷酸序列編碼的氨基酸序列；(f)由與SEQ ID NO :2或3的核苷酸序列具有50%或更多的序列同一性的核苷酸 序列編碼的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性；(g)由多核苷酸編碼的氨基酸序列，其中所述多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下與包括與 SEQ ID NO :2或3的核苷酸序列互補的核苷酸序列的多核苷酸雜交，并且其中所述氨基酸 序列具有膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性；和(h)棉蚜膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列；15.昆蟲膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶作為提供評價殺蟲活性的指標(biāo)的試劑的應(yīng)用；16.第14項所述的昆蟲膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶作為提供評價殺蟲活性的指標(biāo)的試劑的 應(yīng)用；17. 一種多核苷酸，包括編碼第14項所述的膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列的核苷 酸序列；18.根據(jù)第17項所述的多核苷酸，包括SEQ ID NO :2或3的核苷酸序列；19. 一種多核苷酸，包括與第17項或第18項所述的多核苷酸的核苷酸序列互補的 核苷酸序列；20. —種多核苷酸，包括第17項或第18項所述的多核苷酸的部分核苷酸序列；或與所述部分核苷酸序列互補的核苷酸序列；21.根據(jù)第20項所述的多核苷酸，包括SEQ ID NO :4或5的核苷酸序列；22. 一種獲得包括編碼膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的方法，包括使用第20項或第21項所述的多核苷酸作為引物，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增所需 多核苷酸；鑒定擴增的所需多核苷酸；以及回收所述鑒定的多核苷酸；23. 一種獲得包括編碼膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的方法，包括使用第19項、第20項或第21項所述的多核苷酸作為探針，通過雜交檢測所需多 核苷酸；鑒定檢測到的所需多核苷酸；以及回收所述鑒定的多核苷酸；24. 一種環(huán)狀多核苷酸，包括第17項或第18項所述的多核苷酸的核苷酸序列，其 中所述核苷酸序列可操作地連接于噬菌體啟動子；25.根據(jù)第24項所述的環(huán)狀多核苷酸，其中所述啟動子為T7RNA聚合酶基因啟動 子；26.根據(jù)第24項或第25項所述的環(huán)狀多核苷酸，其中所述多核苷酸包括用于在宿 主細(xì)胞中自主復(fù)制的復(fù)制起點；27. 一種產(chǎn)生環(huán)狀多核苷酸的方法，包括將第17項或第18項所述的多核苷酸連接 到載體中；28. 一種轉(zhuǎn)化體，其中導(dǎo)入了第17項或第18項所述的多核苷酸；29.根據(jù)第28項所述的轉(zhuǎn)化體，其中所述轉(zhuǎn)化體是轉(zhuǎn)化的大腸桿菌；30. 一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)化體的方法，包括將第17項或第18項所述的多核苷酸導(dǎo)入至宿主 細(xì)胞中；31. 一種產(chǎn)生膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的方法，包括培養(yǎng)第28項或第29項所述的轉(zhuǎn)化體以 及回收產(chǎn)生的膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的步驟；32.第14項所述的膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶或第17項-第21項中任意一項所述的多核苷 酸作為研究工具的應(yīng)用；33.根據(jù)第32項所述的應(yīng)用，其中所述研究工具是用于篩選殺蟲物質(zhì)的實驗工 具；和34. —種系統(tǒng)，包括輸入、儲存和管理關(guān)于測試物質(zhì)的能力的數(shù)據(jù)信息的裝置，其中所述的能力是調(diào) 節(jié)昆蟲膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性的能力；基于所需的標(biāo)準(zhǔn)查詢和檢索所述數(shù)據(jù)信息的裝置；和顯示和輸出查詢和檢索的結(jié)果的裝置。本發(fā)明的實施方式下面將詳細(xì)地解釋本發(fā)明。在本發(fā)明中，“害蟲”指通過直接傷害人和動物或通過損害莊稼使人類生活受傷害 或不適的小動物。其實例包括節(jié)肢動物諸如昆蟲、螨類和虱類和線蟲類，并且其典型的實例 如下
半翅目(Hemiptera)飛風(fēng)科(Delphacidae)如灰飛風(fēng)(Laodelphax striatellus)、揭飛虱(Nilaparvata lugens)和白背稻飛虱(Sogatella furcifera)，角頂葉蟬科 (Deltocephalidae)如黑尾葉蝶(Nephotettix cincticeps)禾口 Empoasca onukii,蟲牙科 (Aphididae)如棉蟲牙(Aphis gossypii)禾口桃蟲牙(Myzus persicae),蟲春科(Pentatomidae), 粉虱科(Aleyrodidae)如溫室粉虱(Trialeurodesvaporariorum)、甘薯粉虱(Bemisia tabaci)和 Bemisia argentifolli,蚧科(Coccidae)，網(wǎng)蝽科(Tingidae)，木虱科 (Psyllidae)，等；鱗翅目(L印idoptera)螟蛾科(Pyralidae)如二 化螟(Chilo suppressalis)、稻縱卷葉 Sf _ (Cnaphalocrocis medinalis) >yjfl 玉 f _ (Ostrinia nuhilalis)禾口 Parapediasiateterrella，夜娥科(Noctuidae)如斜岐貪夜娥(Spodoptera litura)、貪夜 _ (Spodoptera exigua)(Pseudaletia separata)(Mamestrabrassicae)、 小地老虎(Agrotis ipsilon)、粉夜蛾屬(Trichoplusia spp.)、實夜蛾屬(Heliothis spp. )、Helicoverpa spp.和山卷蛾(Earias spp.)，粉蝶科(Pieridae)如菜粉 蝶日本亞種(Pieris rapae crucivora)，卷蛾科(Tortricidae)如棉褐帶卷蛾 (Adoxophyes orana fasciata)、梨小食心蟲(Grapholitamolesta)禾口 蘋果皮小卷娥 (Cydia pomonella),蟲主果娥禾斗(Carposinidae)如桃蟲主果娥(Carposina niponensis), Bucculatricidae 如桃潛夜蛾(Lyonetiaclerkella)，細(xì)蛾科(Gracillariidae)如金紋 小潛細(xì)蛾(Phyllonorycterringoniella)，夜?jié)摱昕?Phyllocnistidae)如柑橘夜?jié)摱?(Phyllocnistiscitrella)，巢娥科(Yponomeutidae)如小菜娥(Plutella xylostella), 麥蛾科(Gelechiidae)如紅鈴麥蛾(Pectinophora gossypiella)，燈蛾科(Arctiidae)，谷 蛾科(Tineidae)，等；雙翅目(Diptera)庫蚊屬(Culex)如淡色庫蚊(Culex pipiens pallens)、三帶喙庫蚊 (Culestritaeniorhynchus)禾口致倦庫岐(Culex quinquefasciatus)，伊岐屬(Aedes) 如埃及伊岐(Aedes aegypti)禾口白紋伊岐(Aedes albopictus)，按岐屬(Anopheles) 如中華按岐(Anophelinae sinensis)，搖岐科(Chironomidae)，妮科(Muscidae)如家 蠅(Musca domestica)禾口 廄腐蠅(Muscina stabulans),麗蠅科(Calliphoridae),麻 妮禾斗(Sarcophagidae)，夏廁妮(Fannia canicularis)，花妮禾斗(Anthomyiidae)如灰 地種蠅(Delia Platura)和蔥地種蠅(Deliaantigua)，實蠅科(Trypetidae)，果蠅科 (Drosophilidae)，毛蠓科(Psychodidae)，蚋科(Simuliidae)，虻科(Tabanidae)，螫蠅科 (Stomoxyidae)，潛妮禾斗(Agromyzidae)，等；翹翅目(Coleoptera)谷物食蟲(Diabrotica)如西方谷物食蟲(Diabrotica virgifera virgifera)禾口 胃力 I · Ji (Diabrotica undecimpunctata howardi), ik ^l1 (Scarabaeidae)如古銅異麗金龜(Anomala cuprea)禾口多色異麗金龜(Anomala rufocuprea),象蟲禾斗(Curculionidae)如玉米象(Sitophiluszeamais)、禾 S /K 象 (Lissorphoptrus oryzophilus)禾口綠豆象(Calosobruchyschinensis),擬步甲禾斗(Tenebrionidae)如黃粉甲(Tenebrio moIitor)禾口赤擬谷盜(Tribolium castaneum)， Bf 甲科(Chrysomelidae)如 /K 稻負(fù)泥蟲(Oulema oryzae)、黃守瓜(Aulacophora femoral is)、黃曲條菜跳甲(Phyllotreta striolata)和馬鈴薯葉甲(Leptinotarsa decemlineata)，竊蠹科(Anobiidae)，瓢蟲(Epilachna spp.)如 二十八斑瓢蟲 (Epilachnavigintioctopunctata)，^(Lyctidae)，jkM.^ (Bostrychidae)，^牛禾斗 (Cerambycidae)，毒β急@蟲(Paederus fuiscipes)，等；纓翅目(Thysanoptera)薊馬科(Thripidae)，如包括棕櫚薊馬(Thripspalmi)的薊馬屬(Thripsspp.)， 包括西方花薊馬(Flankliniella occidentalis)的花薊馬屬(Frankliniellaspp.)，包括 Sciltothrips dorsalis 白勺 Sciltothrips，管I^j馬禾斗(Phlaeothripidae)，等；膜翅目(Hymenoptera)葉蜂科(Tenthredinidae)，蟻科(Formicidae)，胡蜂科(Vespidae)，等；網(wǎng)翅目(Dictyoptera)蜚蠊科(Blattidae)，Blattellidae,等；直翅目(Orthoptera)劍角蝗科(Acrididae)，螻蛄科(Gryllotalpidae)，等；圣目(Siphonaptera)人蚤(Pulex irritans)，等；虱目(Anoplura)體Ml (Pediculus humanus capitis)，等；等翅目(Isoptera)白蟻科(Termi t i dae)，等；蜱螨目(Acarina)葉螨科(Tetranychidae)如 二 斑葉螨(Tetranychus urticae)、神澤氏葉螨 (Tetranychus kanzawai)、ttt tit H 蟲菌(Panonychus citri)、m L (Panonychus ulmi)和小爪螨屬(Oligonychus spp.)，癭螨科(Eriophyidae)如橘刺皮癭螨(AcuIops pelekassi)和斯氏針刺癭螨(Aculusschlechtendali)，附線螨科(Tarsonemidae)如 側(cè)多食跗線螨(Polyphagotarsonemus latus),細(xì)須螨科(Tenuipalpidae),杜克螨科 (Tuckerellidae),硬蝶禾斗(Ixodidae)如長角血蝶(Haemaphysalislongicornis)、褐黃血蝶(Haemaphysalis flava)、臺灣革蝶(Dermacentortaiwanicus)、卵形硬蝶(Ixodes ovatus)、全溝硬蝶(Ixodes persulcatus)禾口微小牛蝶(Boophilus microplus)，粉觸科 (Acaridae)如腐食酪螨(Tyrophagus putrescentiae),皮刺螨禾斗(Dermanyssidae),肉食 蟲茜禾斗(Cheyletidae)如粉塵蟲茜(Dermatophagoides farinae)禾口屋塵蟲茜(Dermatophagoides ptrenyssnus),諸如普通肉食觸(Cheyletus eruditus)、馬六甲肉食觸(Cheyletus malaccensis)禾口 Cheyletus moorei、皮刺螨(Dermanyssus spp.)，等；線蟲類(Nematodes)咖啡短體線蟲(Pratylenchus coffeae)，偽短體線蟲(Pratylenchus fallax)，大 豆異皮線蟲(Heterodera glycines)，馬鈴暮金線蟲(Globoderarostochiensis)，北方牛艮結(jié) 線蟲(Meloidogyne hapla),南方根結(jié)線蟲(Meloidogyne incognita),等。
在本發(fā)明中，“調(diào)節(jié)害蟲的生理狀況”是指將諸如活體內(nèi)各種現(xiàn)象或其機制的狀況 改變成不同于通常狀況的狀況，所述現(xiàn)象是用于維持害蟲生存的現(xiàn)象，例如，諸如呼吸、消 化、分泌、體液循環(huán)、新陳代謝和神經(jīng)傳遞。實例包括通過停止呼吸以致不提供用于害蟲體 內(nèi)新陳代謝所必需的氧氣而改變狀況，和通過停止害蟲的神經(jīng)傳遞功能以致害蟲的各種運 動停止而改變狀況。 在本發(fā)明中，“調(diào)節(jié)害蟲的生理狀況的試劑”是當(dāng)施用于害蟲時可以調(diào)節(jié)害蟲的生 理狀況的試劑。在本發(fā)明中，“昆蟲膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶”是指在昆蟲中存在的膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶，是 在各種生物體中存在的膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶之一。在本文中，昆蟲是在動物界(Animalia)， 節(jié)肢動物門(Arthropod)，昆蟲綱(Insecta)下分類的動物，并且它的實例包括下列 各目的節(jié)肢動物原尾目(Protura，彈尾目(Collembola)，雙尾目(Diplura)，纓尾目 (Thysanura),蜉蝣目(Ephemeroptera),蜻蜒目(Odonata),織翼夜蛾目(Plecoptera)， 蛩蠊目(Grylloblattodea)，直翅目(Orthoptera)，竹節(jié)蟲目(Phasmatodea)，革翅目 (Dermaptera), if g (Mantodea), Blattaria, S (Isoptera), g (Embioptera), 嚙蟲目(Psocoptera)，食毛目(Mallophaga)，虱目(Anoplura)，纓翅目(Thysanoptera)，半 翅目(Hemiptera)，脈翅目(Neuroptera)，長翅目(Mecoptera)，毛翅目(Trichoptera)J-翅目(L印idoptera)，鞘翅目(Coleoptera)，雙翅目(Diptera)，膜翅目(Hymenoptera)，蚤 巨(Siphonaptera), § (Strepsiptera)，等。膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(乙酰CoA:膽堿O-乙酰轉(zhuǎn)移酶，EC 2. 3. 1. 6 ；同義詞膽堿乙酰 化酶，膽堿O-乙酰轉(zhuǎn)移酶；ChAT)催化神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿從其前體乙酰輔酶A(乙酰CoA)和 膽堿合成的反應(yīng)。膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性可使用基于放射性測量的體外測定法來監(jiān)測。例如，如 Heo Ho-Jin等人，生物科學(xué)、生物技術(shù)和生物化學(xué)(Biosci. Biotechnol. Biochem.) ,67(6)， 1284-1291,2003所報道的，在使用放射性標(biāo)記的14C乙酰輔酶A在乙酰輔酶A和膽堿的底 物上進行膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶催化的反應(yīng)后，用四苯硼(TPB)萃取形成的14C-乙酰膽堿。將兩 相分離，并在液體閃爍計數(shù)器上測量上面的相的放射活性?？捎脕頊y量膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的另一種測定法是吸光度測定法。吸光度測定法 的原理是可通過使用5，5’_ 二硫代-雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)試劑測量由膽堿乙酰轉(zhuǎn)移 酶反應(yīng)形成的游離輔酶A(CoA)來測定膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性。DTNB與溶液中游離的巰基反 應(yīng)以產(chǎn)生5-硫代-2-硝基苯甲酸(TNB)。TNB是黃色的，并且在412nm處具有最大吸光度。 然后此有色的TNB可通過405nm處的吸光度來測量。在上述的膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的測定法中，使用DTNB的測定法優(yōu)選用于在大量 樣品中機械地和有效地測量膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性。具體來說，在乙酰輔酶A和膽堿底物上 進行膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)后，加入DTNB，然后通過酶反應(yīng)形成的游離CoA通過測量405nm處 的吸光度而被定量。昆蟲膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性可通過類似于上述的方法測量。已經(jīng)在不同的昆蟲物種中鑒定了幾種膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列，諸如黑腹 果蠅(亞型A，登記號NP_477004;和亞型B，登記號NP_996239)、赤擬谷盜(Tribolium castaneum)(登記號 XP_975503)、意大利蜜蜂(Apismellifera)(登記號 XP_392463)、埃及伊岐(Aedes aegypti)(登記號 XP_001660851)和岡比亞按岐(Anopheles gambiae)(登記 號XP_312586)，它們可以在公共數(shù)據(jù)庫中找到。 此外，已經(jīng)在不同的昆蟲物種中鑒定了幾種膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的核苷酸序 列，諸如黑腹果蠅(亞型A，登記號NM_057656 ；和亞型B，登記號NM_206517)、赤擬谷盜 (Tribolium castaneum)(登記號 XM_970410)、意大利蜜蜂(Apis mellifera)(登記號 XM_392463)、埃及伊蚊(Aedesaegypti)(登記號 XM_001660801)和岡比亞按蚊(Anopheles gambiae)(登記號XM_312586)，它們可以在公共數(shù)據(jù)庫中找到。另外，根據(jù)下述的方法，可從棉蚜鑒定膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列和膽堿乙酰 轉(zhuǎn)移酶基因的核苷酸序列。鑒定的棉蚜膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列顯示在SEQ ID NO 1 中，并且棉蚜膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的核苷酸序列顯示在SEQ ID N0:2中。已經(jīng)在除昆蟲之外的動物中鑒定了幾種膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列，所述動物 諸如秀麗線蟲(Ceanorhabditis elegans)(登記號 AAB88370)和人類(Homo sapiens)(登 記號NP065574)，它們可在公共數(shù)據(jù)庫中找到。在除昆蟲之外的動物中也已經(jīng)鑒定了幾種膽 堿乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的核苷酸序列，所述動物諸如秀麗線蟲(登記號ZC416. 8)和人類(登記 號NM_020549)，它們可在公共數(shù)據(jù)庫中找到。表1顯示棉蚜膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列(SEQ ID NO 1)和棉蚜膽堿乙酰轉(zhuǎn)移 酶基因的核苷酸序列(SEQ ID NO 2)與在其它動物中發(fā)現(xiàn)的膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶及其基因的序 列的序列同一性。表1 調(diào)節(jié)昆蟲膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的能力是指增加或者減少昆蟲膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活 性的能力，即，意指激活膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的能力，或者抑制膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的能力。并 且，可以向測量膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的反應(yīng)系統(tǒng)中加入測試物質(zhì)，以研究所述測試物質(zhì)對 膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的影響。已經(jīng)知道幾種具有抑制膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性的能力的物質(zhì)，諸如溴化乙酰膽堿 (Sastry 和 Janson，眼科藥理學(xué)雜志(J. Ocular Pharmacol.)，10 :203_215，1994)、茶黃素 (Sugatani 等人，國際變態(tài)反應(yīng)和免疫學(xué)文獻(xiàn)(Int. Arch. Allergy Immunol.)，134 =17-28, 2004)和 α -NETA (Sastry 等人，藥理學(xué)和試驗治療學(xué)雜志(J. Pharmacol. Exp. Ther.), 245 72-80，1988)。反應(yīng)中測試物質(zhì)的IC5tl值意指不含測試物質(zhì)的反應(yīng)的活性的50%被抑制時的測 試物質(zhì)的濃度。測試物質(zhì)的IC5tl值可以通過這樣確定將不同濃度的測試物質(zhì)添加到膽堿 乙酰轉(zhuǎn)移酶活性測量反應(yīng)系統(tǒng)中，測量在加入的測試物質(zhì)的各個濃度(劑量)下的膽堿乙 酰轉(zhuǎn)移酶活性(反應(yīng))，產(chǎn)生劑量-反應(yīng)曲線，并且計算膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性被抑制50%時 所加入的測試物質(zhì)的濃度。更具體地，劑量_反應(yīng)曲線可以使用4參數(shù)邏輯模型或S形劑 量_反應(yīng)模型生成 氣 f.以計算IC5tl值。特別地，IC5tl值可以使用市售的計算軟件XLfit(由IDBS制作) 進行計算。具有調(diào)節(jié)昆蟲膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性的能力的試劑是一種含有具有調(diào)節(jié)昆蟲膽 堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性的能力的物質(zhì)作為活性成分的試劑。在本發(fā)明中，“調(diào)節(jié)害蟲的生理狀況的試劑，其中所述試劑具有調(diào)節(jié)昆蟲膽堿乙酰 轉(zhuǎn)移酶的活性的能力”是一種具有通過前文提及的測量方法鑒定的調(diào)節(jié)昆蟲膽堿乙酰轉(zhuǎn)移 酶的活性的能力的試劑，并且意指可以調(diào)節(jié)害蟲的生理狀況的試劑。所述試劑的優(yōu)選實例包括這樣的試劑，即，其中昆蟲膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶是棉蚜膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶。另外，所述試劑的優(yōu)選實例包括這樣的試劑，即，其中調(diào)節(jié)害蟲的生理狀況的試劑是殺蟲劑。另外，所述試劑 的優(yōu)選實例包括這樣的試劑，即，其中調(diào)節(jié)昆蟲膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性的能力是抑制使用 乙酰輔酶A和膽堿作為底物的反應(yīng)的能力。在本發(fā)明中，“殺蟲劑”是指具有控制害蟲的能力的試劑。除本發(fā)明中公開的方法之外，用于測量控制害蟲的能力的方法的實例還包括，測 定對害蟲的殺蟲活性的方法。具體地，例如，可以按照下述方法檢測殺蟲活性。按照昆蟲飼養(yǎng)手冊(Handbook of Insect Rearing)第1卷(Elsevier科學(xué)出版 社(Elsevier Science Publisers) 1985)第35-36頁所述的方法，除了制備具有表2中所 示的組成的無菌人工飼料之外，并且按人工飼料體積的0. 5%加入在DMSO中的測試試劑溶 液，并且混合，飼養(yǎng)棉蚜，在6天后研究存活的棉蚜的數(shù)目，并且按照下述方程獲得控制值。表2氨基酸_ (mg/100 ml)維生素_(mg/100 ml) 控制值(%) = U-(CbXTai)/(Cai X Tb)} xlOO在所述方程中的字母代表下述含義Cb 在未處理部分中在處理之前存活的蠕蟲數(shù)目Cai 在未處理部分中在觀察時存活的蠕蟲數(shù)目Tb 在未處理部分中在處理之前存活的蠕蟲數(shù)目Tai 在處理部分中在觀察時存活的蠕蟲數(shù)目可以這樣說，表現(xiàn)出顯著高的控制值的測試試劑具有殺蟲活性。優(yōu)選地，可以確 定，具有30%或更大的控制值的測試試劑實質(zhì)上具有殺蟲活性，并且可以確定，具有小于30%的控制值的測試試劑實質(zhì)上沒有殺蟲活性。
本發(fā)明的殺蟲劑包含具有調(diào)節(jié)昆蟲膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性的能力的化學(xué)物質(zhì)或 其農(nóng)業(yè)上可接受的鹽作為活性成分。在本發(fā)明中，農(nóng)業(yè)上可接受的鹽是指以這樣的形式存在的鹽，S卩，控制試劑的制備 及所述制劑的應(yīng)用是可能的，并且可以是任何形式的鹽。具體地，所述鹽的實例包括與無機 酸如鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸、硝酸、和磷酸，有機酸如甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥 珀酸、延胡索酸、馬來酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、甲磺酸、和乙磺酸，或酸性氨基酸如 天冬氨酸和谷氨酸的酸式加成鹽；與無機堿如鈉、鉀、鎂和鋁的鹽，與有機堿如甲胺、乙胺和 乙醇胺，或堿性氨基酸如賴氨酸和鳥氨酸的鹽；以及銨鹽。在本發(fā)明中，“包含具有調(diào)節(jié)昆蟲膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性的能力的物質(zhì)或其農(nóng)業(yè) 上可接受的鹽作為活性成分的殺蟲劑”意指以下試劑，其可以通過包含具有在所述測量方 法中鑒定的調(diào)節(jié)昆蟲膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性的能力的物質(zhì)或其農(nóng)業(yè)上可接受的鹽作為活 性成分而控制害蟲。所述物質(zhì)的優(yōu)選實例包括具有抑制膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶與乙酰輔酶A和膽 堿反應(yīng)的能力的化合物。所述物質(zhì)的更優(yōu)選的實例包括具有在無細(xì)胞系統(tǒng)中抑制昆蟲膽堿 乙酰轉(zhuǎn)移酶與乙酰輔酶A和膽堿反應(yīng)的能力的物質(zhì)，其中在10 μ M或更多的所述物質(zhì)的存 在下，膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性低于在不存在所述物質(zhì)時的活性。另外，所述物質(zhì)的進一步優(yōu) 選的實例包括具有在無細(xì)胞系統(tǒng)中以ΙΟΟμΜ或更小的IC5tl抑制昆蟲膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶與乙 酰輔酶A和膽堿反應(yīng)的能力的物質(zhì)。在本發(fā)明中，“測定測試物質(zhì)的殺蟲活性的方法，其包括測量反應(yīng)系統(tǒng)中選自下面 A組中的膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性的第一步驟，在所述反應(yīng)系統(tǒng)中所述膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶與測 試物質(zhì)接觸；以及基于通過比較在所述第一步驟中測量的活性與對照的活性而獲得的差值 評價所述測試物質(zhì)的殺蟲活性的第二步驟”是指特征在于在用于測定測試物質(zhì)的殺蟲能力 的各種方法中包括所述第一步和所述第二步的方法。在本文中，A組是指(a)包括SEQ ID NO 1的氨基酸序列的蛋白；(b)包括SEQ ID NO :1的氨基酸序列中缺失、添加或置換一個或多個氨基酸的氨 基酸序列的蛋白，其中所述蛋白具有膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性；(c)包括與SEQ ID NO :1的氨基酸序列具有50%或更高的序列同一性的氨基酸序 列的蛋白，其中所述蛋白具有膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性；(d)包括與SEQ ID NO :1的氨基酸序列具有75%或更高的序列相似性的氨基酸序 列的蛋白，其中所述蛋白具有膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性；(e)包括由SEQ ID NO :2或3的核苷酸序列編碼的氨基酸序列的蛋白；(f)包括由與SEQ ID NO :2或3的核苷酸序列具有50%或更多的序列同一性的核 苷酸序列編碼的氨基酸序列的蛋白，其中所述蛋白具有膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性；(g)包括由多核苷酸編碼的氨基酸序列的蛋白，其中所述多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件 下與包括與SEQ ID NO :2或3的核苷酸序列互補的核苷酸序列的多核苷酸雜交，并且其中 所述蛋白具有膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性；(h)包括昆蟲膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列的蛋白；以及(i)包括棉蚜膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列的蛋白。
第一步是在通過將測試物質(zhì)加入到前文提及的各種膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性測量反 應(yīng)系統(tǒng)中而使得膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶與測試物質(zhì)接觸的狀態(tài)下測量膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的步驟。第二步是比較測試物質(zhì)測量的活性與對照物質(zhì)的活性并且基于該差值評價殺蟲 能力的步驟。在本文中，對照意指，例如，在將溶解在溶劑中的測試物質(zhì)添加到反應(yīng)系統(tǒng)中 的情況下，其中只加入與用來溶解所述測試物質(zhì)相同的溶劑的檢測部分。在具有第一步驟和第二步驟的用于測定測試物質(zhì)所擁有的殺蟲能力的方法中，所 用的膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶是在A組中所示的蛋白。在A組的蛋白中，在由(a)表示的蛋白的氨 基酸序列和由(b)，(c)，(e), (f)，(g)，(h)和(i)表示的蛋白的氨基酸序列之間可以識別 的差異是部分氨基酸的缺失、置換、添加等。這些包括，例如，由于具有由(a)表示的氨基酸 序列的蛋白在細(xì)胞中經(jīng)受的加工所引起的缺失。另外，實例包括由以下所產(chǎn)生的氨基酸的 缺失、置換、添加等由于剪接差異或蛋白來源的生物體的個體差異而引起的天然存在的基 因突變，或通過定點誘變、隨機誘變、突變處理等而人工引入的基因突變。經(jīng)受缺失、置換、添加等的氨基酸數(shù)目可以是在可以發(fā)現(xiàn)膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的膽堿 乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的范圍內(nèi)的數(shù)目。另外，氨基酸置換的實例包括用在疏水性、電荷、PH和 空間結(jié)構(gòu)上特征相似的氨基酸進行置換。所述置換的具體實例包括在下列各組中的置換 (1)甘氨酸，丙氨酸；(2)纈氨酸，異亮氨酸，亮氨酸；(3)天冬氨酸，谷氨酸，天冬酰胺，谷氨 酰胺，(4)絲氨酸，蘇氨酸；(5)賴氨酸，精氨酸；(6)苯丙氨酸，酪氨酸等。人工引入氨基酸的缺失、添加或置換(下文，在一些情形中總稱為氨基酸的改 變)的方法的實例包括將定向突變引入到編碼由(a)表示的氨基酸序列的DNA中，并且 然后通過常規(guī)方法表達(dá)這一 DNA的方法。在此處，定點誘變的實例包括應(yīng)用琥珀突變 的方法(缺口雙鏈方法(gapped duplexmethod)，核酸研究(Nucleic Acids Res.)，12， 9441-9456 (1984))、通過使用用于引入突變的引物的PCR的方法等。另外，人工改變氨基酸 的方法的實例包括將突變隨機引入到編碼由(a)表示的氨基酸序列的DNA中并且然后通過 常規(guī)方法表達(dá)這一 DNA的方法。在此處，隨機引入突變的方法的實例包括使用編碼任一種 前文提及的氨基酸序列的DNA作為模板并且使用可以擴增各種全長DNA的引物對在下列反 應(yīng)條件下進行PCR的方法即，在用作底物的各種dATP，dTTP，dGTP和dCTP的添加量從常 規(guī)濃度改變的反應(yīng)條件下，或在促進聚合酶反應(yīng)的Mg2+的濃度從常規(guī)濃度升高的反應(yīng)條件 下。PCR方法的實例包括，例如，在分子生物學(xué)方法(Methodin Molecular Biology)，(31)， 1994,97-112中所述的方法。另一個實例包括在WO 0009682中所述的方法。在本文中，“序列同一性”是指兩個核苷酸序列或兩個氨基酸之間的同一性?！靶?列同一性”通過比較待比較的序列的所有區(qū)域中以最適狀態(tài)排列的兩個序列而確定。在此 處，在待比較的核苷酸序列或氨基酸序列的最佳比對中，可以允許添加或缺失(例如，缺口 等)。可以通過使用如FASTA[Pearson和Lipman，美國科學(xué)院學(xué)報(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)，4，2444-2448 (1988)]、BLAST [Altschul 等，分子生物學(xué)雜志(Journal ofMolecular Biology)，215，403-410(1990)]、和 CLUSTAL W[Thompson, Higgins 和 Gibson，核酸研究 (Nucleic Acid Research)，22，4673-4680 (1994a)]等的程序分析同源性以生成序列比對 來計算序列同一性。所述程序可從日本DNA數(shù)據(jù)庫日本信息生物學(xué)和DNA數(shù)據(jù)庫中心 (Center for InformationBiology and DNA Data Bank of Japan) f= 的國P示 DNA —庫；CIB/DDBJ的網(wǎng)站(http://www.ddbj.nig.ac.jp)上獲得。序列同一性還可以使用市 售的序列分析軟件來分析。具體地，可以使用GENETYX-WIN第5版(由軟件開發(fā)有限公 司(Software Development Co. Ltd.)制造)通過 Lipman-Pearson 方法Lipman，D. J.禾口 Pearson, W. R.，科學(xué)(Science)，227，1435-1441，(1985)分析同源性以生成序列比對而計
算序列同一性。
當(dāng)如上所述的兩個最優(yōu)排列的氨基酸序列在序列中由于保守氨基酸置換而具有 差異時，使用“序列相似性”以便表示置換的氨基酸的保守性。可以這樣說，在具有由保守 氨基酸置換引起的序列中差異的序列對之間存在序列相似性。此種類型的序列相似性可使 用諸如上面FASTA的程序來分析。氨基酸可分為四組疏水性氨基酸、中性氨基酸、酸性氨 基酸和堿性氨基酸。氨基酸被同一組的另一氨基酸置換稱為保守氨基酸置換。疏水氨基酸組包括丙氨酸(A)，纈氨酸(V)，亮氨酸(L)，異亮氨酸(I)，蛋氨酸(M)， 色氨酸(W)，苯丙氨酸(F)和脯氨酸⑵。中性氨基酸組包括甘氨酸(G)，絲氨酸(S)，蘇氨酸(T)，半胱氨酸(C)，酪氨酸(Y)， 天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)。酸性氨基酸組包括天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)。堿性氨基酸組包括賴氨酸(K)，組氨酸(H)和精氨酸(R)。在(g)中所述的“嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件”的實例包括以下條件在該條件下，在根據(jù)例 如，Sambrook J.，F(xiàn)risch E. F.，Maniatis T.，分子克隆第二版，冷泉港實驗室出版社 (Molecular Cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratorypress)中所述白勺常 規(guī)方法進行的雜交中，在45°C下在含有6 X SSC (含有1.5m NaCl和0. 15m檸檬酸鈉的溶液 是10XSSC)的溶液中形成雜交物，并且然后將該雜交物用2XSSC在50°C下洗滌(分子生 物學(xué)(MolecularBiology), John Wiley 和 Sons，紐約(1989) ,6. 3. 1-6. 3. 6) 洗滌步驟中 的鹽濃度可選自從2XSSC(低嚴(yán)謹(jǐn)度條件)至0.2XSSC(高嚴(yán)謹(jǐn)度條件)的條件。洗滌步 驟中的溫度可選自，例如，從室溫(低嚴(yán)謹(jǐn)度條件)至65°C (高嚴(yán)謹(jǐn)度條件)的條件?？蛇x 地，鹽濃度和溫度兩者都可改變。(i)中所述的蛋白表示存在于棉蚜中的膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶，是昆蟲膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶 的一種，并且包括(a)中所述的氨基酸序列。盡管A組的蛋白包括(c)中所述的蛋白，其包括與SEQ ID NO :1的氨基酸序列具有 50%或更高的序列同一性的氨基酸序列，并具有膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性，但可優(yōu)選地使用具 有膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性并包括與SEQ ID N0:1的氨基酸序列具有至少55、60、65、70、75或 80%的序列同一性的氨基酸序列，并且可高度優(yōu)選具有膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性并包括與SEQ ID NO 1的氨基酸序列具有至少85、90或95%的序列同一性的氨基酸序列。盡管A組的蛋白也包括(d)中所述的蛋白，其包括與SEQ ID NO=I的氨基酸序列 具有75%或更高的序列相似性的氨基酸序列，并具有膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性，但可優(yōu)選地使 用具有膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性并包括與SEQ IDNO 1的氨基酸序列具有至少80%的序列相似 性的氨基酸序列，并且可高度優(yōu)選具有膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性并包括與SEQ ID N0:1的氨基 酸序列具有至少85、90或95%的序列相似性的氨基酸序列。具有殺蟲能力的物質(zhì)可以通過使用測量對上文提及的害蟲的殺蟲能力或控制作 用來測定殺蟲能力的方法進行篩選。
可選地，具有殺蟲能力的物質(zhì)還可以通過前文提及的使用膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶測定殺 蟲能力的方法進行篩選。具體地，當(dāng)通過前文提及的使用膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶測定殺蟲能力的 方法鑒定測試物質(zhì)的殺蟲能力是特定的值以上，或者特定的值以下時，可以通過選擇所述 物質(zhì)而篩選具有殺蟲能力的物質(zhì)。由于通過所述篩選方法選擇的物質(zhì)具有殺蟲能力，所以它可以用作包含所述物質(zhì) 或其農(nóng)業(yè)上可接受的鹽作為活性成分的殺蟲劑。害蟲的控制通?？梢酝ㄟ^將有效量的殺蟲劑施用于將被保護的農(nóng)作物、害蟲或害 蟲的棲息地而進行。
當(dāng)將殺蟲劑用于農(nóng)業(yè)和林業(yè)時，其使用量通常關(guān)于每1000m2，殺蟲劑的量為0. 1到 IOOOgo當(dāng)將殺蟲劑配制成乳劑、水可分散的粉劑、易流動的制劑、微膠囊制劑等時，所述試 劑通常通過用水將活性成分稀釋至1到10，OOOppm的濃度，并且將其噴霧而施用，并且當(dāng)殺 蟲劑配制成顆粒劑、粉劑等時，所述試劑通常按照原樣進行施用。殺蟲劑可以通過葉面_處理諸如農(nóng)作物等應(yīng)該保護免受害蟲傷害的植物而使用， 并且還可以通過在移栽農(nóng)作物的植株之前處理苗床，或者處理栽植時的栽植穴或品系基部 (strain base)而使用。此外，為了控制害蟲在耕地的土壤中棲息的目的，可以通過處理 所述土壤而使用所述試劑。可選地，所述試劑可以通過將已經(jīng)加工成薄片或細(xì)線的樹脂制 劑纏繞在農(nóng)作物上，將所述制劑在農(nóng)作物附近鋪開和/或散布在品系基部的土壤表面而使 用。當(dāng)將殺蟲劑用作害蟲控制劑用于防止流行病時，乳劑、水可分散的粉劑、流動劑等 通常通過用水稀釋以致活性成分的濃度為0. 01到10，OOOppm而施用，并且油性試劑、氣溶 膠、薰劑、毒餌等按照原樣進行施用。殺蟲劑的一種用途的實例包括控制家畜如牛、綿羊、山羊和雞或小動物如狗、貓、 大鼠和小鼠的體外寄生蟲，在這種情形中，所述試劑可以通過獸醫(yī)學(xué)已知的方法施用給動 物。作為一種具體的施用方法，當(dāng)意欲全身控制時，例如，所述試劑通過片劑、混合在飼料 中、栓劑、注射劑(肌內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)等)等而施用，當(dāng)意欲非全身控制時，所述試 劑通過噴霧油性試劑或水性液體試劑、在處理時進行傾倒或打點、用洗發(fā)精制劑清洗動物 或給動物附上已經(jīng)加工成項圈或耳簽的樹脂制劑的方法而使用。當(dāng)施用給動物體時殺蟲劑 的量通常在0. 1到1，OOOmg范圍內(nèi)，其表示為每Ikg動物的化合物A和化合物B的總量。它們的施用量和施用濃度都取決于這樣的情形而不同，所述情形諸如制劑種類、 施用時間、施用位置、施用方法、害蟲種類、損害程度等，可以增加或減少，而不管前文提及 的范圍，并且可以適當(dāng)?shù)剡M行選擇。前文提及的殺蟲劑可以用于如上所述的控制害蟲的方法中。另外，還可以通過前文提及的測定測試物質(zhì)擁有的殺蟲能力的方法鑒定具有殺蟲 能力的物質(zhì)(所述鑒定方法包括使用選自A組的膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的第一步驟和第二步驟)， 并且將所鑒定的具有殺蟲能力的物質(zhì)與害蟲接觸而控制害蟲。在此處，為了將所鑒定的具 有殺蟲能力的物質(zhì)與害蟲接觸，可以使用前文提及的制備方法、施用方法等。B組中所示的氨基酸序列是昆蟲膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列，其包含下述(a) 到(h)的任一種氨基酸序列(a) SEQ ID NO 1 的氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO :1的氨基酸序列中缺失、添加或置換一個或多個氨基酸的氨基酸序 列，其中所述氨基酸序列具有膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性；(c)與SEQ ID NO=I的氨基酸序列具有50%或更高的序列同一性的氨基酸序列， 其中所述氨基酸序列具有膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性；(d)與SEQ ID NO=I的氨基酸序列具有75%或更高的序列相似性的氨基酸序列， 其中所述氨基酸序列具有膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性；(e)由SEQ ID NO :2或3的核苷酸序列編碼的氨基酸序列； (f)由與SEQ ID NO :2或3的核苷酸序列具有50%或更多的序列同一性的核苷酸 序列編碼的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性；(g)由多核苷酸編碼的氨基酸序列，其中所述多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下與包括與 SEQ ID NO :2或3的核苷酸序列互補的核苷酸序列的多核苷酸雜交，并且其中所述氨基酸 序列具有膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性；和(h)棉蚜膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列。在B組的氨基酸序列中，在由(a)表示的氨基酸序列和由(b)，(C)，(e)，(f)，(g) 和(h)表示的氨基酸序列之間可以識別的差異是部分氨基酸的缺失、置換、添加等。這些包 括，例如，由于具有由(a)表示的氨基酸序列的蛋白在細(xì)胞中經(jīng)受的加工引起的缺失。另 夕卜，實例包括由下面各項所產(chǎn)生的氨基酸的缺失、置換、添加等由于剪接差異或蛋白來源 的生物體的個體差異而引起的天然存在的基因突變，或通過定點誘變、隨機誘變、突變處理 等而人工引入的基因突變。經(jīng)受缺失、置換、添加等的氨基酸數(shù)目可以是在可以發(fā)現(xiàn)膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的肽酶 活性的范圍內(nèi)的數(shù)目。另外，氨基酸置換的實例包括用在疏水性、電荷、PH和空間結(jié)構(gòu)上特 征相似的氨基酸進行置換。所述置換的具體實例包括在下列各組中的置換(1)甘氨酸，丙 氨酸；(2)纈氨酸，異亮氨酸，亮氨酸；(3)天冬氨酸，谷氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，(4)絲氨 酸，蘇氨酸；(5)賴氨酸，精氨酸；(6)苯丙氨酸，酪氨酸等。人工引入氨基酸的缺失、添加或置換(下文，在一些情形中總稱為氨基酸的改變) 的步驟的實例包括將定點突變引入到編碼由(a)表示的氨基酸序列的DNA中，并且然后通 過常規(guī)方法表達(dá)這一 DNA的方法。在此處，定點誘變的實例包括應(yīng)用琥珀突變的方法(缺 口雙鏈方法，核酸研究(Nucleic Acids Res.)，12，9441-9456 (1984))、通過使用用于引入 突變的引物的PCR的方法等。另外，人工改變氨基酸的步驟的實例包括將突變隨機引入到 編碼由(a)表示的氨基酸序列的DNA中并且然后通過常規(guī)方法表達(dá)這一 DNA的方法。在此 處，隨機引入突變的方法的實例包括使用編碼任一種前文提及的氨基酸序列的DNA作為模 板并且使用可以擴增各種全長DNA的引物對在下列反應(yīng)條件下進行PCR的方法S卩，在用作 底物的每種dATP，dTTP，dGTP和dCTP的添加量從常規(guī)濃度改變的反應(yīng)條件下，或在促進聚 合酶反應(yīng)的Mg2+的濃度從常規(guī)濃度升高的反應(yīng)條件下。PCR方法的實例包括，例如，在分子 生物學(xué)方法(Method in Molecular Biology), (31)，1994，97-112 中所述的方法。另一個 實例包括在WO 0009682中所述的方法。在本文中，“序列同一性”是指兩個核苷酸序列或兩個氨基酸之間的同一性?！靶?列同一性”通過比較待比較的序列的所有區(qū)域中以最適狀態(tài)排列的兩個序列而確定。待 比較的核苷酸序列或氨基酸序列的最佳比對可以允許添加或缺失(例如，缺口等)。可以通過使用如 FASTA[Pearson 和 Lipman，美國科學(xué)院學(xué)報(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)， 4,2444-2448(1988)]、BLAST[Altschul 等，分子生物學(xué)雜志(Journal of Molecular Biology)，215，403-410(1990)]、和 CLUSTAL W[Thompson, Higgins 和 Gibson，核酸研究 (Nucleic Acid Research)，22，4673-4680 (1994a)]等的程序分析同源性以生成序列比對 來計算序列同一性。所述程序可從日本DNA數(shù)據(jù)庫日本信息生物學(xué)和DNA數(shù)據(jù)庫中心 (Center for Information Biology and DNA DataBank of Japan) f= 的國P示 DNA — 庫；CIB/DDBJ]的網(wǎng)站(http://www. ddbj. nig. ac. jp)上獲得。序列同一性還可以使用市 售的序列分析軟件來分析。具體地，可以使用GENETYX-WIN第5版(由軟件開發(fā)有限公 司(Software Development Co. Ltd.)制造)通過 Lipman-Pearson 方法Lipman, D. J.禾口 Pearson, W. R.，科學(xué)(Science)，227，1435-1441，(1985)分析同源性以生成序列比對而計 算序列同一性。當(dāng)如上所述的兩個最優(yōu)排列的氨基酸序列在序列中由于保守氨基酸置換而具有差異時，使用“序列相似性”以便表示置換的氨基酸的保守性?？梢赃@樣說，在具有由保守 氨基酸置換引起的序列中差異的序列對之間存在序列相似性。此種類型的序列相似性可使 用諸如上面FASTA的程序來分析。氨基酸可分為四組疏水性氨基酸、中性氨基酸、酸性氨 基酸和堿性氨基酸。氨基酸被同一組的另一氨基酸置換稱為保守氨基酸置換。疏水氨基酸組包括丙氨酸(A)，纈氨酸(V)，亮氨酸(L)，異亮氨酸(I)，蛋氨酸(M)， 色氨酸(W)，苯丙氨酸(F)和脯氨酸⑵。中性氨基酸組包括甘氨酸(G)，絲氨酸(S)，蘇氨酸(T)，半胱氨酸(C)，酪氨酸(Y)， 天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)。酸性氨基酸組包括天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)。堿性氨基酸組包括賴氨酸(K)，組氨酸(H)和精氨酸(R)。在(g)中所述的“嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件”的實例包括以下條件，在該條件下，在根據(jù)例 如，Sambrook J.，F(xiàn)risch E. F.，Maniatis T.，分子克隆第二版，冷泉港實驗室出版社 (Molecular Cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratorypress)中所述白勺常 規(guī)方法進行的雜交中，在45°C下在含有6 X SSC (含有1.5m NaCl和0. 15m檸檬酸鈉的溶液 是10XSSC)的溶液中形成雜交物，并且然后將該雜交物用2XSSC在50°C下洗滌(分子生 物學(xué)(MolecularBiology), John Wiley 和 Sons，紐約(1989) ,6. 3. 1-6. 3. 6) 洗滌步驟中 的鹽濃度可選自從2XSSC(低嚴(yán)謹(jǐn)度條件)至0.2XSSC(高嚴(yán)謹(jǐn)度條件)的條件。洗滌步 驟中的溫度可選自，例如，從室溫(低嚴(yán)謹(jǐn)度條件)至65°C (高嚴(yán)謹(jǐn)度條件)的條件?？蛇x 地，鹽濃度和溫度兩者都可改變。具有(h)中所述的氨基酸序列的蛋白表示存在于棉蚜中的膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶，是昆 蟲膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的一種，并且包括含有(a)中所述的氨基酸序列的蛋白。盡管B組的氨基酸序列包括(c)中所述的氨基酸序列，其具有與SEQ IDNO 1的氨 基酸序列具有50%或更高的序列同一性，并具有膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性，但可優(yōu)選地使用具 有膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性并與SEQ ID NO :1的氨基酸序列具有至少55、60、65、70、75或80% 的序列同一性的氨基酸序列，并且可高度優(yōu)選具有具有膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性并與SEQ ID NO 1的氨基酸序列具有至少85、90或95%的序列同一性的氨基酸序列。盡管B組的氨基酸序列也包括(d)中所述的氨基酸序列，其與SEQ IDNO 1的氨基酸序列具有75%或更高的序列相似性，并具有膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性，但可優(yōu)選地使用具有 膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性并與SEQ ID NO :1的氨基酸序列具有至少80%的序列相似性的氨基 酸序列，并且可高度優(yōu)選具有膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性并與SEQ ID NO :1的氨基酸序列具有至 少85、90或95%的序列相似性的氨基酸序列。具有在B組中所示的氨基酸序列的蛋白可以按照下文所述的方法、使用編碼在B 組中所示的氨基酸序列的多核苷酸進行制備。
昆蟲膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶可以用作提供評價殺蟲活性的指示劑的試劑。具體地，例如， 昆蟲膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶可以通過用作在使用膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶測定殺蟲能力的方法中使用的 膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶而用作提供評價殺蟲活性的指示劑的試劑。另外，更具體的方法可以根據(jù) 前文所述的測量膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性的方法而進行。另外，當(dāng)昆蟲膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶用作提供評價殺蟲活性的指示劑的試劑時，優(yōu)選地， 昆蟲膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶是具有選自B組的氨基酸序列的膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶。具有編碼在B組中所示的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸(以下，在一些情 形中叫作多核苷酸B組)具有這樣的核苷酸序列，在生物體的細(xì)胞中或體外翻譯系統(tǒng)中可 以從該核苷酸序列產(chǎn)生具有B組中所示的氨基酸序列的蛋白。多核苷酸B組可以是從自然 界克隆的DNA，例如通過定點誘變或隨機誘變向從自然界克隆的DNA中引入核苷酸的缺失、 替代或添加的DNA，或人工合成的DNA。具體地，實例包括包含SEQ ID NO 2的核苷酸序列 的多核苷酸。<第一種獲得方法>例如，將在下文中顯示獲得包括SEQ ID NO :3的核苷酸序列的多核苷酸的方法。該 多核苷酸含有包括SEQ ID NO :2的核苷酸序列的多核苷酸，并包括在多核苷酸B組中。該 方法包括從棉蚜獲得總RNA，從該RNA合成cDNA文庫，并且進行PCR擴增以獲得目的多核苷酸。將在盆栽黃瓜的葉片上養(yǎng)殖的一群棉蚜(Aphis gossypii)的成蟲和幼蟲用小刷 子從葉片表面刮下，并且將630mg得到的群體用研缽和研棒在液氮中壓成粉末。從得到的 冷凍壓碎的粉末中使用RNA提取試劑ISOGEN(由日本基因(Nippon Gene)制造)按下述分 離RNA。在將IOml ISOGEN加入到研缽中的冷凍壓碎的粉末中后，將所述壓碎的粉末保持在 冰上碾磨10分鐘。碾磨后，將流體樣品用移液管轉(zhuǎn)移到15ml試管中，并且向其中加入2ml 氯仿(由Wako純化學(xué)工業(yè)有限公司(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)制造)。立即 將混合物用力振蕩15秒，然后在室溫靜置3分鐘。然后，將得到的混合物在4°C以12，OOOxg 離心15分鐘，并且將每個5ml水層轉(zhuǎn)移到兩個新管中。在將5ml ISOGEN加入到各管中后， 將混合物立即用力振蕩15秒，并且然后在室溫靜置3分鐘。然后，將得到的混合物在4°C以 12，OOOxg離心15分鐘，并且將各個IOml水層分別轉(zhuǎn)移到新的50ml管中。隨后，將IOml異 丙醇(由Wako純化學(xué)工業(yè)有限公司制造)加入到各管中，并且將混合物在冰上放置30分 鐘。將得到的混合物在4°C以12，OOOxg離心10分鐘以沉淀RNA。去除上清后，向剩余物中 加入20ml 70%乙醇。將得到的混合物在4°C以10，OOOxg離心5分鐘。去除上清后，將總 RNA的沉淀稍微干燥，并且然后溶解在Iml市售的不含RNA酶的水(Nacalai Tesque公司) 中。在260nm測量制備的總RNA的吸光度，以根據(jù)常規(guī)方法計算濃度。應(yīng)用通過上述方法獲得的棉蚜總RNA作為模板，并且根據(jù)試劑附帶的手冊使用隨機引物(由 Invitrogen 制造)和 superscript III (由 Invitrogen 制造)進行 RT-PCR，以 合成第一鏈cDNA。應(yīng)用通過上述方法獲得的棉蚜cDNA文庫作為模板，并且根據(jù)試劑附帶的手冊使 用包括SEQ ID NO 4的核苷酸序列的寡核苷酸引物和包括SEQID NO 5的核苷酸序列的寡 核苷酸引物以及Pfu Ultra HF Taq聚合酶(由Stratagene制造)進行PCR。PCR的條件 如下在94°C起始變性10分鐘；然后是35個PCR循環(huán)，一個循環(huán)為94°C 20秒，53°C 20秒， 和72°C 3分鐘；接著在72°C 7分鐘。如上文所述，可以獲得包括SEQ ID NO 3的核苷酸序列的多核苷酸。 〈第二種獲得方法〉在多核苷酸B組中所示的多核苷酸還可以通過制備具有由利用琥珀突變的方法 引入的突變的多核苷酸而獲得，所述方法為上文提及的定點誘變，為一種使用包括SEQ ID NO :2或3的核苷酸序列的多核苷酸作為模板通過使用用于引入突變等的引物的PCR方法?！吹谌N獲得方法〉還可以通過使用包括SEQ ID NO :2或3的核苷酸序列的多核苷酸作為探針的雜交 方法而獲得在多核苷酸B組中所示的多核苷酸。更具體地，第三種獲得方法可以根據(jù)在前 文提及的由冷泉港實驗出版社出版的Sambrook J.，F(xiàn)risch E. F.，Maniatis T.，分子克隆 第二版中所述的常規(guī)雜交而進行?！吹谒姆N獲得方法〉可選地，在多核苷酸B組中所示的多核苷酸還可以通過基于已知的昆蟲膽堿乙酰 轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列制備引物并且進行PCR而獲得。為了從其它昆蟲物種如德國蟑螂(德 國小蠊(Blatella germanica))分離膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的同源物，應(yīng)用Codehop程序(在 由Fred Hutchinson癌癥研究中心內(nèi)運行的Blocks蛋白質(zhì)分析服務(wù)器(Blocks Protein Analysis Server)的網(wǎng)站 http://blocks. fhcrc. org/blocks/codehop. html 上可公共地 獲得)，并且基于前文提及的棉蚜膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的序列和先前已知的來自諸如黑腹 果蠅(NCBI登記號P07668)，秀麗線蟲(P32756)和R比亞按蚊(XP_312586)的氨基酸序列， 設(shè)計簡并引物。選擇的昆蟲物種的膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的同源物的部分序列通過一系列PCR擴 ±曾，所述PCR使用來源于昆蟲物種的第一鏈cDNA作為模板。在此處，所述作為模板的第一鏈 cDNA通過前文提及的方法使用SuperscriptIII制備。PCR擴增使用作為正向引物和反向 引物的一組簡并引物以及Amplitaq Gold(由應(yīng)用生物系統(tǒng)(Applied Biosystems)制造) 根據(jù)所述試劑附帶的生產(chǎn)廠商的方法而進行。PCR條件為進行遞降PCR的那些條件，如下 在94°C起始變性10分鐘；然后是10個遞降-PCR循環(huán)，一個循環(huán)為94°C 30秒，60°C 1分 鐘，每個循環(huán)降低1°C，和72°C 1分30秒；接著是25個PCR循環(huán)，一個循環(huán)為94°C 30秒， 50 0C 1分鐘和72 °C 1分30秒；并且接著在72 °C 7分鐘。PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進行 分析和純化，以獲得目的DNA。此外，將獲得的DNA克隆到pCR4-T0P0載體(由Invitrogen 制造)中，并且測序。然后，設(shè)計對所得到的膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的昆蟲同源物的部分序列特異的引 物，并且進行3’RACE PCR或5’RACE PCR，以獲得所述基因的全長序列。3’RACE PCR這樣進 行，即，應(yīng)用從昆蟲總RNA制備的第一鏈cDNA作為模板，并且使用SMART PCR cDNA合成試劑盒(由Clontech制造)根據(jù)所述試劑盒附帶的生產(chǎn)廠商指導(dǎo)說明書而進行。5’ RACE PCR 這樣進行，即，應(yīng)用從昆蟲總RNA制備的第一鏈cDNA作為模板，并且使用第二代5’/3’RACE 試劑盒(由羅氏(Roche)制造)根據(jù)所述試劑盒附帶的生產(chǎn)廠商指導(dǎo)說明書而進行。
在3，RACE反應(yīng)中，對目的序列特異的正向引物與SMART PCR cDNA合成試劑盒中 包含的通用引物混合物(UPM)組合使用。PCR條件為進行遞降PCR的那些條件，如下在 94°C起始變性10分鐘；然后是10個遞降-PCR循環(huán)，一個循環(huán)為94°C 20秒，60°C 20秒，每 個循環(huán)降低1°C，和72°C 2分鐘；接著是25個PCR循環(huán)，一個循環(huán)為94°C 20秒，50°C 20秒 和72°C 3分鐘；并且接著在72°C 7分鐘。得到的PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分析和 純化，以獲得目的DNA。此外，將獲得的DNA克隆到pCR4-T0P0載體(由Invitrogen制造) 中，并且測序。當(dāng)通過第一輪PCR沒有獲得明顯的擴增產(chǎn)物時，使用第一輪PCR產(chǎn)物作為模板進 行嵌套式PCR。被設(shè)計成與第一輪PCR產(chǎn)物的內(nèi)部序列結(jié)合的特異性正向引物與作為反向 引物的SMART PCR cDNA合成試劑盒中包含的NUP引物組合用作引物。PCR條件如下在 95°C起始變性10分鐘；然后是35個PCR循環(huán)，一個循環(huán)為95°C 20秒，50°C 20秒，和72°C 3 分鐘；接著是72°C 7分鐘。得到的PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分析和純化，以獲得目 的DNA。此外，將獲得的DNA克隆到pCR4-T0P0載體(由Invitrogen制造)中，并且測序。在5’ RACE反應(yīng)中，對目的序列特異的反向引物與作為正向引物的第二代 5，/3，RACE 試劑盒中包含的 01 igo-d (T)-錨定引物 1 (Oligo-d (T)-anchorprimerl)組合 使用。PCR條件為進行遞降PCR的那些條件，如下在94°C起始變性10分鐘；然后是10個 遞降-PCR循環(huán)，一個循環(huán)為94°C 30秒，58°C 30秒，每個循環(huán)降低1°C，和72 °C 2分鐘；接 著是25個PCR循環(huán)，一個循環(huán)為94°C 30秒，48°C 1分鐘和72°C 2分鐘；并且接著在72°C 7 分鐘。得到的PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分析和純化，以獲得目的DNA。此外，將獲 得的DNA克隆到pCR4-T0P0載體(由Invitrogen制造)中，并且測序。當(dāng)通過第一輪PCR沒有獲得明顯的擴增產(chǎn)物時，使用第一輪PCR產(chǎn)物作為模板進 行嵌套式PCR。被設(shè)計成與第一輪PCR產(chǎn)物的內(nèi)部序列結(jié)合的特異性反向引物與作為正 向引物的第二代5’ /3’ RACE試劑盒中包含的PCR錨定引物(anchor primer)組合用作引 物。PCR條件如下在94°C起始變性10分鐘；然后是10個PCR循環(huán)，一個循環(huán)為94°C 15 秒，550C 30秒，和72°C 40秒；接著是25個PCR循環(huán)，一個循環(huán)為94°C 15秒，55°C 30秒， 和72°C 40秒，每個循環(huán)延伸20秒；接著是72°C 7分鐘。得到的PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠 電泳進行分析和純化，以獲得目的DNA。此外，將獲得的DNA克隆到pCR4-T0P0載體(由 Invitrogen制造)中，并且測序。上述測序結(jié)果顯示5’ -端序列和3’ -端序列，其每一端分別編碼昆蟲膽堿乙酰轉(zhuǎn) 移酶的N-端區(qū)域和C-端區(qū)域。因此，在多核苷酸B組中所示的多核苷酸可以通過基于已知的昆蟲膽堿乙酰轉(zhuǎn)移 酶的氨基酸序列制備引物、通過PCR而獲得。包括與多核苷酸B組的核苷酸序列互補的核苷酸序列的多核苷酸可以用來應(yīng)用 雜交方法獲得在多核苷酸B組中所示的多核苷酸。本發(fā)明中的獲得方法包括通過雜交檢測所需多核苷酸的步驟，鑒定檢測到的所需 多核苷酸的步驟，和回收所鑒定的所需多核苷酸的步驟。各步驟將在下文中具體地解釋。
通過雜交檢測所需多核苷酸的步驟和鑒定檢測到的所需多核苷酸的步驟可以 這樣進行，即，通過使用具有與多核苷酸B組的核苷酸序列互補的核苷酸序列的多核 苷酸作為探針，根據(jù)例如記述在“分子克隆實驗室手冊第二版(Molecular Cloning A Laboratory Manual 2nd edition) ”(1989)，冷泉港實驗室出版社，“當(dāng)代分子生物學(xué) 方法(Current Protocols InMolecular Biology)，，(1987)，John Wiley 禾口 Sons 公司 ISBN0-471-50338-X等中的方法進行。具體地，例如，將包括與SEQ ID NO 2的核苷酸序列互補的核苷酸序列的DNA通 過已知的方法用放射性同位素標(biāo)記標(biāo)記或熒光標(biāo)記，其使用隨機引發(fā)的DNA標(biāo)記試劑盒 (Random Primed DNA Labelling Kit，由 Boehringer 制造)、隨機引物 DNA 標(biāo)記試劑盒第 2 版(由TAKARA SHUZO有限公司制造)、ECL直接核酸標(biāo)記和檢測系統(tǒng)(ECL Direct Nucleic AcidLabelling and Ditection System,由安瑪西亞生物禾斗學(xué)(AmershamBiosciences)制 造)，或Megaprime DNA-標(biāo)記系統(tǒng)(由安瑪西亞生物科學(xué)(Amersham Biosciences)制造) 進行標(biāo)記，并且這可以用作探針。用于雜交的條件的實例包括嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件，并且具體地，實例包括這樣的條件，即， 在所述條件下，在65°C在存在6X SSC(0. 9M NaCl, 0. 09M檸檬酸鈉)、5XDenhart，s雜交溶 液(0. 1% (w/v)菲克(Ficoll)400，0. 1% (w/v)聚乙烯吡咯烷酮，0. 1% BSA),0. 5% (w/v) SDS和100 μ g/ml變性的鮭魚精子DNA的條件下，或者在含有100 μ g/ml變性的鮭魚精子 DNA 的 DIG 便易雜交溶液(DIG EASY Hby solution, Boehringer Mamnnheim)中進行孵育， 然后，在室溫下在存在1XSSC(0. 15m NaCl,0. 015m檸檬酸鈉)和0. 5% SDS的條件下進行 孵育兩次，持續(xù)15分鐘，并且此外，在68°C在存在0. IX SSC (0.015m NaCl, 0. 0015m檸檬酸 鈉)和0. 5% SDS的條件下進行孵育持續(xù)30分鐘。更具體地，例如，可以通過應(yīng)用包括與多核苷酸B組的核苷酸序列互補的核苷酸 序列的多核苷酸作為模板，使用Megaprime DNA-標(biāo)記系統(tǒng)(由安瑪西亞法瑪西亞生物技術(shù) (Amersham Pharmacia Biotech)制造)并且使用在試劑盒中指定的反應(yīng)溶液，而制備用32P 標(biāo)記的探針。使用這一探針根據(jù)照常規(guī)方法進行菌落雜交，在65°C下在存在6XSSC(0. 9M 妝(1，0.0911檸檬酸鈉)、5\06111^汁，8雜交溶液(0. 1% (w/v)菲克 400，0. (w/v)聚乙 烯吡咯烷酮，0. BSA)、0. 5% (w/v) SDS和100 μ g/ml變性的鮭魚精子DNA的條件下，或 者在含有100 μ g/ml變性的鮭魚精子DNA的DIG便易雜交溶液(DIG EASY Hby solution, Boehringer Mamnnheim)中進行溫育，然后，在室溫下在存在 1 XSSC(0. 15m NaCl,0. 015m 檸檬酸鈉)和0. 5% SDS的條件下進行孵育兩次持續(xù)15分鐘，并且此外，在68°C在存在 0. 1XSSC(0. 015m NaCl，0. 0015m檸檬酸鈉)和0. 5% SDS的條件下進行孵育持續(xù)30分鐘， 由此可以檢測(包含菌落的)雜交的多核苷酸。因此，可以通過雜交檢測所需的多核苷酸， 并且可以鑒定檢測到的所需多核苷酸。對于回收所鑒定的所需 多核苷酸，可以從含有通過前文提及的方法，例如，根據(jù) 如在冷泉港實驗室出版社的“分子克隆實驗室手冊第二版”(1989)中所述的堿法的方 法檢測并且鑒定的多核苷酸的菌落回收質(zhì)粒DNA。所回收的所需多核苷酸(質(zhì)粒DNA)的 核苷酸序列可以通過馬克薩姆吉爾伯特方法(Maxam Gilbert method)(例如，在Maxam， A. M 和 W.Gilbert，美國國家科學(xué)院學(xué)報(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)，74，560，1977 等中 所述)或桑格方法(Sanger method)(例如，在Sanger, F.和A. R. Coulson,分子生物學(xué)雜志(J. Mol. Biol.) ,94,441,1975, Sanger, F.和 Nicklen 和 A. R. Coulson.，美國國家 科學(xué)院學(xué)報(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)，74，5463，1977等中所述)進行驗證。因此，例 如，可以使用市售的Termo測序酶II染料終止子循環(huán)測序試劑盒(由安瑪西亞生物科學(xué) (AmershamBiosciences)制造)、染料終止子循環(huán)測序FS快速反應(yīng)試劑盒(由應(yīng)用生物系 統(tǒng)(Applied Biosystems)制造)等。
包括多核苷酸B組的核苷酸序列的部分核苷酸序列的多核苷酸或包括與所述部 分核苷酸序列互補的核苷酸序列的多核苷酸可以用來使用PCR獲得在多核苷酸B組中所示 的多核苷酸。更具體地，實例包括包含SEQ IDNO :4或5的核苷酸序列的多核苷酸。本發(fā)明 中的獲得方法包括通過PCR擴增所需的多核苷酸的步驟，鑒定所擴增的所需的多核苷酸的 步驟，和回收所鑒定的所需的多核苷酸的步驟。各步驟將在下文中具體解釋。在通過PCR擴增所需的多核苷酸的步驟中，具體地，基于約20bp_約40bp的核苷 酸序列，例如，選自SEQ ID NO 2的核苷酸序列和與SEQ IDNO 2的核苷酸序列互補的序列 的核苷酸序列，從多核苷酸B組的核苷酸序列的部分核苷酸序列或與所述部分核苷酸序列 互補的核苷酸序列設(shè)計并且合成的DNA，可以用作引物對。引物對的實例包括一組包含由 SEQ IDNO :4表示的核苷酸序列的多核苷酸和包含SEQ ID NO :5的核苷酸序列的多核苷酸。 例如，通過將市售的PCR試劑盒指定的反應(yīng)溶液添加到通過前文提及的方法制備的cDNA文 庫中而制備PCR反應(yīng)溶液。反應(yīng)條件可以變化，這取決于要用的引物組，并且例如，可以應(yīng) 用下列條件可使用這樣的條件，即在所述條件下，在94°C孵育10秒后，重復(fù)大約40個循 環(huán)，1個循環(huán)為94°C 15秒，60°C 15秒，和72°C 3分鐘，并且繼續(xù)在72°C進行孵育3分鐘； 可使用這樣的條件，即，在所述條件下，在94°C進行孵育2分鐘，然后在約8°C進行孵育3分 鐘，并且然后重復(fù)大約40個循環(huán)，1個循環(huán)為94°C 30秒，55°C 30秒，和72°C 4分鐘；或者 這樣的條件，即在所述條件下，進行5-10個循環(huán)，1個循環(huán)為94°C孵育5秒，然后72°C 4分 鐘，并且繼續(xù)進行約20-40個循環(huán)，1個循環(huán)為在94°C孵育5秒，然后在70°C 4分鐘。在PCR 中，例如，可以使用PfuUltra高保真度聚合酶(由Stratagene制造)，Amplitaq Gold(由 應(yīng)用生物系統(tǒng)制造)，Takara Heraculase (商標(biāo))(由TAKARA SHUZO有限公司制造)，包 含在優(yōu)勢 cDNA PCR 試劑盒(Advantage cDNA PCR Kit)中的 DNA 聚合酶(由 Clonetech 供應(yīng))，TaKaRa Ex Taq (由TAKARA SHUZO有限公司制備)，PLATINUMTM PCR超級混合物 (PLATINUMTM PCRSUPER Mix，由東方生命技術(shù)(Lifetech Oriental)制造)。通過PCR擴增的所需的多核苷酸的鑒定可以通過瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)冷泉港實 驗室出版社的“分子克隆實驗室手冊第二版”(1989)中所述的方法測量分子量而進行。另 夕卜，關(guān)于所擴增的所需的多核苷酸，使用市售的DNA測序反應(yīng)試劑盒，例如，染料終止子循 環(huán)測序FS快速反應(yīng)試劑盒(由應(yīng)用生物系統(tǒng)制造)，根據(jù)試劑盒附帶的手冊進行測序反應(yīng)， 并且使用DNA測序儀3100 (由應(yīng)用生物系統(tǒng)制造)分析核苷酸，由此，可以讀取擴增片段的 核苷酸序列?；厥账b定的所需的多核苷酸的方法的實例包括根據(jù)冷泉港實驗室出版社的“分 子克隆實驗室手冊第二版”(1989)中所述的方法從瓊脂糖凝膠純化，并且回收通過瓊脂糖 凝膠電泳鑒定的前文提及的多核苷酸的方法。另外，這樣回收的多核苷酸或通過PCR擴增 的所需的多核苷酸可以根據(jù)冷泉港實驗室出版社的“分子克隆實驗室手冊第二版”(1989) 和“當(dāng)代分子生物學(xué)方法”(1987)，John Wiley和Sons公司ISBN0-471-50338-X中所述的常規(guī)方法克隆到載體中。要用的載體實例包括pUCA119(由TAKARASHUZO有限公司制造)， pTVA118N(由 TAKARA SHUZO 有限公司制造)，pBluescriptll (由 Toyobo 有限公司制造)， PCR2. 1-T0P0(由Invitrogen制造)等。另外，克隆的多核苷酸的核苷酸序列可以通過馬 克薩姆吉爾伯特方法(Maxam Gilbert method)(例如，在Maxam，A. M和W. Gilbert，美國 國家科學(xué)院學(xué)報(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)，74，560，1977中所述)或桑格方法(Sanger method)(例如，在 Sanger，F(xiàn).和 A. R. Coulson，分子生物學(xué)雜志(J. Mol. Biol.), 94,441, 1975，Sanger, F. &Nicklen 和 A. R. Coulson.，美國國家科學(xué)院學(xué)報(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)，74，5463，1977中所述)進行驗證。因此，例如，可以使用市售的Termo測序酶II染料 終止子循環(huán)測序試劑盒(由安瑪西亞生物科學(xué)(Amersham Biosciences)制造)、染料終止 子循環(huán)測序FS快速反應(yīng)試劑盒(由應(yīng)用生物系統(tǒng)(Applied Biosystems)制造)等。另外，具有多核苷酸B組的核苷酸序列的部分核苷酸序列的多核苷酸或具有與所述部分核苷酸序列互補的核苷酸序列的多核苷酸可以用來獲得多核苷酸B組中所示的多 核苷酸，其不但使用PCR方法還使用前文提及的雜交方法。更具體地，實例包括包含由SEQ ID NO :4或5表示的核苷酸序列的多核苷酸。制備包括在B組中所示的氨基酸序列的蛋白的方法的實例包括培養(yǎng)其中引入選 自多核苷酸B組的多核苷酸的轉(zhuǎn)化體并且回收所生產(chǎn)的蛋白的方法。另外，為了制備本文 所用的轉(zhuǎn)化體，其是這樣的工作，諸如制備包含這樣的多核苷酸的環(huán)狀多核苷酸，即，在所 述多核苷酸中，選自多核苷酸B組的多核苷酸可操作地與噬菌體啟動子連接。該方法將在 下文詳細(xì)闡述。另外，在使用膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶測定殺蟲活性的方法中使用的A組中顯示的膽堿乙 酰轉(zhuǎn)移酶可通過類似的方法，使用包括編碼膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列的多核苷酸制備 和獲得。噬菌體啟動子意指包含在噬菌體基因組中的基因的啟動子。在它們中，用于表達(dá) 外源基因的噬菌體啟動子的實例包括下列各項的啟動子T7RNA聚合酶基因、T3RNA聚合酶 基因和SP6RNA聚合酶基因。在本發(fā)明中，“可操作地連接”意指將包含目的基因的多核苷酸連接到包含啟動子 序列的多核苷酸的下游，以便目的基因可以在所用的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)中進行轉(zhuǎn)錄。具體地，例如， 當(dāng)使用后面描述的T7RNA聚合酶基因的啟動子時，包含目的基因的多核苷酸可以連接到 T7RNA聚合酶基因啟動子的下游。另外，例如，當(dāng)使用除T7RNA聚合酶基因啟動子之外的啟 動子時，還可以將包含目的基因的多核苷酸連接到包含除T7RNA聚合酶基因啟動子以外的 啟動子序列的多核苷酸的下游。更具體地，例如，當(dāng)使用利用T7RNA聚合酶基因啟動子的質(zhì) 粒pET41a(+) (Novagen)載體時，可以通過將目的基因連接到位于T7 RNA聚合酶基因啟動 子下游的限制酶位點如 NcoI，EcoRV, BamHI，EcoRI，StuI,PstI, SacI，SalI，HindiII，NotI， EagI和Xhol而可操作地連接多核苷酸。在本發(fā)明中，“環(huán)狀多核苷酸”是通過將多核苷酸鏈的末端結(jié)合而成環(huán)狀的多核苷 酸，并且實例包括除了質(zhì)粒DNA、桿粒DNA等以外的許多細(xì)菌的染色體DNA。質(zhì)粒DNA是相對低分子量的環(huán)狀多核苷酸，并且實例包括PET (由Takara Mirus 生物公司制造)和pBluescriptll (由Stratagene制造)，其用于在大腸桿菌(E. coli)中 克隆和表達(dá)。其它實例包括 pFastBacl，pFastBac HT A, pFastBac HT B, pFastBac HT C,pFastBac Dual, pBlueBacII (由 Invitrogen ^ijit)， pAcSG2 (由 Pharmingen ^ijit) ，胃 包含桿狀病毒表達(dá)盒。
桿粒是由BAC (細(xì)菌人工染色體)組成的高分子量DNA，所述BAC包含完整的桿狀 病毒基因組，例如在DHlOBac 大腸桿菌細(xì)胞(invitrogen)中存在的bM0N14272 (136kb)。 桿粒DNA在大腸桿菌細(xì)胞中作為大質(zhì)粒增殖，并且可以包含用于在桿狀病毒啟動子控制下 表達(dá)外源基因的表達(dá)盒。在其中將包含編碼在B組中所示的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸可操作 地連接到噬菌體啟動子上的環(huán)狀多核苷酸具體地為，例如，含有包括與噬菌體T7 RNA聚合 酶啟動子可操作地連接的棉蚜膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的DNA的環(huán)狀多核苷酸，并且例如，可 以根據(jù)下述方法制備并且獲得。使用包含根據(jù)前文提及的方法克隆的包含棉蚜膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的質(zhì)粒DNA 作為模板，使用對所述膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶基因特異的添加了 BamHI限制性位點的引物和對所 述膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶特異的添加了 XhoI限制性位點的引物，通過PCR擴增包含所述膽堿乙 酰轉(zhuǎn)移酶基因的DNA片段。將得到的PCR產(chǎn)物用BamHI和XhoI切割，并且將得到的包含 棉蚜膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的約2. 2kbp DNA片段與預(yù)先用BamHI和XhoI消化的質(zhì)粒載體 pET41a(+)(由Novagen制造)連接。以這種方式獲得的質(zhì)粒是含有包括與噬菌體T7RNA聚 合酶啟動子可操作性連接的棉蚜膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的DNA片段的環(huán)狀多核苷酸的一個 實例。類似地，可以通過將編碼B組所示的氨基酸序列的核苷酸連接到載體中而制備環(huán) 狀多核苷酸。在本發(fā)明中，“復(fù)制起點”是對于自身在宿主細(xì)胞中復(fù)制所必需的特異性DNA序列。 復(fù)制起點的實例包括用于細(xì)菌質(zhì)粒的colEl和Π。轉(zhuǎn)化體是真核細(xì)胞或原核細(xì)胞，所述細(xì)胞已經(jīng)通過向細(xì)胞中引入外源多核苷酸而 被遺傳改變。轉(zhuǎn)化體的實例包括通過將用于基因克隆或基因表達(dá)的質(zhì)粒如PET(Novagen) 或pBluescript II (Stratagene)引入到大腸桿菌中而轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞。另外，將DNA 引入到宿主細(xì)胞中的技術(shù)的實例包括轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法、電穿孔等。其中引入編碼B組所示的氨基酸序列的多核苷酸的轉(zhuǎn)化體的實例包括轉(zhuǎn)化的大 腸桿菌，在其中引入包含與噬菌體T7 RNA聚合酶啟動子可操作地連接的棉蚜膽堿乙酰轉(zhuǎn)移 酶基因的DNA。具體地，所述轉(zhuǎn)化體可以根據(jù)下述方法進行制備。轉(zhuǎn)化體可以這樣制備，即通過根據(jù)在冷泉港實驗室出版社的“分子克隆實驗室手 冊第二版”(1989)中所述的方法，將在BamHI位點和Xho I位點之間插入包含棉蚜膽堿乙 酰轉(zhuǎn)移酶基因的DNA的質(zhì)粒載體pET41a(+) (Novagen)引入到大腸桿菌細(xì)胞中而制備?？?選地，還可以通過根據(jù)大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞(Invitrogen)附帶的手冊所述的方 法，通過用前文提及的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌而制備轉(zhuǎn)化體，在所述質(zhì)粒DNA中插入了包含 噬菌體T7 RNA聚合酶啟動子和棉蚜膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的片段。膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶可以通過培養(yǎng)由前文提及的方法制備的轉(zhuǎn)化體并且回收所生產(chǎn) 的來源于昆蟲的膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶而制備。膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶蛋白可以通過重組大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)。該系統(tǒng)是最常用的 用于高水平生產(chǎn)異源蛋白的原核表達(dá)系統(tǒng)。大腸桿菌是已知的遺傳和生理學(xué)表征最佳的生物體，其易于操作，許多工具是可用的，它能夠非?？焖俚厣L，它在廉價的復(fù)合物或充分-限定的極限培養(yǎng)基上生長，并且它具有極高的合成異源蛋白的能力?？蛇x地，例如，膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶蛋白可以通過重組桿狀病毒/Sf9細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)生 產(chǎn)。這一系統(tǒng)是最有力和通用的可用真核表達(dá)系統(tǒng)之一，并且可以用來表達(dá)來自許多不同 來源的異源基因，所述來源包括真菌、植物、細(xì)菌和病毒。另外，將通過培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體而生產(chǎn)的昆蟲來源的膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶通過諸如超聲、弗 氏壓碎器和Dyno碾碎機的方法進行裂解，并且以包含在細(xì)胞粗提物中的形式回收，并且可 通過使用通常在酶純化中所用的方法諸如離子交換柱層析、反相柱層析、凝膠過濾柱層析 等而獲得純化的蛋白?？蛇x地，當(dāng)設(shè)計來源于昆蟲的膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶以具有His-標(biāo)記的形 式生產(chǎn)時，可以通過特異性識別并且結(jié)合His-標(biāo)記的親和柱層析快速從細(xì)胞粗提物中獲 得純化的蛋白。通過所述方法，可以制備來源于昆蟲的膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶。例如，昆蟲來源的膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶蛋白可以通過培養(yǎng)用含有與噬菌體T7 RNA聚合 酶啟動子可操作地連接的棉蚜膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的DNA片段轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞，并且 用弗氏壓碎器將細(xì)胞碾碎，然后用柱層析純化而制備。更具體地，例如，將通過上述方法制備的重組大腸桿菌在37°C以250rpm旋轉(zhuǎn)培養(yǎng) 過夜，所述重組大腸桿菌含有包含與噬菌體T7 RNA聚合酶啟動子可操作地連接的棉蚜膽堿 乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的DNA片段。第二天早上，將培養(yǎng)物用含有50mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基 以1/100稀釋，并向所述培養(yǎng)物中加入IPTG至終濃度為101^，在221，60印111培養(yǎng)4天以 在大腸桿菌中產(chǎn)生重組的膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶蛋白。將培養(yǎng)物以7，OOOrpm離心10分鐘以收集 大腸桿菌。向收集的大腸桿菌中加入裂解緩沖液(0. IM磷酸鈉緩沖液pH7. 6，1片完全無 EDTA 蛋白酶抑制劑混合物(Complete EDTA-free proteaseinhibitor cocktail) (Roch 制 造))并且混懸。此外，使用弗氏壓碎器(由ThermoSpectronic制造)根據(jù)記述在所附使 用說明書中的方法，將大腸桿菌用l，300psi-l，500psi之間的壓力裂解。將弗氏加壓的溶 液以14，000印111，21離心60分鐘，并且將得到的上清液通過0.45 4111濾器過濾。將樣品注 射到用His緩沖液A (0. IM磷酸鈉緩沖液pH 7. 6，10%甘油)平衡的HiTrap螯合HP (由安 瑪西亞生物科學(xué)制造)柱或HisTrapHP (由安瑪西亞生物科學(xué)制造)柱上。然后，用5個柱 體積的下列緩沖液洗滌柱，在所述緩沖液中，混合95%的His緩沖液A和5%的His緩沖液 B (0. IM磷酸鈉緩沖液pH 7.6，500福咪唑，10%甘油)。接下來，用15個柱體積的混合有 90%的His緩沖液A和10%的His緩沖液B的緩沖液洗滌柱。然后，用15個柱體積的混合 有85%的His緩沖液A和15%的His緩沖液B的緩沖液洗滌柱。然后，用15個柱體積的 混合有80 %的His緩沖液A和20 %的His緩沖液B的緩沖液洗滌柱。此后，制備15個柱 體積的混合有60%的His緩沖液A和40%的His緩沖液B的緩沖液并且注射到柱中。匯 集Iml的洗脫級分等分試樣，并且用SDS-PAGE分析等分試樣，以確定含有115kDa膽堿乙酰 轉(zhuǎn)移酶的級分。這些級分是富含目標(biāo)膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的溶液。包含B組中所示的氨基酸序列的昆蟲膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶可以用作研究工具。例如， 它可以用作進行諸如測定殺蟲能力、篩選具有殺蟲能力的化學(xué)物質(zhì)等的研究的研究工具。 另外，例如，在分析作用于膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的試劑的作用和機制的研究中，膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶 也可以被利用作為研究工具。另外，編碼在B組中所示的氨基酸序列的多核苷酸和具有與它們有互補性的核苷酸序列的多核苷酸，以及編碼在B組中所示的氨基酸序列的多核苷酸的部分核苷酸序列， 或具有與所述部分核苷酸序列有互補性的核苷酸序列的多核苷酸，和符合由SEQ ID NO 4 或5表示的核苷酸序列的多核苷酸，可以用作研究工具。例如，它們中的一部分的作用是用 于如上所述的制備膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的方法中的多核苷酸。另外，部分可以用作重要的研究 工具，用于進行使用PCR獲得在多核苷酸B組中所示的多核苷酸，或者使用雜交獲得在多核 苷酸B組中所示的多核苷酸，如上文所述。特別地，當(dāng)實施殺蟲劑的篩選時，它們可以用作用于進行篩選的實驗的實驗工具。 具體地，它們可以用作在測定殺蟲能力、篩選具有殺蟲能力的化學(xué)物質(zhì)等的實施時進行的 實驗的實驗工具。 此外，本發(fā)明還包括這樣的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括輸入、存儲和管理測試物質(zhì)的能力 的數(shù)據(jù)信息的設(shè)備，其中所述能力是調(diào)節(jié)昆蟲膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性的能力(以下，在一 些情形中，稱為設(shè)備a)，基于所需的標(biāo)準(zhǔn)查詢并且檢索所述數(shù)據(jù)信息的設(shè)備(以下，在一些 情形中，稱為設(shè)備b)，和顯示并且輸出查詢和檢索的結(jié)果的設(shè)備(以下，在一些情形中，稱 為設(shè)備c)(以下，在一些情形中稱為本系統(tǒng))。首先，將解釋設(shè)備a。設(shè)備a意指，當(dāng)輸入關(guān)于測試物質(zhì)具有的調(diào)節(jié)來源于昆蟲的 膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的能力的數(shù)據(jù)信息之后，存儲并且管理所輸入的信息，如上文所述。信 息通過輸入設(shè)備1輸入，并且通常在存儲設(shè)備2中存儲。輸入設(shè)備的實例包括可以輸入信 息的設(shè)備諸如鍵盤和鼠標(biāo)。當(dāng)完成信息的輸入和存儲、管理時，步驟前進至下一種設(shè)備b。 對于存儲、管理所述信息，可以通過使用硬件如計算機、和軟件如OS和數(shù)據(jù)庫管理而輸入 具有數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)的信息，并且將所述信息存儲到適當(dāng)?shù)拇鎯ρb置中，例如計算機可讀記錄介 質(zhì)如軟盤、光磁盤、CD-ROM、DVD-ROM和硬盤，而有效地存儲和管理大量的數(shù)據(jù)。將解釋設(shè)備b。設(shè)備b是一種通過基于獲得需要的結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)的設(shè)備查詢并且檢 索所存儲和管理的數(shù)據(jù)信息的設(shè)備，如上文所述。對于所述信息，當(dāng)將用于查詢和檢索的標(biāo) 準(zhǔn)通過輸入設(shè)備1輸入，并且在通常存儲在存儲設(shè)備2中的信息中選擇符合所述標(biāo)準(zhǔn)的信 息時，步驟前進至下一設(shè)備c。選擇的結(jié)果通常存儲在存儲設(shè)備2中，并且可以進一步通過 顯示輸出設(shè)備3顯示。將解釋設(shè)備c。設(shè)備c是顯示并且輸出查詢和檢索的結(jié)果的設(shè)備，如上文所述。顯 示輸出設(shè)備3的實例包括顯示器、打印機等，并且所述結(jié)果可以在計算機的顯示裝置上顯 示，或者可以通過打印在紙上輸出。實施例下面將通過實施例的方式更詳細(xì)地解釋本發(fā)明，但是本發(fā)明不限于這些具體的實 施例。實施例1 (從棉蚜和德國蟑螂提取總RNA)(1)從棉蚜提取總RNA將在盆栽黃瓜的葉片上養(yǎng)殖的一群棉蚜(Aphis gossypii)的成蟲和幼蟲用小刷 子從葉片表面刮下，并且將630mg得到的群體用研缽和研棒在液氮中壓成粉末。從得到的 冷凍壓碎的粉末中使用RNA提取試劑ISOGEN(由日本基因(Nippon Gene)制造)根據(jù)下述 分離RNA。在將IOml ISOGEN加入到研缽中的冷凍壓碎的粉末中后，將所述壓碎的粉末保持 在冰上碾磨10分鐘。碾磨后，將流體樣品用移液管轉(zhuǎn)移到15ml試管中，并且向其中加入2ml氯仿(由Wako純化學(xué)工業(yè)有限公司(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)制造)。立即 將混合物用力振蕩15秒，然后在室溫靜置3分鐘，然后，將得到的混合物在4°C以12，OOOxg 離心15分鐘，并且將每個5ml水層轉(zhuǎn)移到兩個新管中。在向每一管中加入5ml ISOGEN后， 將混合物立即用力振蕩15秒，并且然后在室溫靜置3分鐘。然后，將得到的混合物在4°C以 12，OOOxg離心15分鐘，并且將每個IOml水層分別轉(zhuǎn)移到新的50ml管中。隨后，將IOml異 丙醇(由Wako純化學(xué)工業(yè)有限公司制造)加入到各管中，并且將混合物在冰上放置30分 鐘。將得到的混合物在4°C以12，OOOxg離心10分鐘以沉淀RNA。去除上清后，向剩余物中 加入20ml 70%乙醇。將得到的混合物在4°C以10，OOOxg離心5分鐘。去除上清后，將總 RNA的沉淀稍微干燥，并且然后溶解在Iml市售的不含RNA酶的水(Nacalai Tesque有限公 司)中。制備的總RNA的濃度(從在260nm的吸光度計算)為6. 9mg/ml。(2)從德國蟑螂提取總RNA提供人工培養(yǎng)的德國蟑螂(德 國小蠊(Blatella germanica))的成蟲、若蟲和卵 囊(oothecae)作為樣品。10只雄性成蟲和10只雌性成蟲(個體，每一只已經(jīng)去除卵囊) 用作1. Ig的成蟲樣品，將10只雄性若蟲和10只雌性若蟲用作1. Og的若蟲樣品，并且將26 只卵囊用作l.Og的卵囊樣品。將這三種樣品使用獨立的研缽和研棒獨立地在液氮中壓成 粉末。從每一份得到的冷凍壓碎的粉末中使用RNA提取試劑ISOGEN(由日本基因(Nippon Gene)制造)根據(jù)下述分離RNA。在將IOml ISOGEN加入到研缽中的冷凍壓碎的粉末中 后，將所述壓碎的粉末保持在冰上碾磨10分鐘。碾磨后，將流體樣品用移液管轉(zhuǎn)移到15ml 試管中，并且向其中加入2ml氯仿(由Wako純化學(xué)工業(yè)有限公司(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)供應(yīng))。立即將混合物用力振蕩15秒，然后在室溫靜置3分鐘。然后， 將得到的混合物在4°C以12，OOOxg離心15分鐘，并且將每5ml水層轉(zhuǎn)移到兩個新管中。在 向每一管中加入5ml ISOGEN后，將混合物立即用力振蕩15秒，并且然后在室溫靜置3分鐘。 然后，將得到的混合物在4°C以12，OOOxg離心15分鐘，并且將每個IOml水層分別轉(zhuǎn)移到新 的50ml管中。隨后，將IOml異丙醇(由Wako純化學(xué)工業(yè)有限公司制造)加入到各管中， 并且將混合物在冰上放置30分鐘。將得到的混合物在4°C以12，OOOxg離心10分鐘以沉淀 RNA。去除上清后，向剩余物中加入20ml 70%乙醇。將得到的混合物在4°C以10，OOOxg離 心5分鐘。去除上清后，將總RNA的沉淀稍微干燥，并且然后溶解在Iml市售的不含RNA酶 的水(Nacalai Tesque公司)中。制備的總RNA的濃度(從在260nm的吸光度計算)在來 源于成蟲的總RNA的情況下為1. lmg/ml，在來源于若蟲的總RNA的情況下為2. 5mg/ml，并 且在來源于卵囊的總RNA的情況下為1. 4mg/ml。實施例2 (分離棉蚜膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶基因)使用來自棉蚜的總RNA，用于RT-PCR的隨機引物(Invitrogen)禾Π Superscript III (Invitrogen)，根據(jù)Superscript III的生產(chǎn)廠商的方法而制備第一鏈cDNA。通過使用包含核苷酸序列SEQ ID NO :4的寡核苷酸和包含核苷酸序列SEQ ID N0:5的寡核苷酸(它們?yōu)閷λ龌蛱禺惖囊?，和Pfu UltraHF Taq聚合酶(由 Stratagene制造)根據(jù)生產(chǎn)廠商的方法進行PCR而擴增棉蚜膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的全長cDNA。 將如上述制備的第一鏈cDNA用作模板。PCR條件如下起始變性在94°C 5分鐘；然后是35 個PCR循環(huán)，一個循環(huán)為94°C 20秒，53°C 20秒，和72°C 3分鐘；接著在72°C 10分鐘。得 到的PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分析和純化以獲得目的DNA。此外，將獲得的DNA克隆到pCR4-T0P0載體(由Invitrogen制造)中，并且測序以確定SEQID NO 3中顯示的 2360bp的核苷酸序列?；谠撔蛄?，編碼棉蚜膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的ORF被鑒定為具有SEQ ID NO :2中顯示的22Ilbp的核苷酸序列。從SEQ ID NO 3的核苷酸序列推定的氨基酸序列為 SEQ ID NO 1的氨基酸序列。實施例3 (分離德國蟑螂膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶基因) 為了從其它昆蟲物種如德國蟑螂(德國小蠊(Blatella germanica))分離膽堿乙 酰轉(zhuǎn)移酶基因的同源物，應(yīng)用Codehop程序(在由Fred Hutchinson癌癥研究中心內(nèi)運行 的 Blocks 蛋白質(zhì)分析月艮務(wù)器(Blocks Protein AnalysisServer)的網(wǎng)站 http://blocks. fhcrc. org/blocks/codehop. html上可公共地獲得)，并且基于前文提及的棉蚜膽堿乙酰 轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列和先前已知的來自諸如黑腹果蠅(NCBI登記號P07668)，秀麗線蟲 (P32756)和岡比亞按蚊(XP_312586)的氨基酸序列，設(shè)計簡并引物。選擇的昆蟲物種的膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的同源物的部分序列通過一系列PCR擴 ±曾，所述PCR使用來源于昆蟲物種的第一鏈cDNA作為模板。在此處，所述作為模板的第一鏈 cDNA通過前文提及的方法使用SuperscriptIII制備。PCR擴增使用作為正向引物和反向 引物的一組簡并引物以及Amplitaq Gold(由應(yīng)用生物系統(tǒng)(Applied Biosystems)制造) 根據(jù)所述試劑附帶的生產(chǎn)廠商的方法而進行。PCR條件為進行遞降PCR的那些條件，如下 在94°C起始變性10分鐘；然后是10個遞降-PCR循環(huán)，一個循環(huán)為94°C 30秒，60°C 1分 鐘，每個循環(huán)降低1°C，和72 °C 1分30秒；接著是25個PCR循環(huán)，一個循環(huán)為94 °C 30秒， 50 0C 1分鐘和72 °C 1分30秒；并且接著在72 °C 7分鐘。PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進行 分析和純化，以獲得目的DNA。此外，將獲得的DNA克隆到pCR4-T0P0載體(由Invitrogen 制造)中，并且測序。因此，獲得德國小蠊膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的部分序列。然后，設(shè)計對所得到的膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的昆蟲同源物的部分序列特異的引 物，并且進行3’RACE PCR或5’RACE PCR，以獲得所述基因的全長序列。3’RACE PCR這樣進 行，即，應(yīng)用從昆蟲總RNA制備的第一鏈cDNA作為模板，并且使用SMART PCR cDNA合成試劑 盒(由Clontech制造)根據(jù)所述試劑盒附帶的生產(chǎn)廠商指導(dǎo)說明書而進行。5’ RACE PCR 這樣進行，即，應(yīng)用從昆蟲總RNA制備的第一鏈cDNA作為模板，并且使用第二代5’/3’RACE 試劑盒(由羅氏(Roche)制造)根據(jù)所述試劑盒附帶的生產(chǎn)廠商指導(dǎo)說明書而進行。在3，RACE反應(yīng)中，對目的序列特異的正向引物與SMART PCR cDNA合成試劑盒中 包含的通用引物混合物(UPM)組合使用。PCR條件為進行遞降PCR的那些條件，如下在 94°C起始變性10分鐘；然后是10個遞降-PCR循環(huán)，一個循環(huán)為94°C 20秒，60°C 20秒，每 個循環(huán)降低1°C，和72°C 2分鐘；接著是25個PCR循環(huán)，一個循環(huán)為94°C 20秒，50°C 20秒 和72°C 3分鐘；并且接著在72°C 7分鐘。得到的PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分析和 純化，以獲得目的DNA。此外，將獲得的DNA克隆到pCR4-T0P0載體(由Invitrogen制造) 中，并且測序。當(dāng)通過第一輪PCR沒有獲得明顯的擴增產(chǎn)物時，使用第一輪PCR產(chǎn)物作為模板進 行嵌套式PCR。被設(shè)計成與第一輪PCR產(chǎn)物的內(nèi)部序列結(jié)合的特異性正向引物與作為反向 引物的SMART PCR cDNA合成試劑盒中包含的NUP引物組合用作引物。PCR條件如下在 95°C起始變性10分鐘；然后是35個PCR循環(huán)，一個循環(huán)為95°C 20秒，50°C 20秒，和72°C 3分鐘；接著是72°C 7分鐘。得到的PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分析和純化，以獲得目 的DNA。此外，將獲得的DNA克隆到pCR4-T0P0載體(由Invitrogen制造)中，并且測序。在5’ RACE反應(yīng)中，對目的序列特異的反向引物與作為正向引物的第二代 5，/3，RACE 試劑盒中包含的 01 igo-d (T)-錨定引物 1 (Oligo-d (T)-anchorprimerl)組合 使用。PCR條件為進行遞降PCR的那些條件，如下在94°C起始變性10分鐘；然后是10個 遞降-PCR循環(huán)，一個循環(huán)為94 °C 30秒，58°C 30秒，每個循環(huán)降低1°C，和72 °C 2分鐘；接 著是25個PCR循環(huán)，一個循環(huán)為94°C 30秒，48°C 1分鐘和72°C 2分鐘；并且接著在72°C 7 分鐘。得到的PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分析和純化，以獲得目的DNA。此外，將獲 得的DNA克隆到pCR4-T0P0載體(由Invitrogen制造)中，并且測序。當(dāng)通過第一輪PCR沒有獲得明顯的擴增產(chǎn)物時，使用第一輪PCR產(chǎn)物作為模板進 行嵌套式PCR。被設(shè)計成與第一輪PCR產(chǎn)物的內(nèi)部序列結(jié)合的特異性反向引物與作為正向 引物的第二代5’ /3’ RACE試劑盒中包含的PCR錨定引物組合用作引物。PCR條件如下在 94°C起始變性10分鐘；然后是10個PCR循環(huán)，一個循環(huán)為94°C 15秒，55°C 30秒，和72°C 40 秒；接著是25個PCR循環(huán)，一個循環(huán)為94°C 15秒，55°C 30秒，和72°C 40秒，每個循環(huán)延伸 20秒；接著是72°C 7分鐘。得到的PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分析和純化，以獲得 目的DNA。此外，將獲得的DNA克隆到pCR4-T0P0載體(由Invitrogen制造)中，并且測 序。上述測序結(jié)果顯示5’ -端序列和3’ -端序列，各自分別編碼昆蟲膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶 的N-端區(qū)域和C-端區(qū)域。實施例4 (構(gòu)建重組質(zhì)粒)使用作為對基因特異的引物的包括SEQ ID NO 4的核苷酸序列的寡核苷酸，和作 為對基因特異的引物的包括SEQ ID NO :5的核苷酸序列的寡核苷酸；和Pfu Ultra HF Taq 聚合酶(由Stratagene制造)，根據(jù)生產(chǎn)廠商的使用說明書的方法，通過PCR擴增膽堿乙酰 轉(zhuǎn)移酶基因片段，該片段將被克隆到用于在大腸桿菌中表達(dá)的載體中。將在實施例2中獲 得的cDNA用作模板。所用的PCR條件如下在94°C起始變性5分鐘；然后是35個PCR循 環(huán)，一個循環(huán)為94°C 20秒，53°C 20秒，和72°C 3分鐘；然后72°C 10分鐘。使用Qiaquick PCR純化試劑盒(由Qiagen制造)根據(jù)試劑盒附帶的使用說明書 純化所得到的PCR產(chǎn)物。將純化后的DNA片段用Bam HI和XhoI消化，因為SEQ ID NO 4 的寡核苷酸含有Bam HI限制性位點，SEQ ID NO 5的寡核苷酸含有Xho I限制性位點。棉蚜膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的Bam HI/XhoI DNA片段通過瓊脂糖凝膠電泳分析，分 離，純化并且連接到大腸桿菌表達(dá)載體pET41a(+)(由Novagen制造)的Bam HI/XhoI克隆 位點。所得到的載體稱為PGBJ005。重組膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶與兩個His-標(biāo)記和一個GST-標(biāo)記一起翻譯提供一種1021 個氨基酸的重組蛋白。在Qiagen質(zhì)粒純化手冊中所述的步驟后，使用Qiafliter質(zhì)粒Maxipr印(Qiagen) 制備 PGBJ005。 實施例5 (制備重組大腸桿菌) 按照生產(chǎn)廠商的使用說明書，使用1 μ 1濃度為 Ing/ μ 1的pGBJ005轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21(DE3)(由Invitrogen制造)的感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化的大腸桿菌克隆在含有50mg/L卡那霉素(由西格瑪(Sigma)制造)的LB瓊脂平板上在37°C生長過夜。實施例6 (在大腸桿菌中表達(dá)膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶)將用pGBJ005轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21 (DE3)在含有50mg/L卡那霉素(由西格瑪制造)的LB-培養(yǎng)基中在37°C，250rpm旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)過夜。第二天早上，將培養(yǎng)物用含有50mg/ L卡那霉素的LB培養(yǎng)基以1/100稀釋，并向所述培養(yǎng)物中加入IPTG至終濃度為ΙΟμΜ，在 22°C，60rpm生長4天以在大腸桿菌中產(chǎn)生重組的膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶蛋白。將所述培養(yǎng)物以 7，OOOrpm離心10分鐘，以收集大腸桿菌。棄掉上清，并且將剩余的大腸桿菌在液氮中快速 冷凍，并且保存在-80°C備用。實施例7 (純化膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶)將棉蚜膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶克隆在pET41a(+)中，pET41a(+)的閱讀框中具有N-端 GST (谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶)-標(biāo)記和His-標(biāo)記和C-端His-標(biāo)記。重組的膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶 蛋白使用His-標(biāo)記純化。(1)制備粗提物將冷凍的誘導(dǎo)的大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞的細(xì)胞沉淀物重懸在30ml裂解緩 沖液(0. IM磷酸鈉緩沖液pH 7. 6，1片完全無EDTA蛋白酶抑制劑混合物(Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail) (Roch 制造))中，并且隨后使用弗氏壓碎器 (由Thermo Spectronic制造)在裂解緩沖液中裂解。在破碎細(xì)胞的步驟期間，壓力保持 在1300-1500psi。將弗氏加壓的溶液在2°C以14，OOOxg離心60分鐘，以收集上清液。將 收集的上清液通過0. 45 μ m過濾器過濾并且保存在冰上。(2)使用His-標(biāo)記純化使用金屬親和層析，使用HiTrap螯合HP (安瑪西亞生物科學(xué))或HisTrap HP (安 瑪西亞生物科學(xué))柱，按照生產(chǎn)廠商(安瑪西亞生物科學(xué))的使用說明書，純化重組蛋白。 對于大規(guī)模純化，使用XK-16/20柱(安瑪西亞生物科學(xué))，該柱用螯合快速流動瓊脂糖(安 瑪西亞生物科學(xué))填充。純化步驟在AEKTA-FPLC(安瑪西亞生物科學(xué))上進行。已經(jīng)根據(jù)生產(chǎn)廠商的試驗方案(安瑪西亞生物科學(xué))制備了 Hitrap，HisTrap, AX-16/20親和柱(安瑪西亞生物科學(xué))。緩沖液A，即結(jié)合緩沖液，由0. IM磷酸鈉緩沖液 PH 7.6和10%甘油制成。緩沖液B，即洗脫緩沖液，由0. IM磷酸鹽緩沖液pH 7.6，500mM咪 唑，和10%甘油制成。使用His-標(biāo)記純化棉蚜膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶根據(jù)下述步驟進行⑴樣品注射；(ii)用5個柱體積(CV)的95%緩沖液A/5%緩沖液B (25mM咪唑)洗掉未結(jié)合的 樣品；(iii)用15個CV的90%緩沖液A/10%緩沖液B (50mM咪唑)洗滌；(iv)用15個CV的85%緩沖液A/15%緩沖液B (75mM咪唑)洗滌；(ν)用15個CV的80%緩沖液A/20%緩沖液B (IOOmM咪唑)洗滌；(vi)用15個CV的60%緩沖液A/40%緩沖液B (200mM咪唑)洗脫純化的蛋白；和(vii)用5個CV 100%緩沖液B(500mM咪唑)洗滌柱。匯集通過用60%緩沖液A/40%緩沖液B洗脫獲得的級分，并且保存在冰上。分析所得到的洗脫級分，以驗證重組的棉蚜膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶蛋白的存在。使用8%的聚丙烯酰胺凝膠用于所表達(dá)的115kDa膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶蛋白的最優(yōu)化凝膠電泳分辨。
將下述染色液和脫色液用于聚丙烯酰胺凝膠的考馬斯染色。染色液由lg/Ι考馬 斯亮藍(lán)R，50 (ν/ν) %甲醇，12 (ν/ν) %乙酸和38 (ν/ν) %蒸餾水制成?；旌虾螅^濾溶液，以 去除未溶解的亮藍(lán)R染料。脫色液由25 (ν/ν) %甲醇，10 (ν/ν) %乙酸和65 (ν/ν) %蒸餾水 制成。對于蛋白質(zhì)印跡分析，將1 500稀釋的抗-His(H15)sC-803兔多克隆IgG抗體 (tebubio)用作一抗。二抗是以1 10000稀釋的山羊-抗-兔-HRP(Pierce)。在通過SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡分析聚丙烯酰胺凝膠后，匯集目的級分，并且確定 蛋白濃度。蛋白濃度通過Bradford方法確定，使用預(yù)先稀釋的蛋白測定標(biāo)準(zhǔn)物(Pierce) 牛血清白蛋白級分V系列，用Bradford Bio-Rad蛋白測定法(Bio-Rad)，按照生產(chǎn)廠商的 方案進行。然后，將匯集的級分分成幾個等分試樣，并且立即在液氮中快速冷凍，并且保存 在-80"C。實施例8 (選擇抑制膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的化合物)調(diào)節(jié)膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的化合物的選擇在用于測量并且評價膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶 的活性的系統(tǒng)中進行，所述活性通過將測試化合物添加到使用在實施例7中制備的棉蚜膽 堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的體外反應(yīng)系統(tǒng)中而被調(diào)節(jié)。至于棉蚜膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的測量，在使用乙酰輔酶A和膽堿作為底物的膽堿 乙酰轉(zhuǎn)移酶的酶促反應(yīng)后，使用5，5’ - 二硫代-雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)試劑測量由膽 堿乙酰轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)形成的游離輔酶A。DTNB與溶液中游離的巰基反應(yīng)以產(chǎn)生5-硫代-2-硝 基苯甲酸(TNB)。TNB是黃色的，并且在412nm處具有最大吸光度。比色測量產(chǎn)生的TNB以 計算膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性。為了測量該活性，當(dāng)包含溶解在DMSO中的測試化合物至10 μ M的終濃度時，測量 蚜蟲膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性。另外，當(dāng)包含DMSO代替測試化合物時，測量蚜蟲膽堿乙酰轉(zhuǎn) 移酶的活性。然后，計算包含溶解在DMSO中的測試化合物時蚜蟲膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的測 定值相對于在包含DMSO代替所述測試化合物時蚜蟲膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的測定值的比率 (%),并且將通過從100%減去所計算的值而得到的值用作抑制程度(％ )。各測試化合物 中的結(jié)果與實施例9的結(jié)果一起顯示在實施例9中的表4中。當(dāng)包含溶解在DMSO中的測試化合物至100 μ Μ，30 μ Μ，10 μ Μ，3 μ Μ，1 μ Μ，0. 3 μ Μ， 0. ΙμΜ或0.03 μΜ中的各個濃度的終濃度時，測量蚜蟲膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性。使用濃 度-依賴性檢測分析軟件XL fit(由idbs制造)，從各測試化合物在各濃度的結(jié)果計算 IC50 ( μ M)。結(jié)果與實施例9的結(jié)果一起顯示在實施例10的表5中。實施例9 (殺蟲活性檢測)制備具有下述組成(表3)的無菌人工飼料。然后，根據(jù)與在昆蟲飼養(yǎng)手冊 (Handbook of Insect Rearing)第 1卷(Elsevier 科學(xué)出版社 1985)第 35-36 頁中所述的 方法相同的方法，不同之處在于將溶解在DMSO中至終濃度50ppM的測試化合物以該人工飼 料的0. 5%體積加入，并且混和各成分，飼養(yǎng)棉蚜。飼養(yǎng)后6天，研究存活的棉蚜數(shù)目，并且 通過用下述方程獲得控制值而將表現(xiàn)出顯著控制值(例如，30%或更大的控制值)的實體 確定為具有殺蟲活性控制值(%) = {1- (Cb X Tai) / (Cai X Tb)} X 100
在所述方程中的字母表示下述含義Cb 在未處理部分中在處理之前存活的蠕蟲數(shù)目Cai 在未處理部分中在觀察時存活的蠕蟲數(shù)目Tb 在處理的部分中在處理之前存活的蠕蟲數(shù)目Tai 在處理的部分中在觀察時存活的蠕蟲數(shù)目結(jié)果與實施例8的結(jié)果一起顯示在實施例9中的表4中。表3 表 4 實施例10 (殺蟲活性檢測)根據(jù)與實施例9的方法相同的方式，進行殺蟲活性檢測，并且結(jié)果與實施例8的結(jié) 果一起顯示在實施例10中的表5中。表5 工業(yè)應(yīng)用性根據(jù)本發(fā)明，能夠提供靶向性更強的篩選農(nóng)業(yè)化學(xué)品的方法，由此針對特定目標(biāo) 篩選化合物，目的在于化學(xué)性地干擾目標(biāo)位點以控制昆蟲或其它害蟲生物體。序列表中的自由文本(free text)SEQ ID NO 4設(shè)計的PCR寡核苷酸引物SEQ ID NO 5設(shè)計的PCR寡核苷酸引物
權(quán)利要求
一種測定測試物質(zhì)的殺蟲活性的方法，包括(1)測量反應(yīng)系統(tǒng)中選自下面A組中的膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性的第一步驟，在所述反應(yīng)系統(tǒng)中所述膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶與測試物質(zhì)接觸；以及(2)基于通過比較在所述第一步驟中測量的活性與對照的活性而獲得的差值，評價所述測試物質(zhì)的殺蟲活性的第二步驟<A組>(a)包括SEQ ID NO1的氨基酸序列的蛋白；(b)包括SEQ ID NO1的氨基酸序列中缺失、添加或置換一個或多個氨基酸的氨基酸序列的蛋白，其中所述蛋白具有膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性；(c)包括與SEQ ID NO1的氨基酸序列具有50％或更高的序列同一性的氨基酸序列的蛋白，其中所述蛋白具有膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性；(d)包括與SEQ ID NO1的氨基酸序列具有75％或更高的序列相似性的氨基酸序列的蛋白，其中所述蛋白具有膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性；(e)包括由SEQ ID NO2或3的核苷酸序列編碼的氨基酸序列的蛋白；(f)包括由與SEQ ID NO2或3的核苷酸序列具有50％或更多的序列同一性的核苷酸序列編碼的氨基酸序列的蛋白，其中所述蛋白具有膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性；(g)包括由多核苷酸編碼的氨基酸序列的蛋白，其中所述多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下與包括與SEQ ID NO2或3的核苷酸序列互補的核苷酸序列的多核苷酸雜交，并且其中所述蛋白具有膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性；(h)包括昆蟲膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列的蛋白；以及(i)包括棉蚜膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列的蛋白。
2.一種篩選殺蟲物質(zhì)的方法，包括選擇具有由權(quán)利要求1所述的方法評價的所述殺蟲 活性的物質(zhì)。
3.—種殺蟲劑，包括通過權(quán)利要求2所述的方法選擇的物質(zhì)或其農(nóng)業(yè)上可接受的鹽作 為活性成分。
4.一種調(diào)節(jié)害蟲的生理狀況的試劑，其中所述試劑具有調(diào)節(jié)昆蟲膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的活 性的能力。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑，其中所述膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶是棉蚜膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑，其中所述試劑是殺蟲劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑，其中所述調(diào)節(jié)昆蟲膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性的能力是抑 制所述昆蟲膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶與乙酰輔酶A和膽堿的反應(yīng)的能力。
8.—種殺蟲劑，包括具有調(diào)節(jié)昆蟲膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性的能力的物質(zhì)或所述物質(zhì)的 農(nóng)業(yè)上可接受的鹽作為活性成分。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的殺蟲劑，其中所述物質(zhì)具有抑制所述昆蟲膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶與 乙酰輔酶A和膽堿的反應(yīng)的能力。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的殺蟲劑，其中所述物質(zhì)具有在無細(xì)胞系統(tǒng)中抑制所述昆蟲 膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶與乙酰輔酶A和膽堿的反應(yīng)的能力，其中在10 μ M或更多的所述物質(zhì)的存 在下，所述膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性低于不存在所述物質(zhì)時的活性。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的殺蟲劑，其中所述物質(zhì)具有在無細(xì)胞系統(tǒng)中以ΙΟΟμΜ或更小的IC5tl抑制所述昆蟲膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶與乙酰輔酶A和膽堿的反應(yīng)的能力。
12.—種控制害蟲的方法，包括向害蟲、所述害蟲的棲息地或要保護免受所述害蟲傷害 的植物施用有效量的權(quán)利要求3、8、9、10或11所述的殺蟲劑。
13.—種控制害蟲的方法，包括鑒定具有由權(quán)利要求1所述的方法評價的所述殺蟲活性的物質(zhì)，以及 將所述害蟲與所述鑒定的殺蟲物質(zhì)接觸。
14.一種昆蟲膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶，包括選自下列B組的氨基酸序列 〈B組〉(a)SEQ ID NO 1的氨基酸序列；(b)SEQID NO :1的氨基酸序列中缺失、添加或置換一個或多個氨基酸的氨基酸序列， 其中所述氨基酸序列具有膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性；(c)與SEQID NO :1的氨基酸序列具有50%或更高的序列同一性的氨基酸序列，其中 所述氨基酸序列具有膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性；(d)與SEQID NO :1的氨基酸序列具有75%或更高的序列相似性的氨基酸序列，其中 所述氨基酸序列具有膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性；(e)由SEQID NO :2或3的核苷酸序列編碼的氨基酸序列；(f)由與SEQID NO :2或3的核苷酸序列具有50%或更多的序列同一性的核苷酸序列 編碼的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性；(g)由多核苷酸編碼的氨基酸序列，其中所述多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下與包括與SEQ ID NO :2或3的核苷酸序列互補的核苷酸序列的多核苷酸雜交，其中所述氨基酸序列具有 膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性；和(h)棉蚜膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列。
15.昆蟲膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶作為提供評價殺蟲活性的指標(biāo)的試劑的應(yīng)用。
16.權(quán)利要求14所述的昆蟲膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶作為提供評價殺蟲活性的指標(biāo)的試劑的應(yīng)用。
17.一種多核苷酸，包括編碼權(quán)利要求14所述的膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列的核苷 酸序列。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的多核苷酸，包括SEQID NO :2或3的核苷酸序列。
19.一種多核苷酸，包括與權(quán)利要17或18所述的多核苷酸的核苷酸序列互補的核苷酸 序列。
20.一種多核苷酸，包括權(quán)利要求17或18所述的多核苷酸的部分核苷酸序列；或 與所述部分核苷酸序列互補的核苷酸序列。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的多核苷酸，包括SEQID NO :4或5的核苷酸序列。
22.—種獲得包括編碼膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的方 法，包括使用權(quán)利要求20或21所述的多核苷酸作為引物，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增所需多核 苷酸；鑒定擴增的所需多核苷酸；以及回收所述鑒定的多核苷酸。
23.一種獲得包括編碼膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的方 法，包括使用權(quán)利要求19、20或21所述的多核苷酸作為探針，通過雜交檢測所需多核苷酸； 鑒定檢測到的所需多核苷酸；以及 回收所述鑒定的多核苷酸。
24.一種環(huán)狀多核苷酸，包括權(quán)利要求17或18所述的多核苷酸的核苷酸序列，其中所 述核苷酸序列可操作地連接于噬菌體啟動子。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的環(huán)狀多核苷酸，其中所述啟動子為T7RNA聚合酶基因啟動子。
26.根據(jù)權(quán)利要求24或25所述的環(huán)狀多核苷酸，其中所述多核苷酸包括用于在宿主細(xì) 胞中自主復(fù)制的復(fù)制起點。
27.—種產(chǎn)生環(huán)狀多核苷酸的方法，包括將權(quán)利要求17或18所述的多核苷酸連接到載 體中。
28.一種轉(zhuǎn)化體，其中導(dǎo)入了權(quán)利要求17或18所述的多核苷酸。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的轉(zhuǎn)化體，其中所述轉(zhuǎn)化體是轉(zhuǎn)化的大腸桿菌(E.coli)。
30.一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)化體的方法，包括將權(quán)利要求17或18所述的多核苷酸導(dǎo)入至宿主細(xì)胞中。
31.一種產(chǎn)生膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的方法，包括培養(yǎng)權(quán)利要求28或29所述的轉(zhuǎn)化體以及回 收產(chǎn)生的膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的步驟。
32.權(quán)利要求14所述的膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶或權(quán)利要求17-21中任意一項所述的多核苷酸 作為研究工具的應(yīng)用。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的應(yīng)用，其中所述研究工具是用于篩選殺蟲物質(zhì)的實驗工具。
34.一種系統(tǒng)，包括輸入、儲存和管理關(guān)于測試物質(zhì)的能力的數(shù)據(jù)信息的裝置，其中所述的能力是調(diào)節(jié)昆 蟲膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性的能力；基于所需的標(biāo)準(zhǔn)查詢和檢索所述數(shù)據(jù)信息的裝置；和顯示和輸出查詢和檢索的結(jié)果的裝置。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種調(diào)節(jié)害蟲的生理狀況的試劑，其中所述試劑具有調(diào)節(jié)昆蟲膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性的能力；一種測定測試物質(zhì)的殺蟲活性的方法，該方法包括測量反應(yīng)系統(tǒng)中膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性，在該反應(yīng)系統(tǒng)中膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶與被測物質(zhì)接觸，等等。
文檔編號G01N33/50GK101868725SQ20088011684
公開日2010年10月20日 申請日期2008年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月22日
發(fā)明者伯特·德梅, 大槻純子, 安內(nèi)利斯·羅布羅卡, 蓋伊·尼斯, 馬克·范·德·克雷恩 申請人:住友化學(xué)株式會社